一种检测基因序列的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102766688 A (43)申请公布日 2012.11.07 CN 102766688 A *CN102766688A* (21)申请号 201210232601.6 (22)申请日 2012.07.06 201210112541.4 2012.04.17 CN 201210112557.5 2012.04.17 CN C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 盛司潼 地址 518057 广东省深圳市南山区高新区科 技中二路软件园 11 栋 402 室 (72)发明人 盛司潼 (54) 发明名称 一种检测基因序列

2、的方法 (57) 摘要 本发明涉及生物基因工程领域， 提供了一种 检测基因序列的方法。所述方法， 包括以下步骤 ： 将第一锚定引物锚定结合于含基因序列的待测 核酸片段的第一接头上， 使用连接测序法读取第 一锚定引物延伸末端后的 M 个核苷酸的序列信 息 ； 利用内切酶将已读取序列信息的核苷酸部分 或完全切除， 并在酶切产物上连接第二接头， 得新 的待测核酸片段 ； 然后在新的待测核酸片段的第 二接头上锚定第二锚定引物， 再利用连接测序法 读取第二锚定引物延伸末端后 N 个核苷酸的序列 信息 ； 更换试剂， 重复上述酶切、 接头连接、 锚定 引物结合、 连接测序等步骤， 得所需的基因序列信 息

3、； 本发明通过酶切延伸测序方法实现了增加检 测基因序列的测序读长的目的。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 25 页 序列表 29 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 25 页 序列表 29 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 一种检测基因序列的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： A. 将第一锚定引物锚定结合于含基因序列的待测核酸片段的第一接头上 ； B. 在第一锚定引物延伸末端分别连接带不同位置标记的荧光探针， 并检测相应的连接 产物的荧光信号， 得到第一锚定引物延伸末端后

4、 M 个核苷酸的序列信息 ； C. 利用内切酶将步骤 B 中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除， 得到带有含有待 测序片段的酶切产物 ； D. 酶切产物连接第二接头得到新的含基因序列的待测核酸片段， 将第二锚定引物结合 于新的含基因序列的待测核酸片段的第二接头上 ； E. 在第二锚定引物延伸末端分别连接带不同位置标记的荧光探针， 并检测相应的连接 产物的荧光信号， 得到第二锚定引物延伸末端后 N 个核苷酸的序列信息 ； F. 更换试剂， 对前一步骤的产物进行酶切、 接头连接、 锚定引物结合、 荧光探针连接和 荧光信号检测 ； G. 重复步骤 F， 直至得到含基因序列的待测核酸片段中所需的基因

5、序列信息 ； 其中， M、 N 均为正整数 ； 所述基因为等位基因或抗肿瘤药物相关基因。 2.根据权利要求1所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 步骤A中所述第一锚定引 物带有含有至少一个酶切识别位点。 3. 根据权利要求 2 所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 所述步骤 C 包括以下步 骤 ： C1. 将步骤 B 中连接的荧光探针与第一锚定引物洗脱， 重置第一锚定引物并进行链延 伸， 与含基因序列的待测核酸片段形成双链核酸分子 ； C2. 内切酶通过识别第一锚定引物上所带的酶切识别位点并进行酶切， 将步骤 B 中已 得到序列信息的核苷酸部分或完全切除， 得到含有待测序片段的酶切产物

6、。 4. 根据权利要求 1 所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 步骤 C 包括以下步骤 ： C1 . 在第一锚定引物的另一端连接双链的第三接头， 该第三接头带有含有至少一个酶 切识别位点 ； C2 . 利用内切酶识别第三接头所带的酶切识别位点， 将步骤 B 中已得到序列信息的核 苷酸部分或完全切除， 得到含有待测序片段的酶切产物。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 所述第一锚 定引物带有含有至少一个特异性残基和 / 或一端是封闭的。 6. 根据权利要求 5 所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 所述步骤 B 包括以下步 骤 ： B1. 在带有含有

7、特异性残基的第一锚定引物延伸末端连接带特定位置标记的荧光探 针， 检测相应的连接产物的荧光信号， 得到对应位置的核苷酸序列信息 ； B2. 以特异性切割剂切割特异性残基， 将前一步骤中连接的荧光探针及第一锚定引物 洗脱， 重置第一锚定引物 ； B3. 在第一锚定引物延伸末端重复带特定位置标记的荧光探针的连接和检测相应连接 产物的荧光信号的操作， 得到第一锚定引物延伸末端后 M 个核苷酸的序列信息。 7.根据权利要求1所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 步骤A中所述含基因序列 的待测核酸片段固定于固相载体表面。 权 利 要 求 书 CN 102766688 A 2 2/2 页 3 8. 根

