基于HiSeq测序技术检测乙型肝炎病毒分型和耐药基因的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102758026 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102758026 A *CN102758026A* (21)申请号 201210222621.5 (22)申请日 2012.06.29 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12M 1/34(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 深圳华大基因科技有限公司 地址 518083 广东省深圳市盐田区北山路 146 号北山工业区综合楼 11F-3 申请人 深圳华大基因研究院 (72)发明人

2、韩颖鑫 张印新 梅严花 王玉琦 刘涛 汪建 (74)专利代理机构 北京清亦华知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 11201 代理人 李志东 (54) 发明名称 基于 HiSeq 测序技术检测乙型肝炎病毒分型 和耐药基因的方法 (57) 摘要 提供了 HBV 核酸样本突变位点类型的检测方 法、 PCR 引物、 标签引物及其试剂盒。其中， 确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的方法包括 ： 使用 第一引物组， 对所述 HBV 核酸样本进行扩增， 以便 得到第一扩增产物 ； 对所述第一扩增产物进行测 序 ； 基于测序结果， 确定 HBV 核酸样本中是否存在 突变， 其中， 所述第一引物组包含第一

3、引物和第二 引物， 所述第一引物具有 SEQ ID NO ： 1 所示的核 苷酸序列， 所述第二引物具有 SEQ ID NO ： 2 所示 的核苷酸序列， 所述第一引物的 5 端进一步包含 第一标签序列， 所述第二引物的 5 端进一步包含 第二标签序列。利用该方法能够有效确定 HBV 核 酸样本中是否存在突变。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 19 页 序列表 16 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 19 页 序列表 16 页 附图 1 页 1/3 页 2 1. 一种确定 HBV 核酸样本中突变位点类型

4、的方法， 其特征在于， 包括下列 ： 使用第一引物组， 对所述 HBV 核酸样本进行扩增， 以便得到第一扩增产物 ； 对所述第一扩增产物进行测序， 以便得到测序结果 ； 以及 基于所述测序结果， 确定所述 HBV 核酸样本中是否存在突变， 其中， 所述第一引物组包含第一引物和第二引物， 所述第一引物具有SEQ ID NO ： 1所示 的核苷酸序列， 所述第二引物具有 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列， 所述第一引物的 5 端进一步包含第一标签序列， 所述第一标签序列具有选自如 SEQ IDNO ： 5-52 至少之一所示的核苷酸序列， 所述第二引物的 5 端进一步包含第二标签序列，

5、 所述第二标签序列具有选自如 SEQ IDNO ： 53-100 至少之一所示的核苷酸序列。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述HBV核酸样本是从HBV的宿主中分离 的。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述HBV核酸样本是从乙肝患者血清样本 中分离的。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 使用第一引物组， 对所述 HBV 核酸样本进 行扩增， 以便得到第一扩增产物进一步包括 ： 使用第二引物组， 对所述 HBV 核酸样本进行扩增， 以便得到第二扩增产物 ； 以及 使用第一引物组， 对所述第二扩增产物进行扩增， 以便得到所述第一扩增产物， 其中，

6、所述第二引物组包括第三引物和第四引物， 所述第三引物具有如 SEQ ID NO ： 3 所示的 核苷酸序列， 所述第四引物具有如 SEQ ID NO ： 4 所示的核苷酸序列。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、 磁 珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所述第一扩增产物。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 对所述第一扩增产物进行测序， 以便得到 测序结果进一步包括 ： 针对所述第一扩增产物， 构建测序文库 ； 以及 对所述测序文库进行测序， 以便得到所述测序结果。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 利用选自

7、 Hiseq 2000、 SOLID、 454 和单分 子测序装置的至少一种进行所述测序。 8. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 针对所述第一扩增产物， 构建测序文库进 一步包括 ： 将所述第一扩增产物片段化， 以便得到 DNA 片段 ； 对所述 DNA 片段进行末端修复， 以便获得经过末端修复的 DNA 片段 ； 对所述经过末端修复的 DNA 片段进行 3 端添加碱基 A， 以便获得 3 末端添加碱基 A 的 DNA 片段 ； 将所述 3 末端添加碱基 A 的 DNA 片段与接头相连， 以便获得连接产物 ； 对所述连接产物进行 PCR 扩增， 以便获得第三扩增产物 ； 以及 将

