生态环境勘察中的微生物采集方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102757901 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757901 A *CN102757901A* (21)申请号 201210135105.9 (22)申请日 2012.04.28 C12N 1/14(2006.01) (71)申请人 中国神华能源股份有限公司 地址 100011 北京市东城区安外西滨河路 22 号神华大厦 申请人 中国矿业大学 （北京） (72)发明人 毕银丽 张凯 (74)专利代理机构 北京邦信阳专利商标代理有 限公司 11012 代理人 王昭林 项京 (54) 发明名称 生态环境勘察中的微生物采集方法 (57) 摘要

2、本发明涉及一种生态环境勘察中的微生物采 集方法。所述微生物采集方法中的微生物为丛枝 菌根真菌， 所述采集方法包括步骤 ： 制作采集菌 袋、 制备供试基质、 将所述供试基质装入所述菌袋 并封闭以及投放所述菌袋。利用本发明的生态环 境勘察中的微生物采集方法， 其中所述菌袋可以 富集孢子和菌丝体， 在很大程度上缩小了筛选范 围并减少了工作量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种生态环境勘察中的微生物采集方法， 所述微生物为丛枝菌根真菌， 所述采集方 法包

3、括以下步骤 ： (1) 制作采集菌袋 ： 选取孔径为 30m 的布作为菌袋材料 ； 用该菌袋材料制成菌袋 ； 所 述菌袋的一端设有开口 ； (2) 制备供试基质 ： 供试基质为目标采集区的土壤， 将所述土壤过孔径为 1mm 的筛子， 然后将过筛后的土壤灭菌并干燥备用 ； (3) 将步骤 (2) 中得到的供试基质装入步骤 (1) 中制作的菌袋中， 填装完毕后， 将所述 菌袋的开口封闭 ； (4) 将步骤 (3) 中得到的装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置， 放置完成后， 覆 盖土壤。 2. 根据权利要求 1 所述的微生物采集方法， 其特征在于， 所述采集方法具体包括以下 步骤 ： (1) 制

4、作采集菌袋 ： 选取孔径为 30m 的尼龙布作为菌袋材料 ； 用该菌袋材料制成菌 袋 ； 所述菌袋的长度为 5 15cm、 宽度为 4 12cm、 厚度为 2 5cm ； 菌袋的一端设有开口 ； (2) 制备供试基质 ： 供试基质为目标采集区的土壤， 将所述土壤过孔径为 1mm 的筛子， 然后将过筛后的土壤灭菌并干燥备用 ； (3)将步骤(2)中得到的供试基质装入步骤(1)中制作的菌袋中， 每个菌袋的填装量为 50 150g， 填装完毕后， 将所述菌袋的开口封闭 ； (4) 将步骤 (3) 中得到的装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置， 所述菌袋的放 置方式为垂直放置， 放置完成后， 覆盖土

5、壤。 3. 根据权利要求 2 所述的微生物采集方法， 其特征在于， 步骤 (4) 中， 装有供试基质的 菌袋紧靠宿主植物根部放置包括 ： 将贴近所述宿主植物根部的土壤挖去， 然后将所述装有 供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置。 4. 根据权利要求 3 所述的微生物采集方法， 其特征在于， 步骤 (1) 中， 所述菌袋的长度 为 1Ocm、 宽度为 8cm、 厚度为 3cm ； 且步骤 (3) 中， 每个菌袋的填装量为 100g。 5. 根据权利要求 4 所述的微生物采集方法， 其特征在于， 步骤 (1) 中， 所述菌袋的一端 具有牵引绳。 6. 根据权利要求 5 所述的微生物采集方法， 其特征

6、在于， 所述牵引绳设置在所述菌袋 具有开口的一端， 并设置在所述具有开口的一端的中部。 7. 根据权利要求 6 所述的微生物采集方法， 其特征在于， 步骤 (2) 中， 所述灭菌是采用 高温高压蒸汽灭菌。 8.根据权利要求17任一项所述的微生物采集方法， 其特征在于， 所述微生物采集方 法进一步包括以下步骤 ： 在所述宿主植物一个生长季后， 除去所述菌袋上部的土壤， 取出所述菌袋， 然后对所述 菌袋内的包括孢子密度、 菌丝密度、 菌丝长度的指标进行测定。 权 利 要 求 书 CN 102757901 A 2 1/4 页 3 生态环境勘察中的微生物采集方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微生