8、据权利要求 7 所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 在步骤 A 之前还包括步 骤 ： A0. 利用固相载体对基因序列进行扩增， 得到固定于固相载体表面的含基因序列的待 测核酸片段。 9. 根据权利要求 8 所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 所述步骤 A0 包括以下步 骤 ： A01. 将用于扩增的含基因序列的核酸片段固定于固相载体表面， 得到表面带有含有至 少一个含基因序列的核酸片段的固相载体 ； A02. 将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点， 得到固定有引物的扩增载体 ； A03. 对扩增载体上的核酸片段进行扩增， 得到固定于固相载体表面的含基因序列的待 测核酸片段。 1

9、0. 根据权利要求 9 所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 步骤 A02 中所述引物包 括用于对所述含基因序列的待测核酸片段进行扩增的上游引物和 / 或下游引物， 所述上游 引物是与含基因序列的待测核酸片段 5 端互补结合的核酸序列， 所述下游引物是与含基因 序列的待测核酸片段 3 端序列相同的核酸序列。 11. 根据权利要求 9 所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 步骤 A03 中所述的扩增 是单分子扩增。 12. 根据权利要求 9 所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 所述步骤 A02 中引物结 合于固相载体表面的方式为 ： 引物与固相载体表面携带的基团进行配对连接， 实现

10、直接结合 ； 或通过连接子携带的基团分别与引物和固相载体表面携带的基团进行配对连接， 实现 间接结合。 13. 根据权利要求 12 所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 所述配对连接的方式 采用生物素-亲和素/链霉亲和素、 纳米金/碘乙酰-巯基、 氨基-醛基/羧基/异硫氰基、 丙烯酰胺 - 硅烷基 / 聚丙烯酰胺中的至少一种。 14.根据权利要求1至4、 7至13中任一项所述的检测基因序列的方法， 其特征在于， 所 述等位基因包括 F8、 F9、 FGFR3、 IDS、 GALT、 HBB、 HBA1、 HBA2、 ATP7B、 PHEX、 GJB2、 COL4A5、 LMNA 中的至少一

11、个， 所示抗肿瘤药物相关基因包括 CYP2C9、 VKORC1、 KIT、 PDGFRA、 CYP2C19、 DHFR、 GSTM1、 MTHFR、 RFC1、 CYP19A1、 UGT1A1、 UGT1A7、 UGT1A9、 ABCB1、 CYP2D6、 CYP3A5、 SULT1A1、 UGT2B15、 GSTA1、 SOD2、 CYP2B6、 GSTP1、 MDR1、 BCRP、 p53、 CAT、 CBR1、 CBR3、 EGFR、 KRAS、 BRAF 中的至少一个。 权 利 要 求 书 CN 102766688 A 3 1/25 页 4 一种检测基因序列的方法 技术领域 0001

12、本发明涉及生物基因工程领域， 更具体地说， 涉及一种检测基因序列的方法。 背景技术 0002 目前， 针对基因序列进行检测的金标准是测序方法， 常见的是 sanger 测序法和焦 磷酸测序法 （Pyrosequencing） ， 其中焦磷酸测序法适用于高通量分析。利用焦磷酸测序法 进行测序时， 连接有测序片段的磁珠被固定于蚀刻光纤玻片 （PTP 板） 的小孔中。由于小孔 较大 （55m44m） ， 因此， 为了使测序时磁珠位置固定不变， 需要向小孔中填充含有多种 蛋白的复合物， 以保证测序反应和采图的顺利进行， 再加上荧光素酶的使用， 这些因素导致 焦磷酸测序法的成本很高。 0003 为使测序

13、成本降低， 现有技术采用连接测序法代替焦磷酸测序法进行测序。现有 的一种连接测序法是利用内切酶酶切延伸进行测序的， 如图 1 所示， 该方法的步骤包括 ： （1） 利用含有酶切识别位点的双链寡核苷酸接头一与核酸片段连接， 得到待测核酸片段 ； （2） 以识别酶切识别位点的限制性内切酶对待测核酸片段进行酶切， 得到其中一条链含有 突出末端的双链产物 ；（3） 在双链产物上连接一组对应特定位置含有荧光标记的双链接头 二， 得到连接产物 ； 通过检测连接产物的荧光信号获取该特定位置对应的核苷酸序列信息 ； 其中， 双链接头二含有突出末端， 还含有酶切识别位点 ； 根据酶切识别位点与酶切位点之间 的核