8、所述第三扩增产物进行纯化回收， 以便获得回收产物， 所述回收产物构成所述测序 文库。 权 利 要 求 书 CN 102758026 A 2 2/3 页 3 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 通过选自化学打断方法和物理打断方法 的至少一种将所述第一扩增产物片段化， 其中所述化学方法包括酶切方法， 所述物理打断 方法包括超声波打断方法和机械打断方法。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述末端修复是利用Klenow片段、 T4DNA 聚合酶和 T4 多核苷酸激酶进行的， 所述 Klenow 片段具有 5 -3 聚合酶活性和 3 -5 外切 酶活性， 但缺少 5 -3

9、 外切酶活性。 11. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 利用 Klenow（3 -5 exo-） 对所述经过 末端修复的 DNA 片段进行 3 端添加碱基 A。 12. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 将所述 3 末端添加碱基 A 的 DNA 片段与 接头相连是利用 T4DNA 连接酶进行的。 13. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 通过琼脂糖凝胶电泳、 磁珠纯化和纯化 柱纯化的至少一种纯化回收所述第三扩增产物。 14.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 基于所述测序结果， 确定所述HBV核酸样 本中是否存在突变进一步包括 ： 将所述测序结果与参

10、照序列进行比对， 以便确定所述 HBV 核酸样本中是否存在突变。 15. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述突变为选自 rtL80I/V、 rtI169T、 rtV173L、 rtL180M、 rtA181T/V、 rtN236T、 rtT184G/S/A/I/L/F、 rtA194T、 rtS202I/G、 rtM204V/I 和 rtM250V/I/L 的至少一种。 16. 一组 PCR 引物， 其特征在于， 包含第一引物和第二引物， 所述第一引物具有 SEQ IDNO ： 1 所示的核苷酸序列， 所述第二引物具有 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列， 所述第一引

11、物的 5 端进一步包括第一标签序列， 所述第一标签序列具有选自如 SEQ IDNO ： 5-52 至少之一所示的核苷酸序列， 所述第二引物的 5 端进一步包含第二标签序列， 所述第二标签序列具有选自如 SEQ IDNO ： 53-100 至少之一所示的核苷酸序列。 17.根据权利要求16所述的一组PCR引物， 其特征在于， 进一步包括第三引物和第四引 物， 所述第三引物具有如 SEQ ID NO ： 3 所示的核苷酸序列， 所述第四引物具有如 SEQ IDNO ： 4 所示的核苷酸序列。 18. 一组分离的寡核苷酸， 其特征在于， 由 SEQ ID NO ： 5-100 所示的寡核苷酸构成。

12、19. 一种试剂盒， 其特征在于， 包含权利要求 16 或 17 所述的一组 PCR 引物。 20. 权利要求 19 所述的试剂盒在检测 HBV 基因的核苷酸突变中的用途。 21. 根据权利要求 20 所述的用途， 其特征在于， 所述突变为选自 rtL80I/V、 rtI169T、 rtV173L、 rtL180M、 rtA181T/V、 rtN236T、 rtT184G/S/A/I/L/F、 rtA194T、 rtS202I/G、 rtM204V/I 和 rtM250V/I/L 的至少一种。 22. 一种确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的系统， 其特征在于， 包括 ： 扩增装置， 所述扩

13、增装置中设置有权利要求 16 或 17 所述的一组 PCR 引物， 用于对所述 HBV 核酸样本进行扩增， 以便得到第一扩增产物 ； 测序装置， 所述测序装置与所述扩增装置相连， 并且适于对所述第一扩增产物进行测 序， 以便得到测序结果 ； 以及 分析装置， 所述分析装置与所述测序装置相连， 用于基于所述测序结果， 确定所述 HBV 权 利 要 求 书 CN 102758026 A 3 3/3 页 4 核酸样本中是否存在突变。 23. 根据权利要求 22 所述的系统， 其特征在于， 进一步包括 ： 核酸分离装置， 所述核酸分离装置适于从 HBV 的宿主分离 HBV 核酸样本。 24. 根据权利

