一种靶向CD22的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体及其构建方法和应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610326101.7 (22)申请日 2016.05.17 (71)申请人 上海优卡迪生物医药科技有限公司 地址 201201 上海市浦东新区张江高科技 产业东区瑞庆路526号3幢A区305室 (72)发明人 祁伟俞磊林高武 (74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 31211 代理人 王函 (51)Int.Cl. C12N 15/867(2006.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 一种靶

2、向CD22的复制缺陷性重组慢病毒 CAR-T转基因载体及其构建方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种靶向CD22的复制缺陷性 重组慢病毒的CAR-T转基因载体， 包括： 用于质粒 复制的原核复制子pUCOri序列； 用于目的菌株 大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列； 用 于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40Ori 序列； 用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件； 用于真核细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧 光蛋白； 用于共同转录表达蛋白质的IRES核糖体 结合序列； 用于嵌合抗原受体基因的真核转录的 人EF1 启动子； 用于组成集识别、 传递、 启动于一 体的二代CAR或三

3、代CAR的嵌合抗原受体； 用于增 强转基因的表达效率的eWPRE元件。 此外， 还公开 了该载体的构建方法和应用。 本发明能显著提高 细胞因子的分泌、 CAR-T细胞的体外杀伤作用， 临 床治疗前体B细胞急性淋巴细胞白血病效果突 出。 权利要求书3页 说明书21页 序列表16页 附图9页 CN 105950662 A 2016.09.21 CN 105950662 A 1.一种靶向CD22的复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体， 其特征在于， 包括： 用 于质粒复制的原核复制子pUCOri序列， 如SEQIDNO.2所示； 用于目的菌株大量扩增的含 氨苄青霉素抗性基因AmpR序列， 如S

4、EQIDNO.1所示； 用于增强真核细胞内的复制的病毒复 制子SV40Ori序列， 如SEQIDNO.3所示； 用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件； 用于真核 细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白， 如SEQIDNO.11所示； 用于共同转录表达蛋 白质的IRES核糖体结合序列， 如SEQIDNO.12所示； 用于嵌合抗原受体基因的真核转录的 人EF1 启动子， 如SEQIDNO.14所示； 用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙 肝病毒转录后调控元件， 如SEQIDNO.13所示； 以及用于组成集识别、 传递、 启动于一体的 二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体； 所述

5、用于组成集识别、 传递、 启动于一体的二代CAR的 嵌合抗原受体包括： 如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受体信号肽、 如SEQIDNO.16 所示的CD22单链抗体轻链VL、 如SEQIDNO.19所示的OptimalLinkerC、 如SEQIDNO.20 所示的CD22单链抗体重链VH、 如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、 如SEQID NO.22所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、 CD28、 如SEQIDNO.23所示的CD137嵌合 受体共刺激因子、 如SEQIDNO.24所示的TCR嵌合受体T细胞激活域； 所述用于组成集识

6、别、 传递、 启动于一体的三代CAR的嵌合抗原受体包括： 如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合 受体信号肽、 如SEQIDNO.16所示的CD22单链抗体轻链VL、 如SEQIDNO.19所示的Optimal LinkerC、 如SEQIDNO.20所示的CD22单链抗体重链VH、 如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge 嵌合受体铰链、 如SEQIDNO.22所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、 CD28、 如SEQID NO.23所示的CD137嵌合受体共刺激因子、 如SEQIDNO.24所示的TCR嵌合受体T细胞激活 域、 以及如SEQIDNO.25所

7、示的CD28嵌合受体共刺激因子。 2.如权利要求1所述的载体， 其特征在于， 所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒 载体包括： 如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、 如SEQIDNO.6所示的慢病毒 3terminalSelf-InactivatingLTR、 如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、 如SEQIDNO.8 所示的RRE顺式元件、 如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、 如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式 元件。 3.如权利要求1所述的载体， 其特征在于， 所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒 载体包括： 如SEQIDNO.5所示的慢病毒5

