多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102766682 A (43)申请公布日 2012.11.07 CN 102766682 A *CN102766682A* (21)申请号 201210132135.4 (22)申请日 2012.04.27 2011-102986 2011.05.02 JP 2012-082392 2012.03.30 JP C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 爱科来株式会社 地址 日本京都府 (72)发明人 井口亚希 (74)专利代理机构 北京东方亿思知识产权代理 有限责任公司 11258 代理人 肖善强 (54) 发明名

2、称 多态性检测用探针、 多态性检测方法、 药效判 定方法以及多态性检测用试剂盒 (57) 摘要 本发明提供能够高灵敏度且简便地检测 ABCC2 基因的多态性的多态性检测用探针、 多态 性检测方法、 药效判定方法以及多态性检测用试 剂盒。用于检测 ABCC2 基因的多态性的多态性检 测用探针是 ： (P1) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有 序列编号 1 所示的序列中第 207 位第 217 位的 碱基的碱基长 11 60 的序列， 除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱基对应的碱基为 C 之外相对 于具有与序列编号 1 相同碱基的碱基序列具有至 少 80以上的同一性， 并且与序列编号 1 所示

3、的 序列的第 217 位的碱基对应的碱基用荧光染料标 记 ； 或者 (P1 ) 荧光标记寡核苷酸， 其与具有与序 列编号 1 相同碱基的碱基序列的互补链在严谨条 件下杂交， 并且与序列编号 1 所示的序列中的第 217 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 20 页 序列表 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 20 页 序列表 6 页 附图 3 页 1/2 页 2 1.一种多态性检测用探针， 其为从包括下述P1和P1 的组中选择的一种荧光标记寡核 苷酸

4、， 用于检测 ABCC2 基因的多态性 ： (P1) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的 碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱基对应的碱 基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的同 一性， 并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； 以及 (P1 ) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位 的碱基的碱基长为1160的序列， 该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱 基

5、为胞嘧啶之外与具有和序列编号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交， 并且与序列编号 1 所示的序列中的第 217 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。 2. 根据权利要求 1 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测用探针是下述 P1 或下述 P1 的所述荧光标记核苷酸， (P1-1) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位 的碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 的第 217 位的碱基对应的碱 基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的同 一性， 并且与序列编号1

6、所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记， 并且 该荧光标记寡核苷酸识别序列编号 1 的第 207 位的碱基的多态性 ； 或者 (P1 -1) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱基对应 的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下 杂交， 并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记， 并且 该荧光标记寡核苷酸识别序列编号 1 的第 207 位的碱基的多态性。 3. 根据权利要求 1

7、 或 2 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷酸在从 3 末端起数第 1 位第 3 位具有用荧光染料标记的第 217 位的碱基。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷 酸在 3 末端具有用荧光染料标记的第 217 位的碱基。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷 酸在未与靶标序列杂交时发出荧光， 并且在与该靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷 酸在未与靶标序列杂交时发出荧光， 并且在与该靶标序列杂交时荧光强

8、度减少。 7.根据权利要求1至6中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷 酸的碱基长为 12 55。 8.根据权利要求1至7中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷 酸的碱基长为 15 45。 9.根据权利要求1至8中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷 酸的碱基长为 18 35。 10. 根据权利要求 1 至 9 中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测用 探针为用于分析熔解曲线的探针。 11.根据权利要求1至10中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测用 权 利 要 求 书 CN 10276668

9、2 A 2 2/2 页 3 探针具有序列编号 4、 序列编号 5、 序列编号 6、 序列编号 7、 序列编号 8、 序列编号 9、 序列编 号 10、 序列编号 11、 序列编号 12、 序列编号 13、 序列编号 14、 序列编号 15 或序列编号 16 所 示的碱基序列。 12. 一种多态性检测方法， 其通过使用权利要求 1 至 11 中任一项所述的多态性检测用 探针来检测 ABCC2 基因的多态性。 13. 根据权利要求 12 所述的多态性检测方法， 包括 ： (I) 使权利要求 1 至 11 中任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触， 从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核

