一种3-氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610363662.4 (22)申请日 2016.05.27 (71)申请人 三峡大学 地址 443002 湖北省宜昌市大学路8号 (72)发明人 汪鋆植张盼闫喜明黄年玉 余海立佘欣欣邓改改苟保灵 贺海波李湜 (74)专利代理机构 宜昌市三峡专利事务所 42103 代理人 彭永念 (51)Int.Cl. C07J 9/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 43/

2、00(2006.01) (54)发明名称 一种3-氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种3-氢化松苓酸氰乙酯类 药物及其应用。 该类药物中含有以下结构式的化 合物：还包括药 学上可接受的盐， 3-氢化松苓酸氰乙酯及其衍生 物药学上可接受的盐， 以及药学上可接受的辅料 或载体。 3-氢化松苓酸氰乙酯是PI3K/mTOR双重 抑制剂， 本发明还涉及3-氢化松苓酸氰乙酯类药 物在促进细胞自噬中的用途； 以及在制备治疗胃 癌、 肝癌、 肺癌、 前列腺癌、 鼻咽癌等肿瘤、 阿尔茨 海默氏病等神经退行性病变、 糖尿病药物中的应 用。 本发明中的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物为临 床提供

3、了一种新的用药选择。 权利要求书1页 说明书18页 附图4页 CN 105949262 A 2016.09.21 CN 105949262 A 1.一种3-氢化松苓酸氰乙酯类药物， 其特征在于， 该类药物中含有以下结构式的化合 物： 。 2.根据权利要求1所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物， 其特征在于： 该类类药物还包括 药学上可接受的盐， 3-氢化松苓酸氰乙酯及其衍生物药学上可接受的盐， 以及药学上可接 受的辅料或载体。 3.根据权利要求1所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物， 其特征在于： 3-氢化松苓酸氰乙 酯的合成方法为： 1)在反应瓶中加入等摩尔的3-氢化松苓酸B、 溴乙腈、 碳酸钾，

4、并加入适量乙腈作为溶 剂， 在85搅拌反应2h， TCL检测反应完成后， 旋干溶剂， 加入水和乙酸乙酯， 分离萃取三次， 回收乙酸乙酯， 得固体物； 2)将固体物固法上样， 200-300目正相硅胶柱层析分离， 以石油醚 乙酸乙酯15 1(体 积比)为流动相， 得白色固体粉末为3-氢化松苓酸氰乙酯。 4.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在促进细胞自噬中的 用途。 5.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在促进细胞自噬中的 用途， 其特征在于： 3-氢化松苓酸氰乙酯是PI3K/mTOR双重抑制剂。 6.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸

5、氰乙酯类药物在制备治疗胃癌、 肝 癌、 肺癌、 前列腺癌或鼻咽癌药物方面的应用。 7.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗神经退行 性病变药物方面的应用。 8.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗阿尔茨海 默氏病药物方面的应用。 9.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗糖尿病药 物方面的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105949262 A 2 一种3-氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用 技术领域 0001 本发明涉及3-氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用， 其作为PI3K/mTOR双重抑制剂 对

6、促进细胞自噬能够产生药理作用， 可将3-氢化松苓酸氰乙酯类药物用于制备治疗胃癌等 癌症、 阿尔茨海默氏病类神经退性行病变或糖尿病的药物上。 背景技术 0002 3-氢化松苓酸氰乙酯是以三氢化松苓酸B的原料进行合成的酯类化合物， 现有技 术的缺陷是三氢化松苓酸B的纯化以及3-氢化松苓酸氰乙酯的分离纯化工艺。 发明内容 0003 本发明的目的提供一种3-氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用。 0004 为解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案是： 一种3-氢化松苓酸氰乙酯类 药物， 该类药物中含有以下结构式的化合物： 0005 0006 该类药物还包括药学上可接受的盐， 3-氢化松苓酸氰乙酯及其衍生

7、物药学上可接 受的盐， 以及药学上可接受的辅料或载体。 0007 其中， 3-氢化松苓酸氰乙酯的合成方法为： 0008 1)在反应瓶中加入等摩尔的3-氢化松苓酸B、 溴乙腈、 碳酸钾， 并加入适量乙腈作 为溶剂， 在85搅拌反应2h， TCL检测反应完成后， 旋干溶剂， 加入水和乙酸乙酯， 分离萃取 三次， 回收乙酸乙酯， 得固体物； 0009 2)将固体物固法上样， 200-300目正相硅胶柱层析分离， 以石油醚： 乙酸乙酯15: 1(体积比)为流动相， 得白色固体粉末为3-氢化松苓酸氰乙酯。 其反应式如下。 0010 0011 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在促进细胞自噬中的