8、terminalLTR、 如SEQIDNO.6所示的慢病毒3 terminalSelf-InactivatingLTR、 如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、 如SEQIDNO.8所 示的RRE顺式元件、 如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、 如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元 件所述慢病毒包装顺式元件， 以及如SEQIDNO.4所示的RSV启动子。 4.如权利要求1-3任一项所述的载体， 其特征在于， 所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒 转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变， 具体为： g.396GA、 g.397CT、 g.398TC、 g.399G A、 g.400A

9、T、 g.411AT。 5.一种如权利要求1所述的靶向CD22的复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体的 构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)将含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列(如SEQIDNO.1所示)、 原核复制子pUCOri序 列(如SEQIDNO.2所示)、 病毒复制子SV40Ori序列(如SEQIDNO.3所示)、 用于慢病毒包装 的慢病毒包装顺式元件、 ZsGreen1绿色荧光蛋白(如SEQIDNO.11所示)、 IRES核糖体结合 序列(如SEQIDNO.12所示)、 eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(如SEQID 权利要求书 1/3 页 2 CN 1

10、05950662 A 2 NO.13所示)存储于慢病毒骨架质粒上； (2)将人EF1 启动子(如SEQIDNO.14所示)、 用于组成集识别、 传递、 启动于一体的二 代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体组合成二代CAR或三代CAR设计方案， 经过酶切、 连接、 重组 反应克隆至慢病毒骨架质粒中， 得到二代CAR或三代CAR设计的重组慢病毒质粒； (3)将得到的重组慢病毒质粒与慢病毒包装质粒pPac-GP、 pPac-R以及膜蛋白质粒 pEnv-G共同转染HEK293T/17细胞， 在HEK293T/17细胞中进行基因转录表达后， 包装成功重 组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中， 收集包含的重组

11、慢病毒载体的上清液； (4)将得到的重组慢病毒上清采用抽滤、 吸附、 洗脱的离子交换方式进行纯化， 分别得 到重组慢病毒载体。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述慢病毒包装顺式元件采用第 二代慢病毒载体包括： 如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、 如SEQIDNO.6所示的 慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、 如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、 如SEQ IDNO.8所示的RRE顺式元件、 如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、 如SEQIDNO.10所示的 cPPT顺式元件； 所述慢病毒包装顺式元

12、件采用第三代慢病毒载体包括： 如SEQIDNO.5所示 的慢病毒5terminalLTR、 如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-Inactivating LTR、 如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、 如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元件、 如SEQID NO.9所示的env顺式元件、 如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件所述慢病毒包装顺式元件， 以及如SEQIDNO.4所示的RSV启动子。 7.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病 毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变， 具体为： g.396GA、

13、 g.397CT、 g.398TC、 g.399GA、 g.400AT、 g.411AT。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 由人EF1 启动子启动整个CAR基 因表达； CD8leader嵌合受体信号肽位于CAR编码序列的N端， 用于引导CAR蛋白定位于细胞 膜； CD22单链抗体轻链VL、 OptimalLinkerC、 CD22单链抗体重链VH组合成scfv区域， 用于 识别CD22抗原 ； CD8Hinge嵌合受体铰链用于将scfv锚定于细胞膜外侧 ； CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上； CD137嵌合受体共刺

14、激因子用于刺激T细胞增殖和细胞因子分泌； TCR嵌合受体T细胞激活域用于激活下游信号 通路的表达； 当scfv区域与CD22抗原结合时， 信号通过嵌合受体传递至细胞内， 从而产生包 括T细胞增殖、 细胞因子分泌增加、 抗细胞凋亡蛋白分泌增加、 细胞死亡延迟、 裂解靶细胞的 一系列生物学效应。 9.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 所述慢病毒载体有带荧光标签 zsGreen1的版本和不带荧光标签zsGreen1版本， 带荧光标签的版本用于体外实验， 不带荧 光标签的版本用于临床实验。 10.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 所述抽滤步骤要控制上清体积