10、酸杂交来获得杂交体 ； (II) 通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离， 并测定基于所述杂 交体的解离的荧光信号的变动 ； (III) 基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、 即 Tm 值 ； 以及 (IV) 基于所述 Tm 值来检测所述试样中的单链核酸中的 ABCC2 基因的多态性的存在。 14. 根据权利要求 13 所述的多态性检测方法， 还包括 ： 在所述 (I) 之前或者与 (I) 同 时扩增核酸。 15. 根据权利要求 12 至 14 中任一项所述的多态性检测方法， 还包括 ： 通过使用从包括 MDR1 基因的多态性检测用探针和 CYP3A5 基因的多态性检测

11、用探针的组中选择的至少一种 探针， 来检测从包括 MDR1 基因和 CYP3A5 基因的组中选择的至少一种基因的多态性。 16. 一种药效评价方法， 包括 ： 通过权利要求 12 至 15 中任一项所述的多态性检测方法来检测 ABCC2 基因的多态性 ； 以及 基于检测到的多态性的有无来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。 17. 一种多态性检测用试剂盒， 用于检测 ABCC2 基因的多态性， 所述多态性检测用试剂 盒包含权利要求 1 至 11 中任一项所述的多态性检测用探针。 18. 根据权利要求 17 所述的多态性检测用试剂盒， 还包含 ： 能够扩增含有与所述 P1 荧 光标记寡核苷酸杂交的

12、序列的区域的引物。 19.根据权利要求17或18所述的多态性检测用试剂盒， 还包含 ： 从包括用于检测MDR1 基因的多态性的探针以及用于检测 CYP3A5 基因的多态性的探针的组中选择的至少一种以 上的多态性检测用探针。 权 利 要 求 书 CN 102766682 A 3 1/20 页 4 多态性检测用探针、 多态性检测方法、 药效判定方法以及多 态性检测用试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及多态性检测用探针、 多态性检测方法、 药效判定方法以及多态性检测 用试剂盒。 背景技术 0002 ABCC2 基因局部存在于肝细胞的胆管， 对将谷胱甘肽、 葡萄糖醛酸、 硫酸结合体从 胆管输送到胆管

13、的转运体进行编码， 并与各种药剂的代谢有关。 0003 另外， 近年， 在分析日本人的ABCC2基因的单核苷酸多态性(SNPs)之后， 发现了各 种各样的基因多态性。另外， 已给出了通过对 ABCC2 基因的与 5 末端相距 24 个碱基的胞 嘧啶 (C) 突变成胸腺嘧啶 (T) 的 C-24T 进行测定有可能能够预测药物耐受性的启示 ( 参见 Drug Metabolism and Disposition， 2002 年， Vol.30， No.4， p.363-364)。因此， 人们期待 正确且短时间、 低成本并且简便地测定 ABCC2 基因的多态性的方法。 0004 另外， 作为与药剂的

14、敏感性相关的突变， 例如， 除了 C-24T 突变之外， 还已知有 MDR1基因的外显子26中的第3435位的胞嘧啶(C)突变成胸腺嘧啶(T)的C3435T突变等多 种突变 ( 参见日本专利特许第 4454366 号公报 )。因此， 不单单检测 ABCC2 基因的多态性， 而是通过与 C-24T 突变一起检测其他的与药剂敏感性相关的突变体， 有可能能够更高灵敏 度地预测药剂耐受性。 0005 目前， 作为测定基因的多态性的方法， 已知有下述的方法 ： 使用被设计为扩增含有 想要测定的碱基的部分的引物进行 PCR， 用可以该特定碱基中有无突变来区分是否切断的 限制性内切酶进行切断， 之后通过电泳

15、检测 有没有被切断 (PCR-RFLP 法 )( 参见 Genet. Mol.Res.， 2010 年， 第 9 卷， 第 1 号， p.34-40)。 0006 另外， 还已知有下述的方法 ： 在用 PCR 法扩增含有突变的区域之后， 使用用荧光染 料标记了的核酸探针进行熔解曲线分析， 并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突 变 ( 参见特开 2002-119291 号公报 )。 发明内容 0007 发明要解決的问题 0008 但是， ABCC2 基因的突变中如上述那样存在各种突变。因此， 在 PCR-RFLP 法中， 需 要在 PCR 反应之后提取扩增产物来进行限制性内切酶处理。因此，