8、用途。 0012 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在促进细胞自噬中的用途， 其特 征在于： 3-氢化松苓酸氰乙酯是PI3K/mTOR双重抑制剂。 说明书 1/18 页 3 CN 105949262 A 3 0013 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗胃癌、 肝癌、 肺癌、 前 列腺癌、 鼻咽癌等肿瘤药物方面的应用。 0014 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗神经退行性病变药 物方面的应用。 0015 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗阿尔茨海默氏病药 物方面的应用。 0016 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物

9、在制备治疗糖尿病药物方面的 应用。 附图说明 0017 图1为3-氢化松苓酸氰乙酯结构鉴定氢谱图。 0018图2为3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27的细胞凋亡的影响(n3，)， 其中A:对照 组； B： 3-氢化松苓酸氰乙酯(10 M)； C： 3-氢化松苓酸氰乙酯(20 M)； D： 3-氢化松苓酸氰乙酯 (40 M)。 0019 图3为透射电镜检测3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27细胞自噬的影响， 其中a： 对照 组(6000)， b/c： 自噬泡(6000)， d:自噬体亚显微结构(15000)。 0020图4为3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27的细胞自噬比例的影响(n3，)， 其中A:

10、 对照组； B： 3-氢化松苓酸氰乙酯(10 M)； C： 3-氢化松苓酸氰乙酯(20 M)； D： 3-氢化松苓酸氰 乙酯(40 M)。 0021 图5为3-氢化松苓酸氰乙酯和mTOR的分子对接结果图。 具体实施方式 0022 下面结合附图1-5、 实施例及表格， 进一步阐明本发明。 这些实施例应理解为仅用 于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。 在阅读了本发明记载的内容之后， 本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要 求书所限定的范围。 0023 实验材料： 0024 1、 实验所用细胞株： 人胃癌细胞株HGC-27， 人肝癌细胞株Hep

11、G2， 人肺癌细胞株 A549， 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231， 人前列腺癌细胞株PC3， 人鼻咽癌细胞株CNE-2， 人结肠 癌细胞株HT-29， 正常胃粘膜细胞株GES-1， 神经细胞母细胞瘤SH-SY5Y， 购买于武汉大学中 国典型培养物保藏中心， 通过实验室传代保存细胞株。 0025 使用siRNA基因沉默方式产生人HT-29细胞株PTEN缺失型， 该细胞通过实验室传代 保存细胞株。 0026 2、 实验所用试剂及仪器 0027 1)主要的实验试剂为： RPMI-1640培养基粉剂， 美国Gibco公司产品； DMEM培养基粉 剂， 美国Gibco公司产品； 无支原体新生胎牛血清

12、， 杭州四季青生物材料有限公司产品； 3- (4,5)-二甲基噻唑-2-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)， 美国Sigma公司产品； 青霉素、 链霉素， 华北制药公司产品； HEPES， 美国Amresco公司产品； 胰蛋白酶， 美国Amresco公司产品； 二甲 基亚砜(DMSO)， 美国Amresco公司产品； 细胞DNA含量检测试剂盒， 凯基生物技术股份有限公 说明书 2/18 页 4 CN 105949262 A 4 司产品； AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒， 凯基生物技术股份有限公司产品； AO， 凯 基生物技术股份有限公司产品； 三羟甲基氨基甲烷(Tris)，

13、 美国Sigma公司产品； 十二烷基 磺酸钠(SDS)， 美国Sigma公司产品； (5)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液， 碧云天生物技术研究 所产品； SDS-PAGE凝胶迅速制胶试剂盒， 碧云天生物技术研究所产品； BCA法蛋白定量试剂 盒(加强型)， 碧云天生物技术研究所产品； PVDF膜， 碧云天生物技术研究所产品； ECL化学发 光检测试剂盒， 碧云天生物技术研究所产品； Western所用定影液及显影液， 武汉谷歌生物 科技有限公司产品； 细胞总蛋白提取总试剂， 武汉谷歌生物科技有限公司产品； Twee-20， 武 汉谷歌生物科技有限公司产品； p-PI3K-kinasep85 r

14、abbit抗体(Tyr508,sc-12929)， SantaCruz公司产品； p21rabbit抗体(C-19,sc-397)， SantaCruz公司产品； p-P70S6K rabbit抗体(Thr389)， 美国CellSignaling公司产品； Beclin-1rabbit抗体(D40C5)， 美国 CellSignaling公司产品； CyclinD1rabbit抗体(92G2)， 美国CellSignaling公司产品； LC3A/Brabbit抗体(D3U4C)， 美国CellSignaling公司产品； p-mTORrabbit抗体 (Ser4228)， 美国CellSi