15、在200ml2000ml， 控制真空度在-0.5MPA-0.9MPA， 防止由于堵孔带来的载体损失； 所述 吸附步骤要控制溶液的PH值在68， 防止PH的变化导致载体失活； 所述洗脱步骤要控制洗 脱液的离子强度在0.5M1.0M， 防止离子强度的变化导致洗脱不完全或者载体失活。 11.如权利要求1-4任一项所述的载体在制备过继性细胞治疗药物中的应用。 12.如权利要求11所述的应用， 其特征在于， 所述过继性细胞治疗药物为前体B细胞急 权利要求书 2/3 页 3 CN 105950662 A 3 性淋巴细胞白血病治疗药物。 权利要求书 3/3 页 4 CN 105950662 A 4 一种靶向

16、CD22的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体及 其构建方法和应用 技术领域 0001 本发明属于医学生物领域， 具体涉及一种载体， 尤其涉及一种靶向CD22的复制缺 陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体。 此外， 本发明还涉及该载体的构建方法和应用。 背景技术 0002 肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、 调控机体攻击肿瘤 细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。 这个生物过程十分复杂， 目前仍处于研究之中。 上世 纪90年代， 多个科研小组已经发现了肿瘤抗原(t morantigens)， T淋巴细胞可以通过主要 组织相容性复合体(majorhistocompatibi

17、litycomplex， MHC)依赖性方式识别这些肿瘤 抗原。 0003 肿瘤免疫治疗通常分为两类， 非特异性免疫和特异性免疫。 非特异性免疫治疗主 要包括白细胞介素-2(interle kin-2， IL-2)， 干扰素 (interferon ， IFN- )， 肿瘤坏死因 子(t mornecrosisfactor， TNF- )， 卡介苗等细胞因子和毒素， 过继性细胞免疫治疗等。 特异性免疫治疗主要是肿瘤疫苗。 0004 1.1肿瘤非特异性免疫治疗 0005 非特异性免疫应答是与生俱来的， 它的形成并不需要抗原刺激， 能广泛地针对多 种抗原， 是免疫应答的基础， 但特异性不强， 对某

18、种特定抗原物质往往不能产生足够强度的 反应非特异性的免疫治疗。 在进入临床试验的多种细胞因子中， 白细胞介素-2和干扰素应 用最为广泛RosenbergSA， LotzeMT， M lLM， etal.Aprogressreportonthe treatmentof157patientswithadvancedcancer singlymphokine-activated killercellsandinterle kin-2orhigh-doseinterle kin-2aloneJ.NEnglJ Med， 1987， 316(15):889897.。 0006 1.2肿瘤单克隆抗体的免疫治

19、疗 0007 近20多年来单克隆抗体已在肿瘤治疗领域得到广泛应用。 抗肿瘤单抗药物一般包 括两类： 一是抗肿瘤单抗， 二是抗肿瘤单抗偶联物， 或称免疫偶联物。 免疫偶联物分子由单 抗与 “弹头” 药物两部分组成，“弹头” 主要包括放射性核素、 药物和毒素， 与单抗连接后分别 构成放射免疫偶联物、 化学免疫偶联物和免疫毒素。 在1997年11月和1998年10月美国FDA分 别通过了用于临床肿瘤治疗的两个单抗Ritximab( ritxan )和Trastzmab (herceptin)DillmanRO .Magicb lletsatlast！ Finallyapprovalofa monoc

20、lonalantibodyforthetreatmentofcancerJ.CancerBiotherRadiopharm， 1997， 12:223225.。 目前认为单抗的作用机制有阻断作用、 信号传导作用以及靶向作用 等三种作用机制， 没有直接的杀伤作用。 另外还存在药理学方面的问题， 主要是到达肿瘤的 药量不足。 由于偶联物是异体蛋白， 会被网状内皮系统摄取， 有相当数量将积聚于肝、 脾和 骨髓。 偶联物是大分子物质， 通过毛细血管内皮层及穿透肿瘤细胞外间隙均受到限制。 0008 1.3肿瘤的过继免疫治疗 说明书 1/21 页 5 CN 105950662 A 5 0009 肿瘤的过继