16、 扩增产物有可能混入下 一反应体系中， 由此有时会获得假阳性、 假阴性的结果。另外， 由于在 PCR 结束之后用限制 性内切酶进行处理， 之后进行电泳， 因此有时到检测为止所需的时间非常长。而且， 由于操 作复杂， 因此难以自动化。 0009 根据这些现状， 期待进一步开发用于检测 ABCC2 基因多态性的技术。 0010 本发明要解决的问题在于提供一种能够高灵敏度、 简便地检测 ABCC2 基因多态性 的多态性检测用探针、 使用该探针的多态性检测方法。 另外， 本发明要解决的问题在于提供 说 明 书 CN 102766682 A 4 2/20 页 5 使用了该多态性检测方法的药效判定方法。

17、而且本发明要解决的问题在于提供使用了该多 态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。 0011 用于解决课题的手段 0012 本发明如下所述。 0013 一种多态性检测用探针， 其为从包括下述 P1 和 P1 的组中选择的一种荧光标 记寡核苷酸， 用于检测 ABCC2 基因的多态性， 0014 (P1) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基的碱基长为1160的序列， 该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的 碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的 同一性， 并且与序列编号 1 所示的序列中的第

18、217 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； 以及 0015 (P1 ) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱基对应 的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下 杂交， 并且与序列编号 1 所示的序列中的第 217 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。 0016 根据所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测用探针是下述P1或 下述 P1 的所述荧光标记核苷酸， 0017 (P1-1) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列

19、编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217位的碱基的碱基长为1160的序列， 该序列除了与序列编号1的第217位的碱基对应 的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上 的同一性， 并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记， 并且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号 1 的第 207 位的碱基的多态性 ； 或者 0018 (P1 -1) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217位的碱基的碱基长为1160的序列， 该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对 应的碱基为胞嘧啶之外与具有和序

20、列编号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件 下杂交， 并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记， 并 且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号 1 的第 207 位的碱基的多态性。 0019 根据 或 所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核苷酸在从 3 末端起数第 1 位第 3 位具有用荧光染料标记的第 217 位的碱基。 0020 根据 中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核 苷酸在 3 末端具有用荧光染料标记的第 217 位的碱基。 0021 根据 中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核 苷酸在未与靶标序列杂

21、交时发出荧光， 并且在与该靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。 0022 根据中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧 光标记寡核 苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光， 并且在与该靶标序列杂交时荧光强度减少。 0023 根据 中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核 苷酸的碱基长为 12 55。 0024 根据 任意一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核 苷酸的碱基长为 15 45。 说 明 书 CN 102766682 A 5 3/20 页 6 0025 根据 中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述荧光标记寡核 苷酸的碱基长为 18 35。 00

22、26 根据 中任一项所述的多态性检测用探针， 其中所述多态性检测用 探针为用于分析熔解曲线的探针。 0027 根据 中任一项所述的多态性检测用探针， 其中， 所述多态性检测 用探针具有序列编号 4、 序列编号 5、 序列编号 6、 序列编号 7、 序列编号 8、 序列编号 9、 序列 编号 10、 序列编号 11、 序列编号 12、 序列编号 13、 序列编号 14、 序列编号 15 或序列编号 16 所示的碱基序列。 0028 一种多态性检测方法， 其通过使用中任一项所述的多态性检测用 探针来检测 ABCC2 基因的多态性。 0029 根据 所述的多态性检测方法， 包括 ： 0030 (I)

23、 使 中任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触， 从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体 ； 0031 (II) 通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离， 并测定基于所 述杂交体的解离的荧光信号的变动 ； 0032 (III) 基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、 即 Tm 值 ； 以及 0033 (IV) 基于所述 Tm 值来检测所述试样中的单链核酸中的 ABCC2 基因的多态性的存 在。 0034 根据 所述的多态性检测方法， 还包括 ： 在所述 (I) 之前或者与 (I) 同时 扩增核酸。 0035 根据 中任一项所述的多态性检测方法