15、gnaling公司产品； -Action一抗抗体， 武汉博士得生物公司产品； 考马斯亮蓝： 南京建成生物科技有限公司产品； 辣根酶标记的山羊抗兔IgG， 北京中杉金桥 公司产品； 辣根酶标记山羊抗小鼠IgG， 北京中杉金桥公司产品； 胶片， 柯达公司产品； 脱脂 奶粉， 伊利集团产品； 四氧嘧啶， Sigma公司产品； 盐酸二甲双胍， 北京京丰制药有限公司产 品； 其他试剂均为市面所售的分析纯级别。 健康雄性SD大鼠和昆明小鼠， 购于三峡大学动物 实验中心。 0028 2)主要的实验仪器为： 96孔板和6孔板， 购于美国Corning公司； 立式压力蒸汽灭菌 锅， 购于日本HIRAYAMA公司

16、； 超纯水仪， 购于艾科浦科技公司； OlympusKX41型倒置显微镜， 购于美国Thermo公司； 3111CO2培养箱， 购于美国赛默飞世尔Thermo公司； 电泳仪， 购于北京 市六一生物仪器公司； StatFax-2100型酶联免疫检测仪， 购于美国Awareness公司； 超净工 作台， 购于苏州净化设备厂； 电子天平， 购于上海民桥精密仪器有限公司； 5415D微型台式高 速离心机， 购于德国Eppendof公司； 微量移液器， 购于德国Eppendof公司； -80的超低温冰 箱， 购于青岛海尔特种电器有限公司； 脱色摇床STS-1型， 购于海门市其林贝尔仪器制造有 限公司；

17、EPICSXL-4型流式细胞系统， 购于英国BeckmanCoulte公司； H-7500透射电子显微 镜， 购于日本日立公司； ULTRACUTR超薄切片机， 购于德国奥地利莱卡公司； 升恒温显影盒， 购于福建三明市芝山照相器材公司； DB-3不锈钢电热板， 购于金坛市富华仪器有限公司； 电 热恒温培养箱， 购于武汉精华科教仪器有限公司； 隔水式电热恒温培养箱， 购于上海跃进医 疗器械公司。 0029 3、 所用试剂的配制： 0030 1)细胞所用普通试剂配制 0031 RPMI-1640培养基： 取购买的1640粉末包装一包， 加入白色粉末HEPES2g和分析纯 的NaHCO32g， 用8

18、00mL高压灭菌后的三蒸水溶解混匀， 然后加入已配制好的5mL的100U/mL 青霉素和链霉素， 轻轻摇匀， 等到彻底溶解之后， 再定容到1000mL， 使用0.22 m的微孔滤膜， 进行真空过滤除菌， 然后分装放在4冰箱保存， 使用时再加入10的新生胎牛血清。 0032 DMEM培养基： 取购买的DMEM粉末包装一包， 加入白色粉末HEPES2g和分析纯的 NaHCO31.7g， 然后其配制分装方法与RPMI-1640培养基配制操作步骤相同。 0033 磷酸缓冲溶液(PBS)： 使用电子天平准确称取NaCl4 .00g， KH2PO40 .10g， 说明书 3/18 页 5 CN 10594

19、9262 A 5 Na2HPO41.45g， KCl0.10g， 然后用储备的双蒸水450mL进行溶解， 之后使用双蒸水定容到 500ml， 放入高压灭菌锅中， 在121的高温下灭菌30min， 等到降温冷却之后， 再放入4冰 箱保存使用。 0034 3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液： 电子天平准确的称取 0.25g的MTT粉剂， 加入到50mL的PBS中， 充分溶解， 直至液体呈清澈的黄色， 无沉淀出现。 使 用0.22 m的微孔滤膜， 进行真空过滤除菌， 分装好后放入4冰箱避光保存。 0035 胰酶溶液(0.25)： 先使用干净的称量纸称取胰酶1.

20、00g， 加入已经配制好的PBS 中溶解， 定容到400mL， 使用0.22 m的滤膜， 进行过滤除菌， 然后分装， 放在-20保存。 0036 柠檬酸铅溶液： 精确称取0.133g的硝酸铅， 0.176g的二水柠檬酸钠， 加入到3mL的 双蒸水中， 用力振荡混匀， 直至生成乳白色的柠檬酸铅悬浊液， 再加入1N的氢氧化钠0.8mL， 使溶液立刻透明， 若不透明， 应重新配制， 最后定容到5mL。 此溶液现配现用， 应尽量减少与 空气的接触。 0037 AO溶液： 准确称取0.5mg的AO粉末， 在避光环境下加入500 L的PBS溶解完全， 配制 成初始浓度为1mg/mL的AO储备液， 锡箔纸包