7、物采集方法， 具体涉及一种生态环境勘察中的微生物采集方 法。 背景技术 0002 丛枝菌根真菌 (AMF) 是一种普遍存在的内共生真菌， 它能够与 80以上的陆生植 物形成共生体。 丛枝菌根真菌在维持植物根际生态系统的稳定、 促进植物的生长、 提高宿主 植物的抗逆性和提高退化土壤质量方面起着至关重要的作用。丛枝菌根真菌由菌根孢子 ( 果 )、 丛枝体、 泡囊、 菌丝组成， 它们都可以作为繁殖体。目前， 菌根的分离纯化主要采用孢 子作为供体， 土壤中小孢子果、 孢子和土生辅助细胞通常利用湿筛法采集。 利用单一孢子作 为菌源有诸多不利因素， 首先， 孢子侵染速度中等， 菌种繁殖体数量积累较慢 ；

8、其次， 湿筛过 程中孢子量少的土壤中由于土粒和有机颗粒的干扰， 不容易分离孢子 ； 同时湿筛过程中体 积较大或较小的颗粒可能丢失。虽然利用孢子作为繁殖体可得到纯种， 但是由单一菌源生 产的菌剂在自然界中作用很难实现最大化， 野外环境的改变、 菌种之间的拮抗性和宿主植 物对菌种的选择性等都会对单一菌源造成影响， 由此生产的菌剂野外难以推广应用。丛枝 菌根真菌是专性活体营养寄生菌， 只有在活体植物根上形成菌根后才能繁殖成孢子和孢子 果， 实验室内很难复制菌根和宿主植物之间根际微环境， 加之菌根繁殖体在土壤中的数量、 存活时间、 活性大小、 侵染速率等方面差异性大， 室内难以筛选出适合野外生长菌根菌

9、群。 因此， 在随着菌根在矿区生态重建、 土壤修复以及农业生物肥力等方面越来越广的应用情 况下， 野外原位采集丛枝菌根菌群和利用复合菌群生产菌剂就变的至关重要。 发明内容 0003 针对现有技术中丛枝菌根真菌采集方法的不足， 本发明提供一种生态环境勘察中 的微生物采集方法。 0004 本发明提供一种生态环境勘察中的微生物采集方法， 所述微生物为丛枝菌根真 菌， 所述采集方法包括以下步骤 ： 0005 (1) 制作采集菌袋 ： 选取孔径为 30m 的布作为菌袋材料 ； 用该菌袋材料制成菌 袋 ； 所述菌袋的一端设有开口 ； 0006 (2) 制备供试基质 ： 供试基质为目标采集区的土壤， 将所述

10、土壤过孔径为 1mm 的筛 子， 然后将过筛后的土壤灭菌并干燥备用 ； 0007 (3) 将步骤 (2) 中得到的供试基质装入步骤 (1) 中制作的菌袋中， 填装完毕后， 将 所述菌袋的开口封闭 ； 0008 (4) 将步骤 (3) 中得到的装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置， 放置完成 后， 覆盖土壤。 0009 优选地， 所述微生物采集方法具体包括以下步骤 ： 0010 (1)制作采集菌袋 ： 选取孔径为30m的尼龙布作为菌袋材料 ； 用该菌袋材料制成 说 明 书 CN 102757901 A 3 2/4 页 4 菌袋 ； 所述菌袋的长度为 5 15cm、 宽度为 4 12cm、 厚度