14、要求 22 所述的系统， 其特征在于， 所述测序装置为选自 Hiseq2000、 SOLID、 454 和单分子测序装置的至少一种。 25. 根据权利要求 22 所述的系统， 其特征在于， 所述分析装置进一步包括比对单元， 所 述比对单元中存储有参照序列， 用于将所述测序结果与参照序列进行比对， 以便确定所述 HBV 核酸样本是否存在突变。 权 利 要 求 书 CN 102758026 A 4 1/19 页 5 基于 HiSeq 测序技术检测乙型肝炎病毒分型和耐药基因的 方法 技术领域 0001 本发明属于基因组学和分子生物学中有机生物分子领域， 具体而言涉及 HBV 核酸 样本突变位点类型的

15、检测方法、 PCR 引物、 标签引物及其试剂盒。 背景技术 0002 乙型肝炎病毒 (HBV) 感染是严重的全球公共卫生问题之一， 全球约 3.5-4 亿人感 染 HBV， 每年大约有 100 万人死于 HBV 感染所致的肝硬化、 肝衰竭和肝细胞癌。目前， 用于 HBV 治疗的主要有两种药物 ： 干扰素和核苷酸类药物。随着核苷酸类似物在临床上广泛应 用于治疗慢性乙型肝炎， HBV 的耐药问题日益凸显， 已经成为临床上制约抗病毒疗效的重要 原因。而且感染不同的 HBV 型别其临床表现和预后也有所不同， 所以对乙肝患者进行 HBV 分型和耐药基因的检测对指导临床用药有重要意义。 0003 然而，

16、目前对乙肝患者进行 HBV 分型和耐药基因的检测手段仍有待改进。 发明内容 0004 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商 业选择。为此， 本发明的一个方面， 提出了一种确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的方法， 包括下列步骤 ： 使用第一引物组， 对所述 HBV 核酸样本进行扩增， 以便得到第一扩增产物 ； 对第一扩增产物进行测序， 以便得到测序结果 ； 以及基于测序结果， 确定 HBV 核酸样本中是 否存在突变， 其中， 第一引物组包含第一引物和第二引物， 第一引物具有 SEQ ID NO ： 1 所示 的核苷酸序列， 第二引物具有 SEQ ID NO ：

17、 2 所示的核苷酸序列， 第一引物的 5 端进一步包 含第一标签序列 （即正向标签） ， 第一标签序列具有选自如SEQ ID NO ： 5-52至少之一所示的 核苷酸序列， 第二引物的 5 端进一步包含第二标签序列 （即反向标签） ， 第二标签序列具有 选自如 SEQ ID NO ： 53-100 至少之一所示的核苷酸序列。由此， 能够有效地确定 HBV 核酸样 本中突变位点的类型， 并且能够同时对多种核酸样本进行分析。 0005 根据本发明的另一个方面， 本发明还提供一组 PCR 引物， 其包含第一引物和第二 引物， 其中第一引物具有SEQ ID NO ： 1所示的核苷酸序列， 第二引物具有

18、SEQ ID NO ： 2所示 的核苷酸序列， 其中， 第一引物的 5 端进一步包括第一标签序列 （即正向标签） ， 第一标签序 列具有选自如 SEQ ID NO ： 5-52 至少之一所示的核苷酸序列， 第二引物的 5 端进一步包含 第二标签序列 （即反向标签） ， 第二标签序列具有选自如SEQ ID NO ： 53-100至少之一所示的 核苷酸序列。 根据本发明的实施例， 上述引物组还进一步包括第三引物和第四引物， 第三引 物具有如 SEQ ID NO ： 3 所示的核苷酸序列， 第四引物具有如 SEQ ID NO ： 4 所示的核苷酸序 列。利用根据本发明实施例的引物组， 能够有效地实施

19、前述确定 HBV 核酸样本中突变位点 的类型的方法， 进而能够用于有效地确定 HBV 核酸样本中突变位点的类型， 并且能够同时 对多种核酸样本进行分析。 0006 根据本发明的另一方面， 本发明还提供一组分离的寡核苷酸， 由SEQ ID NO ： 5-100 说 明 书 CN 102758026 A 5 2/19 页 6 所示的寡核苷酸构成。 利用这些寡核苷酸可以作为标签， 可以有效地用于高通量测序， 从而 能够有效地利用高通量测序平台， 同时对多种样本进行测序， 并通过预知的标签的核苷酸 序列对所得到测序结果的来源进行区分。 0007 根据本发明的另一方面， 本发明还提供一种试剂盒， 其包括