14、苷酸个数， 所述突出末端预先计算好一个或数个核苷酸 ；（4） 分离步骤 （3） 中的连接产 物， 得到分离产物 ；（5） 利用能识别步骤 （3） 中所带酶切识别位点的酶对分离产物进行酶 切， 得到含有酶切识别位点的一组片段 ；（6） 重复步骤 （3） 至 （5） 的操作， 直至测得待测核酸 片段上能测的所有核苷酸序列 ； 其中最后一次重复操作时， 可以忽略步骤 （5） 。 0004 在上述连接测序法中， 利用含有荧光标记的双链寡核苷酸接头作为检测探针， 以 接头上所带酶切识别位点位置的变更来实现和控制测序位置的延伸推进。 若使用该方法检 测含基因序列的核酸片段， 会因为双链寡核苷酸接头核苷酸个

15、数以及所使用的限制性内切 酶识别位点与酶切位点之间的核苷酸个数限制， 使得所能检测得到的基因序列信息最多只 能等于酶切识别位点与酶切位点之间的核苷酸个数， 其读长严重受限制， 不利于含基因序 列的核酸片段的检测与分析。 0005 因此， 需要一种新的检测基因序列的方法， 能够增加对基因序列进行检测时的测 序读长。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种检测基因序列的方法， 旨在解决现有技术用连接测序 法检测基因序列时读长过短的问题。 0007 为了实现发明目的， 一种检测基因序列的方法包括以下步骤 ： A. 将第一锚定引物锚定结合于含基因序列的待测核酸片段的第一接头上 ； B. 在第一锚

16、定引物延伸末端分别连接带不同位置标记的荧光探针， 并检测相应的连接 说 明 书 CN 102766688 A 4 2/25 页 5 产物的荧光信号， 得到第一锚定引物延伸末端后 M 个核苷酸的序列信息 ； C. 利用内切酶将步骤 B 中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除， 得到含有待测序 片段的酶切产物 ； D. 酶切产物连接第二接头得到新的含基因序列的待测核酸片段， 将第二锚定引物结合 于新的含基因序列的待测核酸片段的第二接头上 ； E. 在第二锚定引物延伸末端分别连接带不同位置标记的荧光探针， 并检测相应的连接 产物的荧光信号， 得到第二锚定引物延伸末端后 N 个核苷酸的序列信息 ； F

17、. 更换试剂， 对前一步骤的产物进行酶切、 接头连接、 锚定引物结合、 荧光探针连接和 荧光信号检测 ； G. 重复步骤 F， 直至得到含基因序列的待测核酸片段中所需的基因序列信息 ； 其中， M、 N 均为正整数 ； 所述基因为等位基因或抗肿瘤药物相关基因。 0008 其中， 步骤 A 中所述第一锚定引物含有至少一个酶切识别位点。 0009 进一步的， 所述步骤 C 可以包括以下步骤 ： C1. 将步骤 B 中连接的荧光探针与第一锚定引物洗脱， 重置第一锚定引物并进行链延 伸， 与含基因序列的待测核酸片段形成双链核酸分子 ； C2. 内切酶通过识别第一锚定引物上所带的酶切识别位点并进行酶切，

18、 将步骤 B 中已 得到序列信息的核苷酸部分或完全切除， 得到含有待测序片段的酶切产物。 0010 其中， 步骤 C 包括以下步骤 ： C1 . 在第一锚定引物的另一端连接双链的第三接头， 该第三接头含有至少一个酶切识 别位点 ； C2 . 利用内切酶识别第三接头所带的酶切识别位点， 将步骤 B 中已得到序列信息的核 苷酸部分或完全切除， 得到含有待测序片段的酶切产物。 0011 上述任一方案中， 所述第一锚定引物含有至少一个特异性残基和 / 或一端是封闭 的。 0012 进一步的， 所述步骤 B 包括以下步骤 ： B1. 在含有特异性残基的第一锚定引物延伸末端连接带特定位置标记的荧光探针，

19、检 测相应的连接产物的荧光信号， 得到对应位置的核苷酸序列信息 ； B2. 以特异性切割剂切割特异性残基， 将前一步骤中连接的荧光探针及第一锚定引物 洗脱， 重置第一锚定引物 ； B3. 在第一锚定引物延伸末端重复带特定位置标记的荧光探针的连接和检测相应连接 产物的荧光信号的操作， 得到第一锚定引物延伸末端后 M 个核苷酸的序列信息。 0013 上述任一方案中， 步骤 A 中所述含基因序列的待测核酸片段固定于固相载体表 面。 0014 进一步的， 在步骤 A 之前还可以包括步骤 ： A0. 利用固相载体对基因序列进行扩增， 得到固定于固相载体表面的含基因序列的待 测核酸片段。 0015 其中，