21、好于4冰箱保存备用。 0038 2)Westernblotting所用试剂配制 0039 30的丙烯酰胺： 使用干净的称量纸称取29g的丙烯酰胺和1g的甲-双叉丙烯酰 胺。 加入75mL的双蒸水混合， 放在37的水浴锅中加热溶解， 再定容到100mL， 使用0.22 m孔 径的滤膜过滤， 放在棕色试剂瓶中冷藏避光保存。 0040 1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)： 称取12.11g的Tris溶解在大约45mL的双蒸水中， 用 45mL的1mol/LHCl调节pH到6.8， 然后加双蒸水稀释定容到到100mL。 进行过滤以后放在4 冰箱里保存。 0041 1.5mol/LTris-

22、HCl(pH8.8)： 称取18.15g的Tris溶解于大约45mL的双蒸水中， 用 45mL的1mol/LHCl调pH至8.8， 加双蒸水稀释定容到100mL。 进行过滤以后放在4冰箱里保 存。 注意的是， 这两种缓冲液都必须使用Tris碱来制备， 再用HCl调节相应的pH值。 0042 10过硫酸铵(AP)： 电子天平称取0.25g的过硫酸铵溶在2.5mL的双蒸水中， 每500 L分装一管， 然后放在-20冷冻保存。 0043 10十二烷基磺酸钠(SDS)： 在90mL的双蒸水中加入10g电泳型的SDS， 然后在37 水浴锅加热溶解， 再加入双蒸水定容到100mL， 分装后放在室温保存。

23、0044 5Tris-甘氨酸电泳缓冲液： 称取7.55g的Trisbase和47g的甘氨酸， 加双蒸水 400mL彻底溶解好后， 再加入25mL的10SDS， 最后将溶液定容到500mL。 0045 5TBS(pH8.0)： 称取3.025g的trisbase和21.925g的NaCl溶解在400mL的双蒸水 中， 待充分溶解之后， 再用HCl调pH到8.0， 最后定容到500mL。 0046 转膜缓冲液： 准确称取甘氨酸14.4g， tris2.42g， 加入700mL的双蒸水彻底溶解， 然后缓慢加入无水甲醇200mL， 混匀后再加双蒸水定容到1000mL， 封口保存， 防止无水甲醇 挥发。

24、 0047 TBST： 向配制的TBS溶液中加入0.05的Tween-20。 0048 封闭液： 使用TBST溶液配制5的脱脂奶粉， 混合均匀。 0049 考莫斯亮蓝染色液： 45mL的甲醇， 45mL的双蒸水， 10mL的冰醋酸， 混合均匀后， 加入 0.25g的考马斯克亮蓝， 充分溶解， 放在棕色试剂瓶中保存。 说明书 4/18 页 6 CN 105949262 A 6 0050 12分离胶： 双蒸水1.9mL， 30的丙烯酰胺3.5mL， 3.42mL的1.5MTris-HCl， 0.09mL的10SDS， 0.09mL的10AP， 3.6 L的TEMED， 总体积9mL。 0051 1

25、0分离胶： 双蒸水2.33mL， 30的丙烯酰胺3.07mL， 3.42mL的1.5MTris-HCl， 0.09mL的10SDS， 0.09mL的10AP， 3.6 L的TEMED， 总体积9mL。 0052 6分离胶： 双蒸水3.5mL， 30的丙烯酰胺1.9mL， 3.42mL的1.5MTris-HCl， 0.09mL的10SDS， 0.09mL的10AP， 7.2 l的TEMED， 总体积9mL。 0053 浓缩胶： 双蒸水4.1mL， 30丙烯酰胺1mL， 0.75mL的1.0MTris-HCl， 60 L的10 SDS， 60 L的10AP， 6 L的TEMED， 总体积6mL。

26、0054 0.02叠氮钠： 配制叠氮钠需佩戴手套和口罩， 称取叠氮钠溶于PBS溶液中， 然后 放在4冰箱储存备用。 0055 实施例1： 0056 3-氢化松苓酸氰乙酯， 其系统命名为： (2R)-2-(3S,10S,13R,14R,17R)-3-羟基- 4,4,10,13,14-五甲基-2,3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊a菲- 17-基)-6-甲基庚-5-烯酸氰甲酯； 其结构式为： 0057 0058 3-氢化松苓酸氰乙酯的合成方法为： 0059 1)在反应瓶中加入等摩尔的3-氢化松苓酸B、 溴乙腈、 碳酸钾， 并加入适量乙腈作 为溶剂