21、免疫治疗是指将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者， 以 杀伤患者体内的肿瘤细胞。 肿瘤过继性免疫治疗中的一个关键问题是寻找合适的肿瘤杀伤 细胞。 自上世纪80年代以来， 包括LAK、 细胞因诱导的杀伤细胞(cytokine-indced killers， CIK)、 TIL等细胞已先后应用于临床， 但由于存在着扩增倍速较低、 细胞来源困难、 细胞毒力不高等诸多问题， 在临床应用上受到限制。 如何提高T细胞的肿瘤抗原特异性具有 重要的临床意义。 T细胞对肿瘤抗原的识别主要是通过T细胞受体(Tcellreceptor， TCR) 识别肿瘤细胞表面的人类白细胞抗原(h manle kocyt

22、eantigen， HLA)-肽复合物， 因此， T 细胞对肿瘤抗原识别的特异性取决于T细胞表面的TCR。 利用分子生物学的手段克隆肿瘤特 异性T细胞的TCR， 并通过构建含TCR的病毒载体， 把TCR转入正常的T细胞中， 使这些T细胞因 携带肿瘤特异性而成为特异性肿瘤杀伤细胞JohnsonLA， MorganRA， D dleyME， et al.Genetherapywithh manandmo seT-cellreceptorsmediatescancer regressionandtargetsnormaltiss esexpressingcognateantigenJ.Blood，

23、2009， 114(3):535546.。 0010 1.4肿瘤疫苗治疗 0011 肿瘤疫苗治疗是通过给患者体内导入肿瘤抗原来激发患者的特异性抗肿瘤免疫 反应。 由于疫苗治疗具有特异性、 在体内免疫效应维持时间长等优点， 目前已成为研究热 点。 近年来多肽疫苗、 核酸疫苗、 全蛋白疫苗、 抗独特性抗体疫苗、 重组病毒疫苗、 细菌疫苗、 基因修饰的肿瘤细胞疫苗、 树突状细胞(dendriticcells， DC)疫苗等得到广泛研究和应用 RobbinsPF， MorganRA， FeldmanSA， etal.T morregressioninpatientswith metastaticsyn

24、ovialcellsarcomaandmelanoma singgeneticallyengineered lymphocytesreactivewithNY-ESO-1J.JClinOncol， 2011， 29(7):917924.。 肿瘤 疫苗治疗的大规模应用还有三个方面的问题亟待解决。 首先， 肿瘤相关抗原， 每个肿瘤、 每 个亚型、 每个肿瘤分期， 这些相对抗原表达是不一样的， 所以选准抗原， 选准病人人群是致 关重要的。 第二， 如何达到肿瘤抗原在树突状细胞中髙效吸收与表达？ 抗原被树突状细胞吸 收是以表面受体为介导的。 树突状细胞有十几个受体， 如何根据特定的抗原选择相应的受 体

25、？ 第三， 针对树突状细胞分化成熟的调控。 树突状细胞的分化成熟是一个非常复杂的过 程， 它既可走向激活T细胞也可以走向抑制T细胞。 靶向DC细胞的治疗型肿瘤疫苗： 亮点与 挑战并存。 0012 1.5肿瘤CAR-T治疗 0013 CAR-T， 全称是ChimericAntigenReceptorT-CellImm notherapy， 嵌合抗原受 体T细胞免疫疗法， 结构如图1所示EleanorJ.Cheadle,etal.CARTcells:drivingthe roadfromthelaboratorytotheclinic.Imm nologicalReviews2014.Vol.25