20、上述引物组或寡核苷 酸组， 同时， 本发明还提供该试剂盒在检测 HBV 基因的核苷酸突变中的用途。利用根据本发 明实施例的试剂盒， 能够有效地实施前述确定 HBV 核酸样本中突变位点的类型的方法， 进 而能够用于有效地确定 HBV 核酸样本中突变位点的类型， 并且能够同时对多种核酸样本进 行分析。 0008 根据本发明的另一方面， 本发明还提供一种确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的 系统。根据本发明的实施例， 该系统包括 ： 扩增装置， 所述扩增装置中设置有前述的一组 PCR 引物， 用于对所述 HBV 核酸样本进行扩增， 以便得到第一扩增产物 ； 测序装置， 所述测序 装置与所述扩增装置

21、相连， 并且适于对所述第一扩增产物进行测序， 以便得到测序结果 ； 以 及分析装置， 所述分析装置与所述测序装置相连， 用于对基于所述测序结果， 确定所述 HBV 核酸样本中是否存在突变。利用根据本发明实施例的确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的 系统， 能够有效地实施前述确定 HBV 核酸样本中突变位点的类型的方法， 进而能够用于有 效地确定 HBV 核酸样本中突变位点的类型， 并且能够同时对多种核酸样本进行分析。 0009 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出， 部分将从下面的描述中变 得明显， 或通过本发明的实践了解到。 附图说明 0010 本发明的上述和 / 或附加的方面和

22、优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解， 其中 ： 0011 图1是根据本发明一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法的流程 示意图 ； 以及 0012 图2是根据本发明一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统的结构 示意图。 0013 发明详细描述 0014 下面详细描述本发明的实施例， 所述实施例的示例在附图中示出， 其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。 下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的， 仅用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。 0015 需要说明的是， 术语 “第一” 、“第二” 仅用于描述

23、目的， 而不能理解为指示或暗示相 对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此， 限定有 “第一” 、“第二” 的特征可 以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。 进一步地， 在本发明的描述中， 除非另有说 明，“多个” 的含义是两个或两个以上。 0016 核酸标签 0017 根据本发明的一个方面， 本发明提供了一组核酸标签 （在本文中有时也称为 “分离 的寡核苷酸” ） 。根据本发明的实施例， 这些核酸标签分别为 SEQ ID NO ： 5-100 所示。在本 说明书中， 这 48 对核酸标签分别被命名为 PI-N， 其中 N=1-48 中的任意整数， 其序列如下表 1 ： 说 明 书

24、 CN 102758026 A 6 3/19 页 7 0018 表 1 标签引物的序列 0019 Index 编号 正向 index(SEQID NO ： ) 反向 index(SEQID NO ： ) PI-1 ATACTA（5） CAGTCT（53） PI-2 CATGTG（6） CTGAGA（54） PI-3 TCGATC（7） TCTCGT（55） PI-4 GTAGTG（8） TCTACG（56） PI-5 ACATCA（9） AGATGA（57） PI-6 ATGTCG（10） GACTGT（58） PI-7 CACACT（11） GAGCAG（59） PI-8 CAGATA（12

25、） CGTGCA（60） PI-9 GCAGCT（13） ATACGT（61） PI-10 GTGACA（14） GCTCGA（62） PI-11 CTCATA（15） CGCTAC（63） PI-12 ATGCTC（16） ATGAGT（64） PI-13 CGTCTC（17） GTGCGA（65） PI-14 TCGTGA（18） CTACGA（66） PI-15 ACGCTG（19） TCTGCT（67） PI-16 ATCATC（20） CAGAGT（68） PI-17 TGACTC（21） CTCTGA（69） PI-18 AGCATG（22） TGTATG（70） PI-19 TA

26、GTAC（23） AGTGAG（71） PI-20 GATATC（24） TCATGT（72） PI-21 ACATAG（25） ACAGTA（73） PI-22 GATACG（26） GCGACG（74） 说 明 书 CN 102758026 A 7 4/19 页 8 PI-23 CGTCGA（27） TGCATA（75） PI-24 ACACTC（28） CTGCTA（76） PI-25 CTATGC（29） GTCAGT（77） PI-26 GCGATA（30） ACGACA（78） PI-27 ACTAGT（31） AGTCTA（79） PI-28 CGTACT（32） AGATCT（