27、， 在85搅拌反应2h， TCL检测反应完成后， 旋干溶剂， 加入水和乙酸乙酯， 分离萃取 三次， 回收乙酸乙酯， 得固体物； 0060 2)将固体物固法上样， 200-300目正相硅胶柱层析分离， 以石油醚： 乙酸乙酯15: 1(体积比)为流动相， 得白色固体粉末为3-氢化松苓酸氰乙酯。 0061 得到的3-氢化松苓酸氰乙酯结构鉴定氢谱见图1。 0062 1H-NMR(400MHz,CDCl3) ： 0.72(3H,s),0.81(3H,s),0.88(3H,s),0.96(3H,s), 1.02(3H,s),1.06-1,38(6H,m),1.58(3H,s),1.68(3H,s),1.5

28、31.88(8H,m)1.91-2.09 (9H,m),2.38(1H,m),3.23(1H,dd,J4Hz,8Hz),4.71(2H,m),5.04(1H,m)。 该化合物经核 磁共振仪测试， 在氢谱(1H-NMR)高场区出现 0.72(3H,s),0.81(3H,s),0.88(3H,s),0.96 (3H,s),1.02(3H,s),1.06-1,38(6H,m),1.58(3H,s),1.68(3H,s)的甲基质子信号峰， 分别 为3-氢化松苓酸氰乙酯中的七个甲基质子信号。 在高场区 1.52.2出现一系列的质子信 号， 推测为母核三氢化松苓酸B的质子信号。 化学位移在 2.38(1H

29、,m)的质子信号， 推测为双 键的质子信号。 化学位移在4.71(2H,m)的质子信号， 推测为连接氰基的亚甲基的质子信号 峰。 化学位移在 5.04(1H,m)的质子信号， 推测3-氢化松苓酸氰乙酯中羟基的特征质子信号 峰。 由核磁氢谱数据分析可见， 氰乙基与三氢化松苓酸B的羧基以酯键的型式结合成3-氢化 松苓酸氰乙酯。 0063 3-氢化松苓酸氰乙酯储备液的配制： 使用称量纸准确称取3-氢化松苓酸氰乙酯 说明书 5/18 页 7 CN 105949262 A 7 1.5mg， 用移液枪准确加入DMSO漩涡震荡30s， 最终制成10mM的3-氢化松苓酸氰乙酯初始浓 度。 使用时， 再用含血清

30、的培养基进行稀释即可。 0064 实施例2： 0065 一、 在实施例1的基础上， 将所得到的3-氢化松苓酸氰乙酯进行具体的实验， 具体 方法如下： 0066 1、 细胞培养 0067 人胃癌细胞株HGC-27， 人肝癌细胞株HepG2， 人肺癌细胞株A549， 人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231， 人前列腺癌细胞株PC3， 人鼻咽癌细胞株CNE-2， 分别用含有10胎牛血清的 RPMI-1640培养基培养， 神经细胞母细胞瘤SH-SY5Y， 人结肠癌HT-29细胞株， 分别用含有 10胎牛血清的DMEM培养基培养， 放在37且5CO2的饱和湿度培养箱中进行开放式单层 细胞培养。 在倒置显微

31、镜下观察细胞密度为80左右时， 进行传代。 传代时， 先弃去旧培养 液， 然后用5mL的PBS洗两遍， 加入0.25的胰蛋白酶， 放在37、 5CO2培养箱中孵育1-5分 钟， 在显微镜下看到细胞变圆时， 用含血清培养基吹打细胞， 终止消化， 然后将细胞悬液移 到对应的离心管中， 1300r/min下离心5分钟， 在无菌操作台中弃去上清， 用2mL含血清的培 养基均匀吹打离心管中的细胞， 制成单细胞悬液， 取1/3细胞于新培养瓶中， 并补足培养基 至5mL， 继续培养。 0068 2、 细胞转染培养 0069 取对数生长期的HT-29细胞， 接种1105-5105个细胞至有培养基的24孔板中培

32、 养孔， 使转染时的细胞密度能够达到30-50。 注： 1)不同细胞生长速度不同， 接种细胞的数 量， 细胞密度需要依据细胞类型， 培养时间， 实验目的而定； 2)每孔接种的细胞数量应尽量 相同， 使细胞均匀分布。 将siRNA进行稀释后， 加入到培养基中， 轻轻混匀， 保证转染浓度为 50nM。 将培养板置于37的CO2培养箱中培养24-96h。 转染完成后24-72小时均可进行siRNA 沉默效果检测。 可用Western-blot检测目标蛋白的水平， 反应siRNA沉默效果。 0070 人结肠癌HT-29细胞株PTEN缺失型和PTEN野生型， 分别用含有10胎牛血清的 DMEM培养基培养