26、7:91 106。 0014 第一代CAR介导的T细胞激活是通过CD3z链或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。 CD3z链能够提供T细胞激活、 裂解靶细胞、 调节IL-2分泌以及体内发挥抗肿瘤活性所需的信 号。 但第一代CAR改造T细胞的抗肿瘤活性在体内受到了限制， T细胞增殖减少最终导致T细 胞的凋亡。 0015 第二代CAR在胞内增加了一个新的共刺激信号， 实验证明， 这使得原有的使源自 TCR/CD3复合体的 “信号1” 扩大， 许多研究都表明， 搭载了 “信号2” 的第二代CAR与第一代CAR 说明书 2/21 页 6 CN 105950662 A 6 相比， 抗原特异性不变， T

27、细胞增殖、 细胞因子分泌增加， 抗细胞凋亡蛋白分泌增加， 细胞死 亡延迟。 常用的共刺激分子为CD28,但之后有研究将CD28用CD137(4-1BB)进行替换， 除此之 外， 一种使用NK细胞受体CD244的思路也被提出来。 虽然不同的第二代CAR究竟孰优孰劣， 不 同的研究者用不同的肿瘤在体内和体外的研究中得到的结果不尽相同。 深度完整版： CAR- T的现状和未来.生物谷.2015-051-15。 0016 为了进一步改良CAR的设计， 许多研究组开始着眼于发展第三代CAR， 不仅包括 “信 号1” 、“信号2” ， 还包括了额外的共刺激信号。 不同研究者们用不同的靶点和共刺激信号开 展

28、的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比较结果存在一定的差异性。 一些研究报道表 达第三代CAR的重组T细胞在抗肿瘤活性、 存活周期及细胞因子释放方面均显著提高； Wilkie等的研究结果显示靶向MC1的第二代CAR与第三代CAR重组T细胞在抗肿瘤细胞毒 性方面并无明显差异， 虽然表达第三代CAR的T细胞能够分泌更大量的IFN-(WilkieS, PiccoG,FosterJ,etal.Retargetingofh manTcellstot morassociatedMC1: theevol tionofachimericantigenreceptor.JImm nol2008； 180:

29、49014909.)。 值得注意的是， 上述区别仅仅是体外实验中获得的结论， 目前尚未在体内比较第二代和第 三代CAR的报道。 0017 这几代CAR之间的差异可能不止来自于信号传导域， 胞外的抗原结合域(scFv)、 重 组T细胞的转染方法(慢病毒VS逆转录病毒)、 重组T细胞的回输方式(静脉回输VS腹膜VS瘤 体)等均可能影响CAR-T细胞的最终抗肿瘤效果。 0018 本申请人于2016年3月17日申请的发明名称为 “一种基于复制缺陷性重组慢病毒 的CAR-T转基因载体及其构建方法和应用” 的发明专利申请， 公开了针对CD19的复制缺陷性 重组慢病毒的CAR-T转基因载体及其构建方法和应用

30、。 本发明是针对CD22的CAR-T转基因载 体。 发明内容 0019 本发明要解决的技术问题之一是提供一种靶向CD22的复制缺陷性重组慢病毒的 CAR-T转基因载体。 0020 本发明要解决的技术问题之二是提供该靶向CD22的复制缺陷性重组慢病毒的 CAR-T转基因载体的构建方法。 0021 本发明要解决的技术问题之三是提供该靶向CD22的复制缺陷性重组慢病毒的 CAR-T转基因载体的应用。 0022 本发明涉及含肽的医药配置品， 具体涉及： 0023 一、 含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、 原核复制子pUCOri序列、 病毒复制子 SV40Ori序列、 RSV启动子、 人EF1 启动子、

31、 慢病毒5terminalLTR、 慢病毒3terminalSelf- InactivatingLTR、 Gag顺式元件、 RRE顺式元件、 env顺式元件、 cPPT顺式元件、 IRES核糖体 结合序列、 ZsGreen1绿色荧光蛋白、 eWPRE土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件的重组慢病毒载 体骨架， 这种重组慢病毒载体骨架可以搭载不同的治疗性基因并广泛的用于过继性细胞治 疗领域。 0024 二、 重组慢病毒载体骨架、 CD8leader嵌合受体信号肽、 CD22单链抗体轻链VL、 单链 抗体铰链LinkerA、 单链抗体铰链LinkerB、 单链抗体铰链LinkerC、 CD22单链抗体重链