27、80） PI-29 CTCTAG（33） GAGTAT（81） PI-30 AGTATC（34） TACTGC（82） PI-31 AGAGAC（35） ACACAT（83） PI-32 ATGTGA（36） TACGTA（84） PI-33 GCTGCG（37） GATCGC（85） PI-34 TAGAGC（38） GCGTGT（86） PI-35 ATGCAG（39） GAGTGC（87） PI-36 CGACAC（40） CGCAGA（88） PI-37 GTGTCT（41） CATCAC（89） PI-38 GTGCTG（42） CACGCA（90） PI-39 CTGACT（43）

28、 ACTGCA（91） PI-40 CTCGAC（44） CTCGTG（92） PI-41 CGTGAC（45） GTAGAC（93） PI-42 TCGCTA（46） GACGAT（94） 0020 0021 PI-43 GCTCTC（47） TATGAC（95） PI-44 GTCATG（48） GTGAGC（96） 说 明 书 CN 102758026 A 8 5/19 页 9 PI-45 CTGTGT（49） TACGAG（97） PI-46 GCAGAG（50） ATAGCT（98） PI-47 TATCAG（51） GTATGT（99） PI-48 CTAGTA（52） GATCT

29、A（100） 0022 在本发明中所使用术语 “核酸” 可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸 的聚合物， 包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的 DNA、 RNA。利用根据本发明实施例的 核酸标签， 通过将核酸标签与 DNA 相连， 可以精确地表征 DNA 的样品来源。由此， 利用上述 核酸标签， 可以同时构建多种DNA样品的用于测序的DNA文库， 从而可以通过将来源于不同 样品的DNA文库进行混合， 同时进行测序， 基于核酸标签对DNA序列进行分类， 获得多种DNA 的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术， 例如利用 Hiseq2000 测序技术， 同时对 多种 DNA 进行测序的

30、高通量， 从而提高 DNA 测序的效率和通量， 降低了 DNA 测序成本。这里 所使用的表述方式 “核酸标签与 DNA 相连” 的意思是， 核酸标签可以与 DNA 直接相连， 以构 建 DNA 文库。 0023 为了实现能够有效构建 DNA 文库并进行测序， 所构建的一组核酸标签需要能够保 证结果可靠， 可重复性高。即针对同样的 DNA 样品， 可以保证利用该组核酸标签中的不同标 签构建的 DNA 文库， 能够获得一致的测序结果， 因而可以确保实验结果可靠且重复性高。 0024 本发明的发明人发现 ： 在将携带标签的测序文库进行混合的情况下， 必须考虑到 混合后的标签上的每个碱基位点的 GT

31、含量。因为在高通量测序， 例如在 Hiseq2000 测序过 程中， 碱基 G 和 T 的激发荧光一样， 碱基 A 和 C 的激发光是一样的， 因此必须考虑碱基 “GT” 含量与碱基 “AC” 含量的 “平衡” ， 最适碱基 “GT” 含量为 50， 能保证标签识别率最高和错 误率最低。另外， 还需要同时避免标签序列出现 3 或 3 个以上连续的碱基的出现， 因为 3 个 或 3 个以上连续的碱基会增加序列在合成过程中或测序过程中的错误率， 标签序列本身嵌 入 PCR 引物或接头中， 也要尽可能的避免出现发夹结构或与测序引物及其反向互补序列相 同的现象。 0025 为此， 本发明的发明人进行了

32、大量的筛选工作， 并且选定了根据本发明实施例的 一组分离的核酸标签， 即分别具有 SEQ ID NO:5-100 所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发 现， 所筛选出的这些核酸标签， 能够确保数据的准确性和可重复性， 并且利用根据本发明实 施例的一组分离的核酸标签， 即分别具有SEQ ID NO:5-100所示的核苷酸序列， 不仅能灵活 应用于DNA样品的测序， 也能提高目前DNA样品的测序通量， 而且保证了数据产出的可重复 性和准确性。 另外， 根据本发明的实施例， 发明人将利用不同核酸标签构建的文库与利用标 准的无标签构建的测序文库进行比较， 发现各个核酸标签的 Pearson 系数均在 0.