33、， 放在37摄氏度且5CO2的饱和湿度培养箱中进行培养。 其消化、 重悬、 传 代步骤与其他人胃癌细胞株HGC-27， 人肝癌细胞株HepG2等细胞株的培养方法相同。 0071 3、 流式细胞仪测定3-氢化松苓酸氰乙酯对细胞周期的变化 0072 因细胞周期的检测对测定细胞的密度要求较高， 密度过低时， 流式细胞仪无法做 出检测。 因此， 实验中需要使用50mL的细胞培养瓶培养HGC-27细胞， 等到细胞贴壁且生长覆 盖程度达到80以上， 开始加入3-氢化松苓酸氰乙酯处理胃癌细胞， 设置浓度梯度为10、 20、 40 M， 并且设置细胞对照组， 要注意细胞对照组的密度应控制在60左右， 防止细胞

34、在 培养后处理时出现老化现象， 影响后续的检测结果。 然后将培养瓶中的细胞放入5CO2， 37 培养箱中培养24h。 时间终止时， 使用不含EDTA的胰酶将细胞消化下来， 并收集细胞于离 心管中用2000r/min的转速离心5min， 然后用PBS轻轻吹散细胞， 尽量减少细胞受到的机械 损伤。 在相同转速下离心， 如此反复洗涤2次， 调整每组细胞浓度在1106个/mL为宜， 加入 体积分数为70的冷乙醇500 L进行固定， 过夜。 然后2000转下离心弃去固定液， 加入试剂 盒中的RNaseA100 L， 移液枪混匀细胞， 并在37的水浴锅中水浴30min， 最后加入400 L的 PI均匀染色

35、， 放在4冰箱且在避光条件下反应30min， 即可使用流式细胞仪进行上机检测， 记录激发波长在488nm处的红色荧光。 说明书 6/18 页 8 CN 105949262 A 8 0073 4、 流式细胞仪测定细胞凋亡率 0074 细胞凋亡检测前的细胞处理方法和加药方式与细胞周期检测中的相同。 同样要注 意细胞在加药前的密度， 防止对照组细胞处理时已经发生老化现象。 不同的步骤在于胰酶 消化细胞后， 收集细胞在2000r下离心5min， PBS洗涤2次后， 必须调整每组的细胞浓度在1-5 105个/mL范围内。 然后用500 L的BindingBuffer悬浮细胞， 加入AnnexinV-FI

36、TC5 L混 匀后， 接着加入5 L的PropidiumIodide(PI)混匀， PI本身就是一种核酸染液， 它的作用在 于能使凋亡晚期和坏死的细胞均透过细胞膜而染上色， 然而完整的细胞是不能着色的。 然 后将处理好的样品放置在室温下， 避光条件反应5至15min， 1小时之内进行流式细胞仪上机 检测， 其结果均为有效数据。 0075 5、 药物作用细胞后的自噬检测 0076 流式细胞仪测定细胞自噬比例 0077 AO是实验应用中的荧光染料， 能够在发生自噬的细胞中， 将自噬小体进行染色。 因 此， 利用流式细胞仪就可定量检测细胞发生自噬的比例。 在大培养瓶中培养HGC-27细胞直 至细胞处

37、于对数期， 加入不同浓度的3-氢化松苓酸氰乙酯并设置细胞对照组， 药物处理细 胞24h后， 收集细胞， 用PBS洗涤2次， 然后将初始浓度的AO(1mg/mL)用PBS溶液稀释成0.1mg/ L的浓度后， 加入10uL的AO溶液于各组细胞中(对照组除外)， 在常温下避光反应10-15min以 后， 立刻用流式细胞仪进行检测分析， 实验过程重复3次。 0078 透射电子显微镜观察药物作用后的细胞形态 0079 在50mL的培养瓶中培养HGC-27细胞， 待细胞密度达到60以上且生长状态良好 时， 加入浓度为20 M的3-氢化松苓酸氰乙酯， 在5CO2， 37的饱和湿度培养箱中培养， 并 设置空白

38、对照组。 药物作用24h后， 使用0.25胰酶消化细胞， 轻轻用移液枪将细胞吹打下 来， 切勿对细胞造成机械损伤， 用800的转速离心10min收集细胞。 使用冷的PBS洗涤细胞2次 后， 将离心的细胞用500 L的2.5戊二醛1锇酸固定细胞过夜， 注意不可将细胞吹散， 要缓缓加入。 过夜之后将细胞团取出， 用刀片切成芝麻大小进行后续实验。 首先用双蒸水洗 涤切好的细胞团2次， 每次10-15min； 再依次用50、 70、 80、 90乙醇和无水乙醇各脱 水15min； 最后使用100的丙酮进行两次脱水， 而且保证每次10min。 完成之后使用包埋剂 与丙酮1:1混合液浸透包埋样本， 将包埋