11、为 2 5cm ； 菌袋的一端设有开 口 ； 0011 (2) 制备供试基质 ： 供试基质为目标采集区的土壤， 将所述土壤过孔径为 1mm 的筛 子， 然后将过筛后的土壤灭菌并干燥备用 ； 0012 (3)将步骤(2)中得到的供试基质装入步骤(1)中制作的菌袋中， 每个菌袋的填装 量为 50 150g， 填装完毕后， 将所述菌袋的开口封闭 ； 0013 (4) 将步骤 (3) 中得到的装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置， 所述菌袋 的放置方式为垂直放置， 放置完成后， 覆盖土壤。 0014 步骤 (4) 中， 装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置包括 ： 将贴近所述宿主 植物根部的土壤挖

12、去， 然后将所述装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置。 0015 步骤 (1) 中， 所述菌袋具有防腐功能， 即在宿主植物的一个生长季中， 该菌袋在土 壤中不会腐烂。 0016 优选地， 步骤(1)中， 所述菌袋的长度为10cm、 宽度为8cm、 厚度为3cm ； 且步骤(3) 中， 每个菌袋的填装量为 100g。 0017 优选地， 步骤 (1) 中， 所述菌袋的一端具有牵引绳。采集时， 所述牵引绳系在宿主 植物的茎干部， 便于回收所述菌袋。 0018 本领域技术人员可以理解， 为了方便， 所述牵引绳优选设置在所述菌袋具有开口 的一端。 0019 进一步地， 为了使得所述菌袋能够垂直放置，

13、 所述牵引绳更优选设置在开口的一 端的中部。 0020 步骤 (2) 中， 所述灭菌可以采用本领域技术人员已知的任何方式进行 ； 优选地， 所 述灭菌采用高温高压蒸汽灭菌。 0021 步骤 (3) 中， 所述开口的封闭可以采用本领域技术人员已知的任何方式进行， 例 如采用缝合的方式将开口封闭。 0022 本发明提供的生态环境勘察中的微生物采集方法， 进一步包括以下步骤 ： 0023 在所述宿主植物一个生长季后， 除去所述菌袋上部的土壤， 取出所述菌袋， 然后对 所述菌袋内的包括孢子密度、 菌丝密度、 菌丝长度的指标进行测定。 这些测定方法可以采用 本领域技术人员已知的任何方法进行， 例如孢子密

14、度采用湿筛倾注法、 菌丝密度采用网格 交叉法。 0024 本发明的生态环境勘察中的微生物采集方法， 利用孔径为 30m 的尼龙布制作菌 袋采集菌丝体和孢子。 菌丝体直径为37m， 这样菌丝体可自由进入菌袋， 而宿主植物根 系等很难进入， 此种情况下， 宿主植物局部根系为获得养分， 就迫使其共生体菌根及其附属 物进入菌袋。 菌袋中的供试基质经过过筛和灭菌， 一定程度改善了供试基质的质地， 同时排 除了其它微生物的干扰， 更有利于菌根及其附属物的生长。 现有技术中， 丛枝菌根分离每样 需采集土样 1.5 2kg， 然后在从这些土样中分离孢子， 这样工作量往往较大。利用本发明 的生态环境勘察中的微生

15、物采集方法采集丛枝菌根很大程度解决了野外丛枝菌根采集的 难题， 菌袋内的供试基质只有约 100g， 同时人为地改变了菌袋内供试基质的理化性状及其 质地， 更有利于孢子和菌丝体的富集， 这样很大程度上缩小了筛选范围并减少了工作量。 利 用本发明的生态环境勘察中的微生物采集方法， 其中所述菌袋可以富集孢子和菌丝体， 并 说 明 书 CN 102757901 A 4 3/4 页 5 将其作为菌剂生产的菌源， 这就为野外生产丛枝菌根菌剂提供技术支持， 也为菌剂在不同 区域内推广应用提供理论基础。 具体实施方式 0025 下面的实施例仅用于解释本发明， 而非限制本发明。 0026 尼龙布购自北京市崇文振