33、99 左右， 本领域技术人员能够理解， 两者重复性越高， 则其 pearson 系数越接近 1。 0026 高通量测序， 例如HiSeq测序技术具有以下优势 ：（1） 高灵敏度 ： 高通量测序， 例如 HiSeq 的测序通量大， 目前一个实验流程下来可以产生 600G（6000 亿） 碱基的数据， 高的数 据通量可以在测序序列数确定的情况下， 使得每条序列获得高的测序深度， 所以可以检测 到只占病毒总体 1% 的突变株。同时因其测序深度高， 其测序结果也更为可靠。 （2） 高通量， 说 明 书 CN 102758026 A 9 6/19 页 10 低成本 ： 利用根据本发明实施例的标签， 通过

34、一次测序可以检测上万份样本， 从而大大降低 了成本。作为例子， 假设 40 个样品， 每个样品的构建文库的成本大约为 200 元。那么 40 个 样品就是 200X40=8000。如果采用本发明的标签序列， 则可以将 40 个样品混合在一起进行 构架文库， 则其费用就是 200。构建文库是一个耗时间耗人力的工作， 所以这样既减少了试 剂的费用， 又在减少时间和人力消耗。 0027 在本文中所使用的术语 “高通量测序技术” 指的是第二代或单分子测序技术。 第二 代测序平台包括但不限于Illumina-Solexa （GATM,HiSeq2000TM等） 、 ABI-Solid和Roche-454

35、 （焦磷酸测序） 测序平台 ； 单分子测序技术包括但不限于 Helicos 公司的真实单分子测序技 术 （True Single Molecule DNA sequencing） ,Pacific Biosciences公司单分子实时测序 （single molecule real-time(SMRTTM)） ， 以及Oxford Nanopore Technologies公司的纳米 孔测序技术等 （Rusk,Nicole(2009-04-01).Cheap Third-Generation Sequencing.Nature Methods6(4):244-245） 。随着测序技术的不断进化

36、， 本领域技术人员能够理解的是还可以 采用其他的测序方法和装置进行全基因组测序。根据本发明的具体示例， 可以将根据本发 明实施例的核酸标签用于利用选自 Illumina-Solexa、 ABI-SOLiD、 Roche-454 和单分子测 序装置的至少一种进行测序。 0028 确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的方法 0029 根据本发明的实施例， 将核酸标签引入到测序文库中的方法并不受特别限制。既 可以在构建文库的过程中， 按照常规方法， 将标签引入到测序文库中。根据本发明的实施 例， 可以在对待测序的核酸样品进行预处理， 通过 PCR 扩增的方法， 将标签引入到扩增产物 中， 之后通过常

37、规的构建文库的方法， 针对所得到的含有标签的扩增产物构建测序文库， 从 而得到含有标签的测序文库。 由此， 可以在对多种核酸样品进行扩增之后， 就可以混合在一 起， 进行文库构建， 从而容易获得含有各自核酸标签的多种核酸样本的测序文库。 0030 由此， 在本发明的又一方面， 本发明提出了确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的 方法。 0031 参考图 1， 根据本发明的实施例， 该方法包括 ： 0032 S100 ： 使用第一引物组， 对所述 HBV 核酸样本进行扩增， 以便得到第一扩增产物。 0033 根据本发明的实施例， 第一引物组包含第一引物和第二引物， 第一引物具有 SEQ ID N

38、O ： 1所示的核苷酸序列， 第二引物具有SEQ ID NO ： 2所示的核苷酸序列， 并且第一引物 的5 端进一步包含第一标签序列 （即正向标签） ， 所述第一标签序列具有选自如SEQ ID NO ： 5-52 至少之一所示的核苷酸序列， 第二引物的 5 端进一步包含第二标签序列 （即反向标 签） ， 所述第二标签序列具有选自如SEQ ID NO ： 53-100至少之一所示的核苷酸序列。 由此， 通过本发明的第一引物和第二引物能够有效地将核酸标签引入到扩增产物中， 进而能够同 时对多种 HBV 核酸样本进行分析， 充分利用高通量测序仪器的测序能力， 从而有效地降低 了分析 HBV 核酸样本