39、样本放置37烘箱24h， 再放入隔水式电热恒温箱 48h， 然后对包埋好的样本进行修片， 并制备超薄切(注意， 所切超薄切片需能着上色才可)， 之后再用柠檬酸铅染液染色10-15min， 即可用电镜观察超薄切片， 并做好底片的序号记录， 等待洗底片， 扫描细胞结果图。 0080 6、 分子对接计算3-氢化松苓酸氰乙酯与mTOR的结合能力 0081 分子对接是基于几何互补、 电性互补为原则， 利用计算机进行辅助作用， 模拟药物 和受体的分子或靶点的相互作用。 本分子对接是从PDB数据库中选取mTOR晶体结构A链 (4JT5_A)， 去结晶水， 加极性氢、 电荷。 以其中配体P2X为中心， 建立的

40、对 接盒子。 配体分子建立在pH7.4下的离子化状态并做能量最小化处理。 采用GlideSP方法 进行分子对接， 计算3-氢化松苓酸氰乙酯与mTOR的结合能力。 以Gscore的分值表示药物与 受体或靶点的结合能力强弱， Gscore的值越负， 表示两者的结合能力越强， 相互作用越强， 反之， 则越弱。 0082 7、 Westernblotting检测3-氢化松苓酸氰乙酯对相关蛋白表达的影响 说明书 7/18 页 9 CN 105949262 A 9 0083 收集蛋白样品 0084 将HGC-27细胞接种在75cm2的大细胞培养瓶中， 等到细胞贴壁生长良好且细胞密 度高时， 加入3-氢化松

41、苓酸氰乙酯低、 中、 高剂量的药物浓度处理细胞， 24h后分别收集各组 细胞， 每组细胞使用5mL的PBS洗涤， 共2次， 弃去洗涤液PBS后， 每组加入100 L的细胞裂解液 (50mmol/LTris-HclpH8.0、 5mmol/LEDTA、 1tritonX-100、 150mmol/LNaCl、 1mmol PMSF)和1 L的磷酸酶抑制剂(防止磷酸化蛋白去磷酸化)。 混匀后在制备冰上反复的冻融裂 解3次， 每次15分钟。 12000的转速离心10-15min， 取其上清液， 用BCA蛋白浓度测定试剂盒做 出蛋白标准曲线图， 再一一计算各样品的总蛋白含量。 最后将各组蛋白进行计算，

42、 定量到同 一浓度， 定量好的蛋白加入2蛋白上样缓冲液， 在沸水中煮沸5-7min， 分装到小型EP管中， 放入-80冰箱保存备用。 0085 配胶 0086 首先将实验所用玻璃板用洁净的纱布擦洗， 并用双蒸水冲洗2遍， 晾干以后备用。 按照仪器的安装说明， 将玻璃板安装好， 用双蒸水进行检漏至无水漏出即可。 按照电泳所需 蛋白分子量的大小， 选择适宜的凝胶浓度。 按照试剂配方， 配好分离胶置于干净的烧杯中搅 拌均匀， 然后用移液枪将液体缓缓灌入两玻璃板之间， (注意不能灌入气泡， 若出现气泡， 则 用废弃的进样针迅速赶出气泡)， 分离胶灌入4mL后停止灌样， 立即用双蒸水封胶。 需缓缓加 水

43、， 直至与玻璃板的上侧水平， 切勿加水过急， 使分离胶溢出。 将分离胶放置在37的烘箱 中， 水平静置30-45min。 观察胶与水的交界面是否出现一条折光线， 有则表示分离胶已凝固 好， 可倒掉封闭的水， 再用滤纸吸干多余的水， 最后灌入已配好且混匀的浓缩胶， 插上梳子， 室温下凝固1h后即可使用。 0087 上样 0088 浓缩胶凝固好后， 可轻轻的拔出梳子， 正确的将凝胶放入电泳槽中， 倒入电泳缓冲 液， 注意电泳液应外侧倒入2/3的体积， 内侧应倒满。 等待30min后再上样， 时间放置越长越 有利于胶结构的形成， 因为肉眼观察到的胶凝固时， 其内部的结构还没有形成好。 上样前将 各蛋

44、白样品放置在室温溶解， 置于振荡器上混合均匀或再次沸水水浴5min， 然后使用微量 进样针等体积上样到中间泳道， 剩余的泳道则用相同体积的1Loadingbuffer进行填充。 Marker泳道需在Marker上样量的基础上， 补充1Loadingbuffer至相同的体积。 0089 电泳 0090 上样结束后， 按照接线规则连好电源的正负极， 先设置浓缩电压80v， 等条带电泳 到浓缩胶和分离胶的分界面时， 将电压调到120v进行条带分离， 接着电泳1h左右， 以Marker 为参照， 电泳至所有的条带均匀分开后， 即可停止电泳。 若所需目标蛋白分子量为小分子 量， 则应先用60v电压电泳，