20、 所述步骤 A0 包括以下步骤 ： A01. 将用于扩增的含基因序列的核酸片段固定于固相载体表面， 得到表面含有至少一 个含基因序列的核酸片段的固相载体 ； 说 明 书 CN 102766688 A 5 3/25 页 6 A02. 将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点， 得到固定有引物的扩增载体 ； A03. 对扩增载体上的核酸片段进行扩增， 得到固定于固相载体表面的含基因序列的待 测核酸片段。 0016 其中， 步骤 A02 中所述引物包括用于对所述含基因序列的待测核酸片段进行扩增 的上游引物和 / 或下游引物， 所述上游引物是与含基因序列的待测核酸片段 5 端互补结合 的核酸序列， 所

21、述下游引物是与含基因序列的待测核酸片段 3 端序列相同的核酸序列。 0017 其中， 步骤 A03 中所述的扩增是单分子扩增。 0018 其中， 所述步骤 A02 中引物结合于固相载体表面的方式为 ： 引物与固相载体表面 携带的基团进行配对连接， 实现直接结合 ； 或通过连接子携带的基团分别与引物和固相载 体表面携带的基团进行配对连接， 实现间接结合。 0019 进一步的， 所述配对连接的方式采用生物素 - 亲和素 / 链霉亲和素、 纳米金 / 碘乙 酰 - 巯基、 氨基 - 醛基 / 羧基 / 异硫氰基、 丙烯酰胺 - 硅烷基 / 聚丙烯酰胺中的至少一种。 0020 其中， 所述等位基因包括

22、 F8、 F9、 FGFR3、 IDS、 GALT、 HBB、 HBA1、 HBA2、 ATP7B、 PHEX、 GJB2、 COL4A5、 LMNA 中的至少一个。 0021 其中， 所示抗肿瘤药物相关基因包括 CYP2C9、 VKORC1、 KIT、 PDGFRA、 CYP2C19、 DHFR、 GSTM1、 MTHFR、 RFC1、 CYP19A1、 UGT1A1、 UGT1A7、 UGT1A9、 ABCB1、 CYP2D6、 CYP3A5、 SULT1A1、 UGT2B15、 GSTA1、 SOD2、 CYP2B6、 GSTP1、 MDR1、 BCRP、 p53、 CAT、 CBR1、

23、 CBR3、 EGFR、 KRAS、 BRAF 中的至少一个。 0022 由上可知， 本发明所述检测基因序列的方法， 利用内切酶将含有基因序列的待测 核酸片段上已经得到序列信息的核苷酸部分或完全切除， 然后再连接新的接头， 锚定新的 锚定引物并进行荧光探针的连接和荧光信号的检测， 向前延伸读取核苷酸序列， 从而增加 了检测基因序列时的测序读长。 附图说明 0023 图 1 是现有技术中一种利用内切酶酶切延伸测序的连接测序法示意图。 0024 图 2 是本发明一个实施例中检测基因序列的方法流程图。 0025 图 3 是本发明一个实施例中所用第一 anchor 的结构示意图。 0026 图 4 是

24、本发明另一个具体实施方式中第一 anchor 的结构示意图。 0027 图 5 是本发明另一个具体实施方式中第一 anchor 的结构示意图。 0028 图 6 是本发明另一个实施例中得到第二 anchor 延伸末端后 N 个核苷酸的序列信 息的方法示意图。 0029 图 7 是本发明一个实施例中利用酶切延伸测序检测基因序列的方法示意图。 具体实施方式 0030 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 0031 图 2 示出了本发明一个实施例中检测基因序列的方法流程， 该方法包括以下步 骤 ： S1. 将第一锚定引物锚定结合于

25、含基因序列的待测核酸片段的第一接头上 ； 说 明 书 CN 102766688 A 6 4/25 页 7 S2. 在第一锚定引物延伸末端分别连接带不同位置标记的荧光探针， 并检测相应的连 接产物的荧光信号， 得到第一锚定引物延伸末端后 M 个核苷酸的序列信息 ； S3. 利用内切酶将步骤 S2 中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除， 得到含有待测 序片段的酶切产物 ； S4. 酶切产物连接第二接头得到新的含基因序列的待测核酸片段， 将第二锚定引物结 合于新的含基因序列的待测核酸片段的第二接头上 ； S5. 在第二锚定引物延伸末端分别连接带不同位置标记的荧光探针， 并检测相应的连 接产物的荧光

26、信号， 得到第二锚定引物延伸末端后 N 个核苷酸的序列信息 ； S6. 更换试剂， 对前一步骤的产物进行酶切、 接头连接、 锚定引物结合、 荧光探针连接和 荧光信号检测 ； S7. 重复步骤 S6， 直至得到含基因序列的待测核酸片段中所需的基因序列信息 ； 其中， M、 N 均为正整数 ； 所述基因为等位基因或抗肿瘤药物相关基因。 0032 本发明所记载的检测基因序列的技术方案， 其优势在于， 在进行测序反应检测含 基因序列的待测核酸片段中的基因序列时， 利用内切酶将含基因序列的待测核酸片段上已 经读取过序列信息的核苷酸部分或完全切除， 然后再在含有待测序核酸序列的核酸片段上 连接新的接头，