24、， 还包括 ： 通过使用从包 括MDR1基因的多态性检测用探针和CYP3A5基因的多态性检测用探针的组中选择的至少一 种探针， 来检测从包括 MDR1 基因和 CYP3A5 基因的组中选择的至少一种基因的多态性。 0036 一种药效评价方法， 包括 ： 0037 通过 中任一项所述的多态性检测方法来检测 ABCC2 基因的多态性 ； 以及 0038 基于检测到的多态性的有无来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。 0039 一种多态性检测用试剂盒， 用于检测 ABCC2 基因的多态性， 所述多态性检测 用试剂盒包含 中任一项所述的多态性检测用探针。 0040 根据 所述的多态性检测用试剂盒， 还包

25、含 ： 能够扩增含有与所述 P1 荧 光标记寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。 0041 根据 或 所述的多态性检测用试剂盒， 还包含 ： 从包括用于检测 MDR1 基因的多态性的探针以及用于检测 CYP3A5 基因的多态性的探针的组中选择的至少一 种以上的多态性检测用探针。 0042 发明效果 0043 通过本发明， 能够提供可以高灵敏度、 简便地检测 ABCC2 基因多态性的多态性检 测用探针、 使用该探针的多态性检测方法。 另外， 本发明能够提供使用了该多态性检测方法 的药效判定方法。而且， 本发明能够提供使用了该多态性检测用探针的多态性检测用试剂 盒。 说 明 书 CN 10276668

26、2 A 6 4/20 页 7 附图说明 0044 图1的(A)是核酸混合物的熔解曲线的示例， 图1的(B)是微分熔解曲线的示例。 0045 图 2 的 (A) (F) 是本发明的实施例 1 涉及的试样的微分熔解曲线。 0046 图 3 的 (A) (C) 是本发明的实施例 2 涉及的试样的微分熔解曲线。 0047 图 4 的 (A) (C) 是本发明的比较例 1 涉及的试样的微分熔解曲线。 具体实施方式 0048 本发明涉及的ABCC2基因的多态性检测用探针(以下， 有时仅称 “多态性检测用探 针” ) 为如下的多态性检测用探针， 其为从包括下述 P1 和 P1 的组中选择的一种荧光标记 寡核

27、苷酸， 用于检测 ABCC2 基因的多态性 ： 0049 (P1) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱基对应 的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上 的同一性， 并且与序列编号1所示的序列的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； 以 及 0050 (P1 ) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 中

28、的第 217 位的碱基对应 的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下 杂交， 并且与序列编号 1 所示的序列中的第 217 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。 0051 本发明涉及的 ABCC2 基因多态性检测方法包括 ： 使用至少一种用于检测所述 ABCC2 基因的多态性的多态性检测用探针来检测 ABCC2 基因的多态性。 0052 本发明涉及的药剂的药效判定方法包括 ： 通过所述 ABCC2 基因多态性检测方法检 测 ABCC2 基因的多态性 ； 以及基于检测到的多态性的有无来判定针对药剂的耐受性或药剂 的药效。 0053 本发明涉及的多态性检测用试

29、剂盒包含用于检测 ABCC2 基因的多态性的多态性 检测用探针。 0054 本发明中的 “ABCC2 基因”已经是公知的， 其碱基序列表示 NCBI 的登录号 No.NC_000010.10 的 101542463 101611662 的序列。序列编号 1 的碱基序列为 NCBI 的 dbSNP 的登录号 No.rs717620 的 1 611 的序列， 相 应于 ABCC2 基因的启动子区域中的核 酸的碱基序列的一部分。 0055 在本发明中， 关于作为检测对象的试样中的试样核酸、 多态性检测用探针或者引 物的每个的序列， 基于它们的相互互补的关系所记述的事项， 只要不特别指出， 也适用于各

30、 个序列和相对于各序列互补的序列。 在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列 时， 由该互补的序列识别的序列， 在本领域技术人员的技术常识的范围内， 视为将说明书全 体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。 0056 在本发明中，“Tm值” 是指双链核酸解离的温度(解离温度 ： Tm)， 一般定义为260nm 处的吸光度达到吸光度总上升量的50时的温度。 即， 当加热含有双链核酸、 例如双链核酸 DNA 的溶液时， 260nm 处的吸光度上升。这是因为双链核酸 DNA 中的两条双链之间的氢键由 说 明 书 CN 102766682 A 7 5/20 页 8 于加热而断裂， 解离成