45、 再换至120v的电压， 若所需蛋白为大分子量蛋白， 电泳时间过长 时， 应隔段时间更换冰块， 防止电泳时间过长， 分离胶温度升高， 出现融化现象。 0091 转膜 0092 电泳结束后， 将卸下的胶块正面朝上， 以Marker作为标记切取所需的凝胶条带， 并 且事先按照所需凝胶大小对应尺寸， 剪取同样大小的PVDF膜一张和滤纸两张备用。 凝胶条 带放入新配制的转膜缓冲液中浸泡， PVDF膜则依次在无水甲醇、 双蒸水、 转膜缓冲液中分别 浸泡10s、 5min、 10min， 滤纸则在双蒸水、 转膜缓冲液中分别浸泡5、 10min。 然后按照顺序先 将凝胶条带放在黑板上， 再放滤纸、 凝胶、

46、PVDF膜、 滤纸， 凝胶盖板白板。 装入电泳槽中， 黑板 说明书 8/18 页 10 CN 105949262 A 10 放电源负极， 白板放电源正极， 倒入转膜缓冲液。 将电泳槽放入准备好的冰水浴中， 电泳仪 调至稳定电流为200mA， 电泳时间在30-90min为宜(大分子蛋白除外)， 使Marker条带能够完 全转移到纤维素膜上， 则转膜完成， 停止电泳。 可将凝胶条带置于考马斯亮蓝染液中， 染色 1h后， 洗涤条带， 观察转膜是否完全。 0093 封闭 0094 转膜完成后， 用镊子轻轻夹取PVDF膜有Marker标记的一端， 先用TBST洗涤3次， 每 次5min， 然后将膜放在T

47、BST配好的5的脱脂牛奶中， 摇床上低速摇匀孵育2-2.5h。 0095 孵育一抗 0096 封闭结束后， 先用TBST漂洗纤维素膜3次10min， 然后置于TBST稀释好的一抗孵 育瓶中， 在4冰箱中缓慢摇匀到过夜， 第二天再取出放在室温下摇床轻摇1h。 0097 孵育二抗 0098 一抗孵育完成后， 镊子轻轻夹取PVDF膜有Marker标记的一端， 用TBST洗涤3次， 每 次5-10min， 然后将PVDF膜放在TBST稀释好的二抗溶液中， 室温轻摇1小时， 计时器计时。 0099 洗涤 0100 二抗孵育完毕后， 接着用TBST洗涤纤维素膜， 洗涤三次， 每次10min。 0101 暗

48、室曝光 0102 准备好暗室曝光前所用的试剂盒仪器， 先用镊子将孵育完成的PVDF膜轻轻取出， 用虑纸将膜上多余的水吸干。 PVDF膜平放置在暗匣中， 滴加已经配好的发光液(A液和B液按 1:1混合)， 并将多余的发光液用滤纸吸走。 在暗室条件下等待PVDF膜出现绿色荧光， 等待所 有荧光出现完为止。 将PVDF膜盖上准备好的极薄的透明塑料膜， 剪出大小相当的柯达胶 片， 盖在膜上， 立刻关闭暗匣， 若荧光弱则多等待几分钟， 若荧光强， 则至多等待1min。 适应 的时间适度曝光及其重要， 曝光结束后， 将胶片放在显影液中显影1-4min， 再放入清水中来 回漂洗， 最后放在定影液中定影1-4

49、min。 PVDF膜需用水清洗后在阴凉处晾干。 之后扫描胶片 即可， 条带可用凝胶图像分析软件ImageJ.Ink进行定量分析， 统计学比较。 0103 8、 3-氢化松苓酸氰乙酯对神经细胞SH-SY5Y的保护作用 0104 3-氢化松苓酸氰乙酯对SH-SY5Y的细胞毒性 0105 取对数生长期的SH-SY5Y细胞以5104个/mL的浓度接种于96孔板， 100 L/孔， 贴 壁生长12h后， 加入3-氢化松苓酸氰乙酯的不同浓度(80、 40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25 M)， 每个浓 度设定3个复孔， 培养48h后， MTT法检测细胞的抑制率， 并计算药物对应的IC50值。 0106 3-氢化松苓酸氰乙酯对SH-SY5Y细胞的保护作用 0107 SH-SY5Y细胞分为2组： 空白组和模型组， 取对数生长期的SH-SY5Y细胞以5104 个/ml的浓度接种于96孔板， 100 L/孔， 培养12h后弃去旧培养基， 模型组加入不同浓度的 H2O2溶液， H2O2浓度为1200 M， 1100 M， 1050 M， 1000 M， 950 M， 900 M， 800 M， 750 M， 700 M。 空白组加入DMEM培养基， 最后保证200 L