32、VH、 说明书 3/21 页 7 CN 105950662 A 7 CD8Hinge嵌合受体铰链、 CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、 CD28嵌合受体共刺激因子、 CD137嵌合受体共刺激因子、 TCR嵌合受体T细胞激活域构建形成重组慢病毒载体， 该方法得 到的重组慢病毒载体可以实现在人T淋巴细胞上表达CD22嵌合抗原受体， 引导并激活T淋巴 细胞对CD22阳性细胞的杀伤作用， 在临床上用于治疗前体B细胞急性淋巴细胞白血病(BCP- ALL)。 0025 本发明所采用的针对CD22的CAR-T技术， 是一种综合了肿瘤单克隆抗体的免疫治 疗和肿瘤的过继免疫治疗优点的靶向治疗新技术

33、。 CD22是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素 家族的一员， 有7个IgG样的胞外区， 存在于pre-B到matureB的细胞分化阶段， CD22在免疫 毒素疗法中被证明是针对B淋巴细胞白血病和B淋巴瘤的成功靶点(WaleedHaso,Crystal L.Mackalletal.Anti-CD22chimericantigenreceptorstargetingB-cell precursoracutelymphoblasticleukemia.Blood,February2013,Vol.121(7),1165- 1174.)， 由于， 最近几年在前体B细胞急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)的

34、治疗上有着显著的 疗效， 被认为是最有前景的前体B细胞急性淋巴细胞白血病治疗方式之一。 0026 嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件(图1所示)， 赋予T淋巴细胞HLA非依赖的 方式识别肿瘤抗原的能力， 这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够 识别更广泛的目标。 CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tmor-associated antigen， TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)， 一个胞外铰链区， 一个跨膜区和一个胞内信号转导区。 scFV段的设计对于CAR的特异性、 有效性以及基因改造 T细胞自身的安全性来说是关键的决定因

35、素。 0027 为了解决上述技术问题， 本发明通过如下技术方案实现： 0028 在本发明的一方面， 提供一种靶向CD22的复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因 载体， 包括： 用于质粒复制的原核复制子pUCOri序列， 如SEQIDNO.2所示； 用于目的菌株 大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列， 如SEQIDNO.1所示； 用于增强真核细胞内的 复制的病毒复制子SV40Ori序列， 如SEQIDNO.3所示； 用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式 元件； 用于真核细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白， 如SEQIDNO.11所示； 用于共 同转录表达蛋白质的IRES核糖体结合序

36、列， 如SEQIDNO.12所示； 用于嵌合抗原受体基因 的真核转录的人EF1 启动子， 如SEQIDNO.14所示； 用于增强转基因的表达效率的eWPRE增 强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件， 如SEQIDNO.13所示； 以及用于组成集识别、 传递、 启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体； 所述用于组成集识别、 传递、 启动于一体 的二代CAR的嵌合抗原受体包括： 如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受体信号肽、 如SEQ IDNO.16所示的CD22单链抗体轻链VL、 如SEQIDNO.19所示的OptimalLinkerC、 如SEQ IDNO.20所示的CD

37、22单链抗体重链VH、 如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、 如 SEQIDNO.22所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、 CD28、 如SEQIDNO.23所示的 CD137嵌合受体共刺激因子、 如SEQIDNO.24所示的TCR嵌合受体T细胞激活域。 所述用于组 成集识别、 传递、 启动于一体的三代CAR的嵌合抗原受体包括： 如SEQIDNO.15所示的 CD8leader嵌合受体信号肽、 如SEQIDNO.16所示的CD22单链抗体轻链VL、 如SEQIDNO.19 所示的OptimalLinkerC、 如SEQIDNO.20所示的CD22单链抗体