27、锚定新的锚定引物并进行新荧光探针的连接和相应荧光信号的检测， 实现 向前延伸读取更多的核苷酸序列， 从而增加了运用连接测序法检测基因序列的测序读长。 0033 需要说明的是， 本发明所述等位基因是指位于同源染色体的同一位置上控制着某 一性状的不同形态的基因。 若同源染色体上同一位置上控制着某一性状的基因的类型在两 个以上， 该等位基因就称为复等位基因。任何一个二倍体个体至多只存在复等位基中的二 个不同的等位基因。等位基因之间存在相互作用， 当等位基因中的一种类型决定生物性状 的作用强于另一种， 并使生物只表现出该种类型自身的性状时， 就出现了显隐性关系。 作用 强的是显性， 作用被掩盖而不能表

28、现的为隐性。 一对呈显隐性关系的等位基因， 显性完全掩 盖隐性的是完全显性， 两者相互作用而出现了介于两者之间的中间性状， 如红花基因和白 花基因的杂合体的花是粉红色， 这是不完全显性。有些情况下， 一对等位基因的作用相等， 互不相让， 杂合子就表现出两个等位基因各自决定的性状， 这称为共显性。 对于研究较多的 等位基因， 通过对它的检测， 可对该等位基因来源的生物体的一些性状做出预测。 将等位基 因检测与其它分子生物学实验 （例如基因敲除、 点突变、 RNA 干扰等） 结合， 并进一步结合对 某一或某些生物性状的观察和数理统计分析， 可对等位基因中各类型的基因之间、 各类型 的基因与相对应的

29、生物性状之间的关系进行更深入的研究。 0034 药物反应的个体差异是临床上极其普遍的现象， 产生这种差异的原因主要分为非 遗传因素和遗传因素。 非遗传因素和遗传因素的不同可能导致同一个体对同一种药物的反 应出现量甚至是质的差别。 其中， 非遗传因素包括性别、 年龄、 体重、 疾病进展等在内的多种 因素 ； 遗传因素主要是指与药物在体内的代谢、 转化、 信号传输等相关的基因的序列信息。 对遗传因素和非遗传因素的研究有可能实现个性化医疗。 这些基因的序列信息包括了大量 的生物学信息， 获得这些基因的序列信息只是对遗传因素研究的第一步， 还需结合进一步 的研究， 例如 ： 生物学试验、 临床试验、

30、临床观察以及综合数据的统计分析等， 甚至还需建立 各种疾病模型或数学模型， 才有可能得到这些基因的序列信息所包含的部分生物学信息， 即实现对遗传因素的研究。 说 明 书 CN 102766688 A 7 5/25 页 8 0035 本发明所述抗肿瘤药物相关基因是指与抗肿瘤药物在体内的代谢、 转化、 信号传 输等相关的基因。 0036 本发明所述检测基因序列的方法， 检测得到的检测结果只是基因序列的核酸序列 信息， 也即等位基因或抗肿瘤药物相关基因的核酸序列信息。当检测得到的是等位基因的 核酸序列信息时， 可将该方法与其它分子生物学实验 （例如基因敲除、 点突变、 RNA 干扰等） 结合， 并进

31、一步结合对某一或某些生物性状的观察和数理统计分析， 可对等位基因中各类 型的基因之间、 各类型的基因与相对应的生物性状之间的关系进行更深入的研究。当检测 得到的是抗肿瘤药物相关基因的核酸序列信息， 可将该方法与其它分子生物学实验 （例如 基因敲除、 点突变、 RNA 干扰等） 、 临床试验、 临床观察以及综合数据的统计分析等结合， 甚至 还需建立各种药物效果的模型或数学模型， 才有可能实现对相关抗肿瘤药物疗效的预测。 0037 本发明所述检测基因序列的方法， 是针对已经脱离人体或动物体的组织、 体液或 排泄物的样品进行处理或检测。即， 所述含基因序列的待测核酸片段来源于 ： 血液、 口腔上 皮

32、刮取样、 唾液、 尿液、 石蜡包埋组织或穿刺组织。 0038 本发明所述带不同位置标记的荧光探针， 可根据所带标记的位置的不同而分成不 同的组。所述位置标记可为荧光标记。 0039 所述荧光标记的种类可为一种、 两种、 四种或更多。 0040 当荧光标记只有一种时， 为了区分同一位置上的不同碱基， 对同一位置上的碱基， 需在锚定引物的延伸末端重复进行 4 次连接反应和荧光信号检测， 每次连接反应中， 荧光 探针是对应某一特定位置上的某一种碱基 （A、 G、 C 或 T） 而含有荧光标记的探针。为了实现 对 x 个位置的碱基的检测， 则需要重复进行 4x 次连接反应和荧光探针的检测。 0041