31、单链 DNA(DNA 的熔解 )。并且， 当双链核酸 DNA 解离成单链 DNA 时， 其 吸光度显示为加热开始时的吸光度 ( 仅双链核酸 DNA 的吸光度 ) 的约 1.5 倍左右， 由此可 以判断熔解完成。Tm 值基于该现象而设定。本发明中的 Tm 值只要不特别指出， 均是指吸光 度达到吸光度总上升量的 50时的温度。 0057 在本发明中， 关于寡核苷酸的序列， 当称为 “从 3 末端起数的第 1 3 位” 时是以 寡核苷酸链的 3 末端为第 1 位起数的。 0058 在本说明书中，“步骤” 一词不仅包含独立的步骤， 即使在不能与其他的步骤明确 区别的情况下只要达到了本步骤预期的效果，

32、则也包含在本术语之内。 0059 另外， 在本说明书中， 使用 “” 表示的数值范围为将 “” 的前后记载的数值分别 作为最小值和最大值包含的范围。 0060 另外， 在本发明中， 组成物中的各成分的量在组成物中存在多种相当于各成分的 物质的情况下只要不特别指出就是指所述组成物中存在的该多种物质的合计量。 0061 下面说明本发明。 0062 0063 本发明涉及的 ABCC2 基因的多态性检测用探针 ( 以下， 有时仅称为 “多态性检测 用探针” ) 为如下的多态性检测用探针， 其为从包括下述 P1 和 P1 的组中选择的一种荧光 标记寡核苷酸， 用于检测 ABCC2 基因的多态性 ： 00

33、64 (P1) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱基对应 的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上 的同一性， 并且与序列编号1所示的序列的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记 ； 以 及 0065 (P1 ) 荧光标记寡核苷酸， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱基对应 的碱基为胞嘧啶之外与具有

34、与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下 杂交， 并且与序列编号 1 所示的序列中的第 217 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。 0066 本发明的从包括所述 P1 和所述 P1 的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸 ( 以下 也称为 “所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸” 。) 是能够检测序列编号 1 所示的碱基序 列的第 207 位的碱基的多态性的探针。 0067 另外， 本发明的所述 P1 和 P1 荧光标记寡核苷酸具体为含有序列编号 1 所示的序 列中的第 207 位第 217 位的碱基的序列。 0068 在 ABCC2 基因的野生型中， 与序列编号 1 所示的序

35、列的第 207 位对应的碱基为 C( 胞嘧啶 )， 但在突变型中突变成 T( 胸腺嘧啶 )( 以下， 称为 “C-24T 突变” )， 该碱基相当于 ABCC2 基因的第 -428 位第 183 位的碱基中的第 207 位的碱基。 0069 本发明的所述 P1 荧光标记寡核苷酸需要除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱基 对应的碱基为 C( 胞嘧啶 ) 之外相对于具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列具有同源 性。 0070 具体地， 本发明的所述 P1 荧光标记寡核苷酸除了与序列编号 1 中的第 217 位的 碱基对应的碱基为 C( 胞嘧啶 ) 之外相对于具有与序列编号 1 相同的碱基

36、的碱基序列显示 说 明 书 CN 102766682 A 8 6/20 页 9 80以上的同一性。 0071 另外， 从检测灵敏度的观点来说， 可以显示 85以上的同一性、 90 以上的同一 性、 95以上的同一性、 96以上的同一性、 97以上的同一性、 98以上的同一性或 99 以上的同一性。 0072 在对本发明的所述 P1 荧光标记寡核苷酸和除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱 基对应的碱基为 C( 胞嘧啶 ) 之外具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列进行比较时的 同一性低于 80的情况下， 针对含有突变型的 ABCC2 基因的试样核酸的检测灵敏度变低。 0073 另外， 作