16、兴金属丝网商店， 孔径为 30m。 0027 孢子密度采用湿筛倾注法进行测定 ； 菌丝密度采用网格交叉法进行测定。 0028 实施例 1 ： ( 陕西榆林活鸡兔矿塌陷区丛枝菌根真菌的原位采集 ) 0029 选取孔径为 30m 的尼龙布作为菌袋材料。该菌袋具有防腐功能， 在宿主植物的 一个生长季中， 该菌袋在土壤中不会腐烂。菌袋的长度为 10cm、 宽度为 8cm， 菌袋的厚度为 3cm ； 菌袋的一端设有开口 ； 开口端的中部设有牵引绳。 0030 供试基质采集地点位于陕西榆林神木县大柳塔镇高家畔， 属于神东矿区活鸡兔矿 采空塌陷区， 供试基质为该塌陷区的退化土壤， 并过孔径为 1mm 的筛子

17、， 过筛后的土壤在装 入上述菌袋前经高温高压蒸汽灭菌 (121， 2h)， 自然风干。 0031 将上述供试基质装入上述菌袋中， 每个菌袋装入供试基质 100g， 填装完毕后， 将所 述菌袋的开口缝合。 0032 宿主植物为紫穗槐， 紫穗槐选自活鸡兔矿塌陷区微生物复垦示范基地。供试紫穗 槐的平均株高为 43.3cm， 冠幅为 26cm。 0033 试验于 2011 年 4 月 17 日进行， 此时神东矿区的土壤已融冻， 宿主植物处于返青季 节。试验设计 20 个重复， 即选择 20 株紫穗槐作为宿主植物， 按照 S 型曲线选取紫穗槐， 所 选择的 20 株紫穗槐大小相近。将贴近紫穗槐根部的土壤

18、挖去， 然后将上述装有供试基质的 菌袋紧靠紫穗槐根部垂直放置， 放置深度为 15cm， 放置完成后覆盖土壤， 并将菌袋的牵引绳 系在紫穗槐的茎干部， 以便回收菌袋。 0034 10 月初取回所述菌袋并采集宿主植物根际土壤。10 月正是研究区冰冻季节， 该区 的植物已停止生长， 本试验是宿主植物的一个生长季。对采集的根际土壤和回收的菌袋内 供试基质进行测定。宿主植物根际土壤中孢子密度、 菌丝密度和 100g 土壤菌丝长度分别为 15 个 /g、 3.19m g-1和 319m。对回收的菌袋内的孢子密度、 菌丝密度和菌丝长度进行测定， 菌袋内的孢子密度高达 33 个 /g、 菌丝密度为 6.04m

19、g-1、 菌袋内总菌丝长度为 604m。所述 菌袋内的孢子密度和菌丝密度要比紫穗槐根际土壤分别高出 18 个 /g 和 2.85mg-1。说明 本发明的微生物采集方法可以大大提高野外丛枝菌根真菌的采集量和采集速度。 0035 实施例 2 ： ( 神东矿区补连塔矿塌陷区丛枝菌根真菌的原位采集 ) 0036 选取孔径为 30m 的尼龙布作为菌袋材料。该菌袋具有防腐功能， 在宿主植物的 一个生长季中， 该菌袋在土壤中不会腐烂。菌袋的长度为 10cm、 宽度为 8cm， 菌袋的厚度为 3cm ； 菌袋的一端设有开口 ； 开口端的中部设有牵引绳。 0037 试验地选在神东矿区补连塔矿， 供试基质为该矿塌

20、陷区退化土壤， 并过孔径为 1mm 的筛子， 过筛后的土壤经高温高压蒸汽灭菌 (121， 2h)， 自然风干。 0038 将上述供试基质装入上述菌袋中， 每个菌袋装入供试基质 100g， 填装完毕后， 将所 述菌袋的开口缝合。 0039 宿主植物为沙柳。沙柳的平均株高为 136.5cm， 冠幅为 96.2cm。 说 明 书 CN 102757901 A 5 4/4 页 6 0040 试验于 2011 年 4 月 18 日进行， 此时神东矿区的土壤已融冻， 宿主植物处于返青季 节。试验设计 20 个重复， 即选择 20 株沙柳作为宿主植物， 按照 S 型曲线选取紫穗槐， 所选 择的 20 株紫穗