33、当荧光标记有两种时， 为了区分同一位置上的不同碱基， 对同一位置上的碱基， 需 在锚定引物的延伸末端重复进行 2 次连接反应和荧光信号检测， 每次连接反应中， 荧光探 针是对应某一特定位置上的某两种碱基 （A、 G、 C 或 T） 而含有荧光标记的探针。为了实现对 x 个位置的碱基的检测， 则需要重复进行 2x 次连接反应和荧光探针的检测。 0042 当荧光标记有四种时， 为了区分同一位置上的不同碱基， 对同一位置上的碱基， 需 在锚定引物的延伸末端进行 1 次连接反应和荧光信号检测， 每次连接反应中， 荧光探针是 对应某一特定位置上的某四种碱基 （A、 G、 C 或 T） 而含有荧光标记的探

34、针。为了实现对 x 个 位置的碱基的检测， 则需要重复进行 x 次连接反应和荧光探针的检测。 0043 当荧光标记的种类更多时， 可参考上述方案进行序列检测。 优选的， 荧光标记的种 类可被 4 整除或能把 4 整除， 以简化荧光探针的设计及后续的检测实验。 0044 此外， 本发明中， 在锚定引物的延伸末端连接荧光探针时， 主要有两种实现形式， 它们之间的区别主要在于 ： 是否在每次连接荧光探针之前， 重新锚定锚定引物。 若不重新锚 定引物， 则在完成每次荧光探针的连接和相应的荧光信号检测之后， 将连接产物上的荧光 探针切除， 保留锚定引物， 然后连接新的荧光探针， 然后再进行荧光信号检测。

35、若重新锚定 引物， 则在完成每次荧光探针的连接和相应的荧光信号检测之后， 将整个连接产物 （荧光探 针和锚定引物的连接物） 去除， 然后重新锚定锚定引物， 连接新的荧光探针， 并进一步采集 连接产物的荧光信号。 0045 步骤 S1 中所述第一接头为含基因序列的待测核酸片段上的一段已知序列， 位于 待测核酸片段的 3 端或 5 端。 说 明 书 CN 102766688 A 8 6/25 页 9 0046 本发明所述的各种锚定引物 （anchor） 是指与含基因序列的待测核酸片段上的相 应的接头进行锚定结合的单链寡核苷酸。 0047 本发明所述的 anchor 的延伸末端， 是指能够用于继续连

36、接并进行核苷酸链延伸 的 anchor 末端， 可以是 anchor 的 5 端， 也可以是 anchor 的 3 端。 0048 步骤 S1 中所述第一 anchor 是根据碱基互补配对原则， 与含基因序列的待测核酸 片段上的第一接头进行锚定结合的锚定引物， 是单链寡核苷酸， 用于在步骤 S2 中连接荧光 探针。除此之外， 第一 anchor 还可以根据具体需要， 进行不同的设计。 0049 在本发明的一个实施方案中， 第一 anchor 与含基因序列的待测核酸片段一端的 第一接头通过碱基互补配对进行锚定结合。该方案中， 第一 anchor 可以不进行封闭处理， 以降低第一 anchor 的

37、合成成本 ； 也可以在第一 anchor 的一端进行封闭处理， 避免第一 anchor 之间发生相互连接， 保证第一 anchor 与荧光探针的定向连接。 0050 将第一 anchor 的一端进行封闭， 可以是第一 anchor 的 3 端， 也可以是 5 端， 经 过封闭处理既可以控制连接的方向， 又可以避免第一 anchor 之间相互连接。在本步骤的一 个具体实施方式中， 将第一 anchor 的 3 端进行封闭， 封闭的方法包括但不限于双脱氧、 氨 基化反应、 酰胺化， 第一 anchor 被封闭的 3 端无法继续连接， 即第一 anchor 的连接只能发 生在 5 端 ； 而在本步骤

38、的另一个具体实施方式中， 将第一 anchor 的 5 端进行封闭， 封闭的 方法包括但不限于去磷酸化或酰胺化， 即第一 anchor 的连接只能发生在 3 端。 0051 在本发明的另一个实施方案中， 第一 anchor 含有至少一个特异性残基， 所述特异 性残基是指其本身或其所带的化学键能被特异性切割的残基， 它能使其所在的核苷酸片段 由于被切割而更易于洗脱。用于切割特异性残基的物质称为特异性切割剂。所述特异性残 基包括但不限于脱氧尿嘧啶核苷酸 （deoxy-Uracil， dU） 、 脱氧肌苷 （deoxy Inosine， dI） 、 含 有硫代磷酸酯键的核苷酸和切口酶的酶切识别位点。