37、为本发明涉及的所述 P1 荧光标记寡核苷酸， 也可以是荧光标记寡核苷酸 (P1-1)， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 的第 217 位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外相对于具 有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列具有至少 80以上的同一性， 并且与序列编号 1 所 示的序列中的第 217 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记， 并且该荧光标记寡核苷酸识别 序列编号 1 的第 207 位的碱基的多态性。 0074 该荧光标记寡核苷酸具有对含有突变型的 ABCC2 基因的试样核酸的检测灵敏度 变高的倾向。

38、 0075 本发明中的所述 P1 荧光标记寡核苷酸需要除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱 基对应的碱基为 C( 胞嘧啶 ) 之外具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严 谨条件下杂交。 0076 杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法， 例如 Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab.Press， 2001) 中记载的方法等来进行。 该文献通过参考被并入本说明书中。 0077 严谨条件是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。 典型的严谨条 件例如可以举出在钾浓度约 25mM

39、 约 50mM 以及镁浓度约 1.0mM 约 5.0mM 中进行杂交 的条件。作为本发明的条件的示例， 可以举出在 Tris-HCl(pH8.6)、 25mM 的 KCl 以及 1.5mM 的 MgCl2下进行杂交的条件， 但是不限于此。此外， 严谨条件被记载在 Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab.Press， 2001) 中。该文献通过参考被 并入本说明书中。本领域技术人员能够通过改变杂交反应、 杂交反应液的盐浓度等来容易 地选择这样的条件。 0078 另外， 作为本发明涉及的所述 P1 荧光标记寡核

40、苷酸， 也可以是荧光标记寡核苷 酸 (P1 -1)， 其为含有序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基的碱基长为 11 60 的序列， 该序列除了与序列编号 1 中的第 217 位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外 和具有与序列编号 1 相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交， 并且与序列编号 1 所示的序列中的第 217 位的碱基对应的碱基用荧光染料标记， 并且该荧光标记寡核苷酸 (P1 -1) 识别序列编号 1 的第 207 位的碱基的多态性。 0079 该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外， 还具有识别序列编号 1 的第 207 位的碱基的多态性的功能， 因

41、此具有对含有突变型的 ABCC2 基因的试样核酸的检测灵 敏度变高的倾向。 0080 另外， 本发明的所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸还包括在所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸中插入、 缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。 说 明 书 CN 102766682 A 9 7/20 页 10 0081 该插入、 缺失或取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示与所述 P1 或所述 P1 荧 光标记寡核苷酸同等程度的作用即可， 在插入、 缺失或取代了碱基的情况下， 其插入、 缺失 或取代的位置无特别限定。插入、 缺失或取代的碱基的数量可以举出 1 个碱基或 2 个碱基 以上， 该数量根

42、据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同， 例如可以举出 1 个碱基 10 个碱 基或 1 个碱基 5 个碱基。 0082 在插入、 缺失或取代中， 作为本发明的所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸， 也可 以举出取代了所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。 0083 取代的位置无特别限定。 例如， 从检测灵敏度的观点来说， 可以举出位于序列编号 1 所示的序列中的第 207 位第 217 位的碱基之外的碱基被取代。作为被取代的碱基的数 量， 可以举出 1 个碱基或 2 个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体 的长度而不同， 例如可以举出 1 个碱

43、基 5 个碱基、 或 1 个碱基 3 个碱基。 0084 本发明的所述 P1 或所述 P1 的荧光标记寡核苷酸的长度需要是 11mer 60mer。 在所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸的长度为 10mer 以下或者 61mer 以上的情况下， ABCC2 基因多态性的检测灵敏度变低。 0085 另外， 本发明的所述 P1 或所述 P1荧光标记寡核苷酸的长度可以为 12mer 55mer、 15mer 45mer 或 18mer 35mer。通过设成 12mer 55mer 的范围， 例如具有检测 灵敏度变高等的倾向。 0086 另外， 通过改变所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷

44、酸的碱基长， 例如能够将由 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸与其互补链 ( 靶标序列 ) 形成的杂交体的解离温度、 即 Tm 值 调整至期望的值。 0087 以下将本发明的所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸中的碱基序列的示例示于 表 1， 但是本发明不限于此。 0088 此外， 在表 1 中， 将与序列编号 1 的第 207 位的碱基对应的碱基用小写字母表示， 并且一并示出了与该序列编号 1 的第 207 位对应的碱基为 A、 G、 T 和 C 时的寡核苷酸与各个 荧光标记寡核苷酸的杂交体的 Tm 值。另外， 相对于序列编号 1 所示的序列增加了突变的碱 基带有下划线。 0089