38、重链VH、 如SEQIDNO.21 所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、 如SEQIDNO.22所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜 区、 CD28、 如SEQIDNO.23所示的CD137嵌合受体共刺激因子、 如SEQIDNO.24所示的TCR嵌 说明书 4/21 页 8 CN 105950662 A 8 合受体T细胞激活域、 以及如SEQIDNO.25所示的CD28嵌合受体共刺激因子。 本发明所采用 的scFV段的linker设计， 可以应用于第二代CAR设计方案， 同样也可以应用于第三代CAR设 计方案。 第三代CAR设计与第二代设计相比， 增加了CD28嵌合受体共刺激因子

39、(SEQID NO.25)， 理论上说， 会有更强的信号放大作用。 0029 进一步地， 所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括： 如SEQIDNO.5 所示的慢病毒5terminalLTR、 如SEQIDNO .6所示的慢病毒3terminalSelf- InactivatingLTR、 如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、 如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元 件、 如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、 如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件。 所述慢病毒 包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括： 如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、 如SE

40、QIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、 如SEQIDNO.7所示的 Gag顺式元件、 如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元件、 如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、 如 SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件所述慢病毒包装顺式元件， 以及如SEQIDNO.4所示的 RSV启动子。 本发明所采用CAR设计方案可以应用于第三代慢病毒载体结构上， 也可以应用 于第二代慢病毒载体结构上。 第二代和第三代慢病毒载体在结构上的区别(如图2B所示)， 主要是第三代慢病毒载体把第二代载体5 LTR的U3区域替换为RSV启动子， 这样就消除了U3 转录

41、时对Tat蛋白的依赖， 既可以在慢病毒的结构基因里去除Tat序列， 也提高了慢病毒基 因组转录水平和转录持续性。 第二代和第三代慢病毒载体主要是基因组转录方式的区别， 因此本发明所采用CAR设计方案可以应用于这两代慢病毒载体。 本发明所采用的载体骨架 优选为第三代慢病毒载体(图2A所示)， 3 SINLTR去除了U3区域， 消除了慢病毒载体自我复 制的可能性， 大大提高了安全性； 增加了cPPT和eWPRE元件， 提高了转导效率和转基因的表 达效率； 采用RSV启动子保证了慢病毒载体包装时核心RNA的持续高效转录； 采用人自身的 EF1 启动子， 使CAR基因能够在人体内长时间持续表达。 00

42、30 进一步地， 所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强 突变， 具体为： g.396GA、 g.397CT、 g.398TC、 g.399GA、 g.400AT、 g.411AT。 0031 在本发明的另一方面， 提供一种上述靶向CD22的复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T 转基因载体的构建方法， 包括以下步骤： 0032 (1)将含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列(如SEQIDNO.1所示)、 原核复制子pUC Ori序列(如SEQIDNO.2所示)、 病毒复制子SV40Ori序列(如SEQIDNO.3所示)、 用于慢病 毒包装的慢病毒包装顺式元件、 ZsGreen

43、1绿色荧光蛋白(如SEQIDNO.11所示)、 IRES核糖 体结合序列(如SEQIDNO.12所示)、 eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(如SEQ IDNO.13所示)存储于慢病毒骨架质粒上； 0033 (2)将人EF1 启动子(如SEQIDNO.14所示)、 用于组成集识别、 传递、 启动于一体 的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体组合成二代CAR或三代CAR设计方案， 经过酶切、 连接、 重组反应克隆至慢病毒骨架质粒中， 得到二代CAR或三代CAR设计的重组慢病毒质粒； 0034 (3)将得到的重组慢病毒质粒与慢病毒包装质粒pPac-GP、 pPac-R以及膜蛋白质粒 pE

44、nv-G共同转染HEK293T/17细胞， 在HEK293T/17细胞中进行基因转录表达后， 包装成功重 组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中， 收集包含的重组慢病毒载体的上清液； 0035 (4)将得到的重组慢病毒上清采用抽滤、 吸附、 洗脱的柱纯化方式进行纯化， 分别 得到重组慢病毒载体。 说明书 5/21 页 9 CN 105950662 A 9 0036 在步骤(1)中， 所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括： 如SEQID NO.5所示的慢病毒5terminalLTR、 如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf- InactivatingLTR、 如SEQI