39、 其相应的特异性切割剂包括但不限于 尿嘧啶 -DNA 糖基化酶 （Uracil-DNA Glycocasylase， UDG 酶） 、 大肠杆菌核酸内切酶、 含有 Ag、 Hg、 Cu、 Mn、 Zn 或 Cd 离子的化合物和切口酶。所述切口酶， 是指能识别双链核酸分子中 一条核苷酸链所携带的酶切识别位点， 而在含有该酶切识别位点的核苷酸链上进行酶切形 成切口的型限制酶 ； 本发明所述切口酶， 包括但不限于 ： Nt.Alw 内切酶、 Nt.BsmA 内 切酶、 Nt.BspQ 内切酶、 Nt.BstNB 内切酶。本实施方案的第一 anchor 设计方式可以使 得在后续的洗脱更换过程中更加便利

40、。 0052 在本发明的另一个实施方案中， 第一 anchor 含有至少一个酶切识别位点， 该酶切 识别位点可被直接利用于部分或完全切除步骤 S2 中所读取过的核苷酸序列， 使得整个发 明技术方案步骤简化， 操作简便。 0053 步骤 S1 中所述第一接头为含基因序列的待测核酸片段一端上的一段已知序列， 用于使第一 anchor 锚定结合到含基因序列的待测核酸片段上。该第一接头可以是得到待 测序的样品之后进行测序文库构建过程中自行设计合成连接上去的， 也可以是得到的待测 序样品本身已经含有的。 0054 步骤 S1 所述等位基因是指位于同源染色体的同一位置上控制着某一性状的不同 形态的基因。

41、0055 其中， 所述等位基因包括 F8、 F9、 FGFR3、 IDS、 GALT、 HBB、 HBA1、 HBA2、 ATP7B、 PHEX、 GJB2、 COL4A5、 LMNA 中的至少一个。 说 明 书 CN 102766688 A 9 7/25 页 10 0056 步骤 S1 所述抗肿瘤药物相关基因是指与抗肿瘤药物在体内的代谢、 转化、 信号传 输等相关的基因。 0057 其中， 所述抗肿瘤药物相关基因包括 CYP2C9、 VKORC1、 KIT、 PDGFRA、 CYP2C19、 DHFR、 GSTM1、 MTHFR、 RFC1、 CYP19A1、 UGT1A1、 UGT1A7、

42、 UGT1A9、 ABCB1、 CYP2D6、 CYP3A5、 SULT1A1、 UGT2B15、 GSTA1、 SOD2、 CYP2B6、 GSTP1、 MDR1、 BCRP、 p53、 CAT、 CBR1、 CBR3、 EGFR、 KRAS、 BRAF 中的至少一个。 0058 步骤 S1 中所述的含基因序列的待测核酸片段， 可以是 DNA、 RNA 或 cDNA 中的任一 种， 且至少其两端含有接头， 为使测序时操作便利， 优选将其中一端接头与固相载体连接， 所述用于连接的固相载体可以是不同材质和不同形状的刚性物质， 其材质包括但不限于 ： 玻璃、 硅、 陶瓷、 塑料和金属 ； 其形状包

43、括但不限于 ： 板层形、 平板形、 圆片形和球形 ； 对于固 相载体， 本发明优选磁珠以及玻片。 0059 所述含有接头的含基因序列的待测核酸片段， 其来源可以是得到的已经连接好接 头的含基因序列的待测核酸片段， 可直接用于测序 ； 也可以是通过对含基因序列的核酸片 段构建测序文库得到。若通过构建测序文库得到含基因序列的待测核酸片段， 则在步骤 S1 之前需要进行测序文库构建的操作， 本发明优选采用以下步骤进行 ： S0. 利用固相载体对 基因序列进行扩增， 得到固定于固相载体表面的含基因序列的待测核酸片段。 0060 所述步骤 S0 具体可包括以下步骤 ： S01. 将用于扩增的含基因序列的

44、核酸片段固定于固相载体表面， 得到表面含有至少一 个含基因序列的核酸片段的固相载体 ； S02. 将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点， 得到固定有引物的扩增载体 ； S03. 对扩增载体上的核酸片段进行扩增， 得到固定于固相载体表面的含基因序列的待 测核酸片段。 0061 运用本技术方案进行测序文库构建， 将含基因序列的待测核酸片段和用于扩增基 因序列的引物同时结合于固相载体表面， 能够将扩增产物固定于固相载体表面， 提高固相 载体在扩增时的利用率， 提高固相载体表面的扩增产物结合量 ； 利用该方法扩增得到的扩 增产物进行测序， 因为固相载体表面的扩增产物结合量的提高， 能进一步的增强测