45、这里 Tm 值是使用 Meltcalc 99 free( 在设定条件 ： OligoconcM0.2、 Na eq.mM50 的条件下计算的。 0090 0091 为 mt( 突变型 ) 和 WT( 野生型 ) 的 Tm 值之差 0092 在本发明中， 所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸与具有互补的碱基序列的 DNA 杂交时的 Tm 值 ( 表 1 中的 Tm(mt)、 和与仅序列编号 1 的第 207 位的碱基对应的碱基为非 互补的寡核苷酸杂交时的 Tm 值 ( 表 1 中的 Tm(WT) 之差， 例如可以举出 2.0以上、 3.0 以上、 5.0以上、 或 7.0以上等。通过所述

46、Tm 值之差为 2.0以上， 例如能够更高灵敏度 说 明 书 CN 102766682 A 10 8/20 页 11 地检测序列编号 1 中的第 207 位的碱基的突变。 0093 另外， 本发明的所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸的第 217 位的碱基需要用荧 光染料标记。 0094 在所述 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷酸中， 该荧光标记了的第 217 位的碱基能够 存在于从 3 末端起数第 1 位第 3 位的任何位置。另外， 能够存在于 3 末端。由此， 多态 性检测灵敏度进一步提高。另外， 能够生产性良好地获得 P1 或所述 P1 荧光标记寡核苷 酸。 0095 本发明的所

47、述荧光标记寡核苷酸可以是其与靶标序列杂交时的荧光强度比未与 靶标序列杂交时的荧光强度减少 ( 淬灭 ) 或增加的荧光标记寡核苷酸。其中， 可以是与靶 标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。 0096 利用了这种荧光淬灭现象 (Quenching phenomenon) 的探针一般称为鸟嘌呤淬灭 探针， 已知为所谓 Q Probe( 注册商标 )。其中可以举出如下的寡核苷酸 ： 其被设计为 3 末 端或 5 末端为胞嘧啶 (C)， 并用荧光染料标记该末端的 C 使其靠近鸟嘌呤 (G) 时发光变弱。 若使用这样的探针， 则能够根据信号的变动来容易地确认杂交和解

48、离。 0097 此外， 除了使用 Q Probe 的检测方法之外， 也可以应用公知的检测方式。作为 这种检测方式， 可举出 Taq-man 探针法、 杂交探针 (Hybridization Probe) 法、 分子信标 (Molecular Beacon) 法或 MGB 探针法等。 0098 作为所述荧光染料无特别限制， 例如可以为荧光素、 磷光体、 罗丹明、 聚甲炔染料 衍生物等。所述荧光染料的市售产品例如有 Pacific Blue、 BODIPY FL、 FluorePrime、 Fluoredite、 FAM、 Cy3 和 Cy5、 TAMRA 等。 0099 所述荧光标记寡核苷酸的检

49、测条件无特别限制， 可以根据使用的所述荧光染料适 当确定。例如 Pacific Blue 能够在波长 445 480nm 下检测， TAMRA 能够在波长 585 700nm 下检测， BODIPY FL 能够在波长 520 555nm 下检测。 0100 如果使用具有这种荧光染料的探针， 则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确 认杂交和解离。可以按照通常的方法、 例如日本专利文献特开 2002-119291 号公报等中记 载的方法， 来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。 0101 另外， 所述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3 末端添加有磷酸基。 因为通过在所 述荧光标记寡核苷酸的 3 末端添加磷酸基， 能够充分抑制探针自身由于基因扩增反应而延 长。如后面所述， 检测有无突变的 DNA( 靶标 DNA) 可以通过 PCR 等基因扩增法来制备。此 时， 通过使用在 3 末端添加有磷酸基的荧光标记寡核苷酸， 能够使其共存于扩增反应的反 应液中。 0102 另外， 通过在3 末端例如添