45、DNO.7所示的Gag顺式元件、 如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元 件、 如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、 如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件； 所述慢病毒 包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括： 如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、 如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、 如SEQIDNO.7所示的 Gag顺式元件、 如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元件、 如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、 如 SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件所述慢病毒包装顺式元件， 以及如SEQID

46、NO.4所示的 RSV启动子。 0037 在步骤(1)中， 所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的 增强突变， 具体为： g.396GA、 g.397CT、 g.398TC、 g.399GA、 g.400AT、 g.411AT。 0038 在步骤(2)中， 由人EF1 启动子启动整个CAR基因表达； CD8leader嵌合受体信号肽 位于CAR编码序列的N端， 用于引导CAR蛋白定位于细胞膜； CD22单链抗体轻链VL、 Optimal LinkerC、 CD22单链抗体重链VH组合成scfv区域， 用于识别CD22抗原； CD8Hinge嵌合受体铰 链用于将scfv锚

47、定于细胞膜外侧； CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体 固定于细胞膜上； CD137嵌合受体共刺激因子用于刺激T细胞增殖和细胞因子分泌； TCR嵌合 受体T细胞激活域用于激活下游信号通路的表达； 当scfv区域与CD22抗原结合时， 信号通过 嵌合受体传递至细胞内， 从而产生T细胞增殖、 细胞因子分泌增加、 抗细胞凋亡蛋白分泌增 加、 细胞死亡延迟、 裂解靶细胞等一系列生物学效应。 0039 在步骤(4)中， 所述慢病毒载体有带荧光标签zsGreen1的版本和不带荧光标签 zsGreen1版本， 带荧光标签的版本用于体外实验， 不带荧光标签的版本用于临床实验。 00

48、40 在步骤(4)中， 需要注意的几个关键点有， a： 抽滤步骤要控制上清体积(200ml 2000ml)和真空度(-0.5MPA-0.9MPA)， 防止由于堵孔带来的载体损失； b： 吸附步骤需要控 制溶液的PH(68)， 防止PH的变化导致载体失活； c： 洗脱步骤需要控制洗脱液的离子强度 (0.5M1.0M)， 防止离子强度的变化导致洗脱不完全或者载体失活。 0041 在本发明的另一方面， 提供上述载体在制备过继性细胞治疗药物中的应用。 优选 的， 所述过继性细胞治疗药物为前体B细胞急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)治疗药物。 经临 床试验验证， 本发明载体应用于临床治疗前体B细胞急性

49、淋巴细胞白血病(BCP-ALL)， 在患 者体内实现了肿瘤细胞的完全清除， 因此本发明所述的载体在CART治疗领域拥有广阔的应 用前景。 0042 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0043 本发明采用的scFV段的linker设计， 是使用世翱公司的Linkerspool， 经过蛋白 质结构生物信息学数据库(https:/www.predictprotein.org/)的分析， 通过对蛋白质二 级结构、 溶剂可接触性、 蛋白质柔韧性、 二硫键桥、 结合位点等蛋白质特性的比较， 优选得 出。 通过体外细胞因子分泌检测试验以及杀伤效率试验证明， 与国外的设计相比， 能够显著 提高细胞因子的分泌、 CAR-T细胞的体外杀伤作用。 并且， 在临床治疗的效果上也比国外临 床实验的效果好。 0044 本发明所采用的慢病毒载体柱纯化系统， 系本申请人开发出的慢病毒规模化生产 工艺。 本发明所采用的慢病毒载体柱纯化方式不同于通常采用的超速离心或者高速离心的 说明书 6/21 页 10 CN 105950662 A 10 方式， 常用的超速离心法或者高速离心法， 是利用离心沉降原理分离慢病毒颗粒， 不可避免 的会残留很多沉降系数相近的杂质， 对后续实验带来不利影响。 并且， 装管过程复杂、 操作 繁琐