45、序的检 测信号， 降低对检测仪器的要求。 0062 针对本技术方案， 需要说明的是， 本技术方案所述固相载体， 可以是由不同材质构 成的， 其材质可以采用玻璃、 硅胶、 陶瓷、 塑料和金属中的任意一种， 而固相载体的表面无特 殊要求， 优选含有平滑表面的固相载体， 固相载体的具体类型可以是现有技术中常用的固 相载体， 包括但不限于塑料珠、 玻璃珠、 玻片、 磁珠和纳米金颗粒。 本发明中优选采用磁珠作 为固相载体， 以使得扩增反应结束后扩增产物的分离纯化更加方便。上述只是本发明对于 固相载体的一些具体实施例， 并不用以限制本发明的保护范围。 0063 所述步骤 S01 中用于扩增的含基因序列的核

46、酸片段， 是指固定于固相载体表面， 用于作为扩增模板的单链核酸序列， 可以是 DNA、 RNA 或 cDNA， 其来源以及固定于固相载体 表面的方式可以有多种形式， 可以是通过固相载体从混合样品中捕获得到， 也可以是通过 直接将含基因序列的核酸片段样品结合于固相载体表面得到。 0064 在本发明的一个具体实施方案中， 直接在扩增之前对所要扩增的基因序列进行片 段化， 然后利用接头与片段化得到的核酸片段两端连接， 且固相载体表面进行相应的修饰 说 明 书 CN 102766688 A 10 8/25 页 11 处理， 再将接完接头之后的含基因序列的核酸片段固定于固相载体表面。 0065 在本发明

47、的另一个具体实施方案中， 用于扩增的含基因序列的核酸片段最初位于 临床待测血液样品中。首先对固相载体表面进行链霉亲和素修饰， 然后连接经过生物素修 饰的捕获探针， 得到含有捕获探针的固相载体。将含有捕获探针的固相载体直接与临床待 测血液样品混合， 从中进行含基因序列的核酸片段的捕获。捕获结束后， 利用离心分离， 即 可得到表面固定有含基因序列的核酸片段的固相载体。 0066 在本发明的另一个具体实施方案中， 用于扩增的含基因序列的核酸片段位于临床 疾病患者的唾液中。为得到用于扩增的含基因序列的核酸片段， 首先利用相应的引物进行 一般的 PCR， 将从患者的唾液中得到的含基因序列的核酸片段进行放

48、大， 然后以凝胶电泳进 行分离回收， 回收产物再与生物素化接头连接， 而固相载体采用链霉亲和素修饰的磁珠， 两 者混合结合， 即可得到表面固定有至少一个含基因序列的核酸片段的磁珠。 0067 上述仅是本发明中固相载体表面固定的含基因序列的核酸片段来源的一些具体 实施例， 并不用以限制本发明的保护范围。 0068 步骤 S02 中所述的引物， 是用于对所述含基因序列的待测核酸片段进行扩增的核 酸序列， 包括上游引物和下游引物中的至少一种。所述上游引物是与含基因序列的待测核 酸片段 5 端互补结合的核酸序列， 所述下游引物是与含基因序列的待测核酸片段 3 端序 列相同的核酸序列。在本发明的一个具体

49、实施例中， 将上游引物或下游引物结合于固相载 体表面的引物结合位点， 与上游引物和下游引物同时固定于固相载体表面的方案相比， 可 以在实现发明目的的同时减少试剂的种类 ； 在本发明的另一个具体实施例中， 将上游引物、 下游引物按照一定的比例同时结合于固相载体表面的引物结合位点， 可以在实现发明目的 的同时加快扩增的速度。其中上游引物与下游引物的混合比例根据需要可变， 优选为 1:2 至2:1的比例之间， 更优选为1:1。 上述对于上游引物与下游引物之间的混合比例只是本发 明所用的一些具体实施方式， 并不用以限制本发明的保护范围。 0069 步骤 S02 所述引物结合位点， 是指固相载体表面用与引物相结合的位点。 0070 步骤 S02 所述的扩增载体， 是指表面固定有至少一个含基因序列的核酸片段， 且 同时还结合有引物的固相载体， 此时含基因序列的核酸片段和引物同时固定于固相载体表 面， 能够直接应用于扩增。 0071 本发明中所述引物结合于固相载体表面时， 不排除引物同时也与含基因序列的核 酸片段互补结合， 这并不影响本发明的发明目的的实现。 0072 步骤 S02 中所述引物结合于固相载体表面可以采用多种方式实现。在本发明的一 个具体实施方案中， 引物通过与固相载体表面携带的基团进行配对连接， 实现直接结合， 可 以简化操作。在本发明的另一个具体实施方案中，