39、的成本。并且利用这些引物， 能够检测的突变位点为选自 rtL80I/V、 rtI169T、 rtV173L、 rtL180M、 rtA181T/V、 rtN236T、 rtT184G/S/A/I/L/F、 rtA194T、 rtS202I/ G、 rtM204V/I 和 rtM250V/I/L 的至少一种。 0034 根据本发明的实施例， HBV 核酸样本的来源并不受特别限制。根据本发明的一些 具体实施例， HBV 核酸样本是从 HBV 的宿主中分离的。根据本发明的进一步的实施例， 优选 HBV核酸样本是从乙肝患者血清样本中分离的。 由此， 可以有效地对乙肝患者的HBV核酸样 说 明 书 CN

40、 102758026 A 10 7/19 页 11 本进行分型。 0035 根据本发明的实施例， 在使用第一引物组进行扩增之前， 可以首先使用第二引物 组对 HBV 核酸进行扩增， 并将所得到的扩增产物进行使用第一引物组的扩增。由此， 使用第 一引物组， 对所述 HBV 核酸样本进行扩增， 以便得到第一扩增产物进一步包括 ： 0036 首先， 使用第二引物组， 对所述 HBV 核酸样本进行扩增， 以便得到第二扩增产物 ； 以及 0037 接着， 在得到第二扩增产物之后， 使用第一引物组， 对所述第二扩增产物进行扩 增， 以便得到所述第一扩增产物。 根据本发明的实施例， 所述第二引物组包括第三引

41、物和第 四引物， 所述第三引物具有如SEQ ID NO ： 3所示的核苷酸序列， 所述第四引物具有如SEQ ID NO ： 4 所示的核苷酸序列。由此， 可以针对量非常少的 HBV 核酸样本进行有效的扩增， 从而 提高了扩增效率， 进而提高了确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的方法的效率。其中， 上述 各引物的序列如下表 2 所示 ： 0038 表 2 引物序列 0039 引物名称 序列 （SEQ ID NO:） 第一引物 5 -TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3 (1) 第二引物 5 -TGACAGACTTTCCAATCAAT-3 (2) 第三引物 5 -TCCTGCTGGTGG

42、CTCCAGT-3 (3) 第四引物 5 -GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3 (4) 0040 0041 根据本发明的实施例， 在得到第一扩增产物之后， 可以对第一扩增产物进行纯化。 例如， 根据本发明的实施例， 进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、 磁珠纯化和纯化柱纯化 的至少一种分离纯化所得到的第一扩增产物。 0042 S200 ： 对所述第一扩增产物进行测序， 以便得到测序结果。 0043 根据本发明的实施例， 在得到第一扩增产物之后， 对第一扩增产物进行测序可以 进一步包括 ： 针对所述第一扩增产物， 构建测序文库 ； 以及对所述测序文库进行测序， 以便 得到所述测序结果。根据

43、本发明的实施例， 可以进行测序的方法和设备， 并不受特别限制。 根据本发明的实施例， 可以采用选自 Hiseq2000、 SOLID、 454 和单分子测序装置的至少一种 进行所述测序。 由此， 可以充分利用这些测序技术的高通量测序能力， 从而可以极大地降低 测序的成本， 提高测序的效率。 0044 根据本发明的实施例， 针对第一扩增产物构建测序文库的方法并不受特别限制。 可以根据测序平台的制造商所提供的操作手册来进行。 例如， 根据本发明的一个实施例， 针 对第一扩增产物， 构建测序文库进一步包括 ： 0045 首先， 将第一扩增产物片段化， 以便得到 DNA 片段。根据本发明的实施例， 进

44、行片 段化的手段并不受特别限制。根据本发明的实施例， 通过选自化学打断方法和物理打断方 法的至少一种将所述第一扩增产物片段化， 其中所述化学方法包括酶切方法， 所述物理打 说 明 书 CN 102758026 A 11 8/19 页 12 断方法包括超声波打断方法和机械打断方法。 0046 接下来， 在得到 DNA 片段之后， 对 DNA 片段进行末端修复， 以便获得经过末端修复 的 DNA 片段。根据本发明的实施例， 末端修复是利用 Klenow 片段、 T4DNA 聚合酶和 T4 多核 苷酸激酶进行的， 其中， Klenow 片段具有 5 -3 聚合酶活性和 3 -5 外切酶活性， 但缺少