21、槐大小相近。将贴近沙柳根部的土壤挖去， 然后将上述装有供试基质的菌袋 紧靠沙柳根部垂直放置， 放置深度为 15cm， 放置完成后覆盖土壤， 并将菌袋的牵引绳系在沙 柳的茎干部， 以便回收菌袋。 0041 10 月初取回所述菌袋并采集宿主植物根际土壤， 对回收的菌袋内的供试基质和沙 柳根际土壤中孢子密度、 菌丝密度和 100g 土壤中菌丝长度进行测定。结果， 菌袋内的孢子 密度、 菌丝密度和菌丝长度分别达到21个/g、 4.74m g-1和4.74m， 而根际土壤中孢子密度、 菌丝密度和菌丝长度分别为 11 个 /g、 1.91mg-1和 1.91m。所述菌袋内的孢子密度和菌丝 密度要比沙柳根际

22、土壤高出 10 个 /g 和 2.83mg-1。说明本发明的微生物采集方法可以显 著提高野外丛枝菌根真菌的采集率， 缩短丛枝菌根真菌的采集时间。 0042 实施例 3 ： ( 宁夏煤矸石山复垦区丛枝菌根真菌的原位采集 ) 0043 选取孔径为 30m 的尼龙布作为菌袋材料。该菌袋具有防腐功能， 在宿主植物的 一个生长季中， 该菌袋在土壤中不会腐烂。菌袋的长度为 10cm、 宽度为 8cm， 菌袋的厚度为 3cm ； 菌袋的一端设有开口 ； 开口端的中部设有牵引绳。 0044 试验地点在宁夏大武口洗煤厂煤矸石山， 该地位于宁夏回族自治区石嘴山市， 属 于中温带干旱气候区， 降水稀少而集中， 光照

23、充足， 蒸发强烈， 空气干燥， 极不利于植物的生 长。本试验地点选择煤矸石山上， 煤矸石山上铺了 0.8 1m 厚的河沙作为生长基质， 试验 区为中国矿业大学 ( 北京 ) 矿区微生物复垦示范基地。 0045 供试基质为矸石山上废弃砂质， 并过孔径为 1mm 的筛子， 过筛后经高温高压蒸汽 灭菌 (121， 2h)， 自然风干。 0046 将上述供试基质装入上述菌袋中， 每个菌袋装入供试基质 100g， 填装完毕后， 将所 述菌袋的开口缝合。 0047 宿主植物是当地先锋植株白蜡， 白蜡的平均株高为 217cm， 冠幅为 151cm。 0048 试验于 2011 年 4 月 25 日进行， 此

24、时宁夏地区的土壤已融冻， 宿主植物处于返青季 节。试验设计 20 个重复， 即选择 20 株白蜡作为宿主植物， 按照 S 型曲线选取白蜡， 所选择 的 20 株白蜡大小相近。将贴近白蜡根部的土壤挖去， 然后将上述装有供试基质的菌袋紧靠 白蜡根部垂直放置， 放置深度为 15cm， 放置完成后覆盖土壤， 并将菌袋的牵引绳系在白蜡的 茎干部， 以便回收菌袋。 0049 10 月初取回菌袋并采集宿主植物根际土壤， 对回收菌袋内的供试基质和白蜡根际 土壤孢子密度、 菌丝密度和 100g 土壤中菌丝长度进行测定。结果， 菌袋内孢子密度、 菌丝密 度和菌丝长度分别为 28 个 /g、 5.66mg-1和 566m， 而白蜡根际土壤中孢子密度、 菌丝密度 和菌丝长度分别为 13 个 /g、 2.81mg-1和 281m。所述菌袋内的孢子密度和菌丝密度要比 白蜡根际土壤高出 15 个 /g 和 2.85mg-1。说明本发明的微生物采集方法可以显著提高野 外丛枝菌根真菌的采集率， 缩短丛枝菌根真菌的采集时间。 0050 本领域技术人员可以理解， 在本说明书的教导之下， 可以对本发明做出一些修改 或变化。这些修改和变化也应当在本发明权利要求所限定的范围之内。 说 明 书 CN 102757901 A 6