45、 5 -3 外切酶活性。 0047 在得到经过末端修复的 DNA 片段之后， 对经过末端修复的 DNA 片段进行 3 端添加 碱基 A， 以便获得 3 末端添加碱基 A 的 DNA 片段。根据本发明的实施例， 可以利用 Klenow （3 -5 exo-） 对所述经过末端修复的 DNA 片段进行 3 端添加碱基 A。 0048 之后， 将所得到的 3 末端添加碱基 A 的 DNA 片段与接头相连， 以便获得连接产物。 根据本发明的实施例， 将所述 3 末端添加碱基 A 的 DNA 片段与接头相连是利用 T4DNA 连接 酶进行的。 0049 在得到连接产物之后， 对连接产物进行 PCR 扩增，

46、 以便获得第三扩增产物。 0050 最后， 将所得到的第三扩增产物进行纯化回收， 以便获得回收产物， 所述回收产物 构成所述测序文库。 根据本发明的实施例， 可以通过琼脂糖凝胶电泳、 磁珠纯化和纯化柱纯 化的至少一种纯化回收第三扩增产物。 0051 S300 ： 基于所述测序结果， 确定所述 HBV 核酸样本中是否存在突变。 0052 根据本发明的实施例， 在得到测序结果之后， 可以通过将测序结果与参照序列进 行比对， 以便确定所述 HBV 核酸样本中是否存在突变。可以采用的参照序列可以为 HBV 全 基因组序列。根据本发明的实施例， 可以用于检测的突变位点为选自 rtL80I/V、 rtI1

47、69T、 rtV173L、 rtL180M、 rtA181T/V、 rtN236T、 rtT184G/S/A/I/L/F、 rtA194T、 rtS202I/G、 rtM204V/I 和 rtM250V/I/L 的至少一种。 0053 PCR 引物和试剂盒 0054 本发明还提出了一组 PCR 引物。根据本发明的实施例， 该组 PCR 引物包含第一 引物和第二引物， 所述第一引物具有 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列， 所述第二引物具有 SEQ IDNO ： 2 所示的核苷酸序列， 其中， 第一引物的 5 端进一步包括第一标签序列 （即正向 标签） ， 所述第一标签序列具有选自如S

48、EQ ID NO ： 5-52至少之一所示的核苷酸序列， 所述第 二引物的 5 端进一步包含第二标签序列 （即反向标签） ， 所述第二标签序列具有选自如 SEQ IDNO ： 53-100 至少之一所示的核苷酸序列。由此， 利用该组 PCR 引物， 可以有效地实施前述 确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的方法。关于该方法的优点和特征， 前面已经进行了详 细描述， 不再赘述。 0055 根据本发明的实施例， 该组 PCR 引物还可以进一步包括第三引物和第四引物， 所 述第三引物具有如 SEQ ID NO ： 3 所示的核苷酸序列， 所述第四引物具有如 SEQ ID NO ： 4 所 示的核苷酸

49、序列。由此， 可以利用该组 PCR 引物有效地对少量核酸样本进行扩增， 进而实施 前述确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的方法。 0056 根据本发明的实施例， 本发明还提出了一种试剂盒， 该试剂盒包含前面所述的 PCR 引物。该试剂盒可以有效地实施前述确定 HBV 核酸样本中突变位点类型的方法。关于该方 法的优点和特征， 前面已经进行了详细描述， 不再赘述。 0057 由此， 本发明还提出了前面所述试剂盒在检测 HBV 基因的核苷酸突变中的用 途。根据本发明的实施例， 该试剂盒可以检测的突变为选自 rtL80I/V、 rtI169T、 rtV173L、 说 明 书 CN 102758026 A 12 9/19 页 13 rtL180M、 rtA181T/V、 rtN236T、 rtT184G/S/A/I/L/F、 rtA194T、 rtS202I/G、 rtM204V/I 和 rtM250V/I/L 的至少一种。 0058 根据本发明的一个方面， 本发明还提供了一种用于 HBV 检测的试剂盒， 其包括 ： 5 种标签引物， 所述 5 种标签引物分别由 SEQ ID NO ： 1-4 所示的核苷酸构成， 或 48 对核酸标 签， 所述核