应用腺病毒载体诱导免疫应答的方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 1972958 B (45)授权公告日 2013.01.23 CN 1972958 B *CN1972958B* (21)申请号 200580019211.9 (22)申请日 2005.04.12 60/561,341 2004.04.12 US C07K 14/16(2006.01) C12N 15/861(2006.01) A61K 39/21(2006.01) (73)专利权人 美国政府卫生与公共服务部 地址 美国马里兰 专利权人 杰韦克公司 (72)发明人 GJ内伯尔 成程 江咏培 JGD贾森 CR金 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11

2、021 代理人 王旭 Franck Lemiale et al.Enhanced Mucosal Immunoglobulin A Response of Intranasal Adenoviral Vector Human Immunodeficiency Virus Vaccine and Localization in the Central Nervous System.JOURNAL OF VIROLOGY .2003,77(18),10078-10087. (54) 发明名称 应用腺病毒载体诱导免疫应答的方法 (57) 摘要 本发明提供在哺乳动物中诱导针对人免疫缺 陷病毒 (HIV

3、) 的免疫应答的方法。本方法包括给 哺乳动物施用腺病毒载体组合物， 所述腺病毒载 体组合物包括编码两种或多种不同 HIV 抗原的一 种或多种腺病毒载体， 所述抗原的产生在所述哺 乳动物中诱导针对 HIV 的免疫应答。本发明还提 供包括 4 种腺病毒载体的腺病毒载体组合物， 所 述 4 种腺病毒载体分别编码 HIV 分化体 A Env 蛋 白， HIV 分化体 B Env 蛋白， HIV 分化体 C Env 蛋 白， 和包括HIV分化体B Gag蛋白和Pol蛋白的融 合蛋白。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2006.12.11 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2

4、005/012291 2005.04.12 (87)PCT申请的公布数据 WO2005/110492 EN 2005.11.24 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张彬 权利要求书 2 页 说明书 35 页 序列表 62 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 35 页 序列表 62 页 1/2 页 2 1. 腺病毒载体组合物用于制备在哺乳动物中诱导针对人免疫缺陷病毒 (HIV) 的免疫 应答的药物的应用， 其中所述腺病毒载体组合物包括 (a) 包括编码融合蛋白的核酸的复制 缺陷型腺病毒载体， 所述融合蛋白包括HIV分化体B Ga

5、g蛋白和Pol蛋白， (b)包括编码HIV 分化体 A Env 蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体， (c) 包括编码 HIV 分化体 B Env 蛋白 的核酸的复制缺陷型腺病毒载体， 和 (d) 包括编码 HIV 分化体 C Env 蛋白的核酸的复制缺 陷型腺病毒载体， 其中所述 (a)， (b)， (c)， 和 (d) 的腺病毒载体独立地是血清型 26， 血清型 28， 或血清型 35， 由此在所述哺乳动物中产生所述 HIV 蛋白并且诱导针对 HIV 的免疫应答。 2. 权利要求 1 的应用， 其还包括给所述哺乳动物施用引发组合物， 其包括一种或多种 核酸序列， 所述核酸序列编码与由所述腺病

6、毒载体组合物中的腺病毒载体所编码的 HIV 蛋 白相同的至少一种 HIV 蛋白， 其中所述引发组合物的施用在所述腺病毒载体组合物施用前 至少 1 周施行。 3. 权利要求 2 的应用， 其中所述引发组合物包括一种或多种核酸序列， 其编码两种或 多种 HIV 蛋白， 所述 HIV 蛋白与由所述腺病毒载体组合物的一种或多种腺病毒载体所编码 的 HIV 蛋白相同。 4. 权利要求 2 的应用， 其中所述引发组合物的施用在所述腺病毒载体组合物施用前 6 个月到 9 个月施行。 5. 权利要求 2 的应用， 其中所述引发组合物包括一种或多种质粒， 裸 DNA 分子， 或包括 所述一种或多种核酸序列的病毒

7、载体。 6.权利要求5的应用， 其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E1区域的一种或多 种必需的基因功能。 7.权利要求5的应用， 其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E4区域的一种或多 种必需的基因功能。 8.权利要求1的应用， 其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E3区域的一种或多 种基因功能。 9. 权利要求 1 的应用， 其中至少一种 Env 蛋白为 gp140 或 gp140dv12 蛋白。 10. 权利要求 1 的应用， 其中所述腺病毒载体组合物作为包括药用载体的药物组合物 的部分施用。 11. 权利要求 10 的应用， 其中所述药物组合物以两剂或更多剂量施用。 12. 权利

8、要求 10 的应用， 其中所述药物组合物以包括 1108-11012个颗粒单位的腺 病毒载体的剂量施用。 13. 权利要求 12 的应用， 其中所述药物组合物以包括 1108-11010颗粒单位的腺病 毒载体的剂量施用。 14. 权利要求 12 的应用， 其中所述药物组合物以包括 1109-11011颗粒单位的腺病 毒载体的剂量施用。 15. 权利要求 12 的应用， 其中所述药物组合物以包括 11010-11012颗粒单位的腺病 毒载体的剂量施用。 16.权利要求1的应用， 其中包括HIV分化体B Gag蛋白和Pol蛋白的所述融合蛋白由 核酸序列编码， 所述核酸序列还编码 HIV 蛋白酶、

9、反转录酶、 和整合酶蛋白， 并且其中所述 核酸分子包括一种或多种点突变， 其中的点突变使得蛋白酶， 反转录酶和整合酶蛋白没有 权 利 要 求 书 CN 1972958 B 2 2/2 页 3 功能。 17. 一种用于在哺乳动物中诱导针对人免疫缺陷病毒 (HIV) 的免疫应答的腺病毒载体 组合物， 其包括 (a) 包括编码融合蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体， 所述融合蛋白包 括 HIV 分化体 B Gag 蛋白和 Pol 蛋白， (b) 包括编码 HIV 分化体 AEnv 蛋白的核酸的复制缺 陷型腺病毒载体， (c) 包括编码 HIV 分化体 B Env 蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体， 和

10、 (d) 包括编码 HIV 分化体 C Env 蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体， 其中所述 (a)， (b)， (c) 和 (d) 的腺病毒载体独立地是血清型 26， 血清型 28 或血清型 35。 18. 权利要求 17 的腺病毒载体组合物， 其中包括 HIV 分化体 B Gag 蛋白和 Pol 蛋白 的所述融合蛋白由核酸序列编码， 所述核酸序列还编码 HIV 蛋白酶、 反转录酶、 和整合酶蛋 白， 并且其中所述核酸分子包括一种或多种点突变， 其中的点突变使得蛋白酶， 反转录酶和 整合酶蛋白没有功能。 19. 权利要求 17 的腺病毒载体组合物， 其中所述 Env 蛋白为 gp 140 或

11、 gp 140dv12。 20. 权利要求 17 的腺病毒载体组合物， 其中所述腺病毒载体是复制缺陷型。 21.权利要求20的腺病毒载体组合物， 其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E1 区域的一种或多种必需的基因功能。 22.权利要求20的腺病毒载体组合物， 其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E4 区域的一种或多种必需的基因功能。 23.权利要求17的腺病毒载体组合物， 其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E3 区域的一种或多种的基因功能。 24. 权利要求 17 的腺病毒载体组合物， 其中 (a)， (b)， (c)， 和 (d) 的腺病毒载体以 3 1 1 1 重量比例存在于所述

12、组合物中。 25. 一种用于在哺乳动物中诱导针对人免疫缺陷病毒 (HIV) 的免疫应答的药物组合 物， 其包括权利要求 17 的腺病毒载体组合物和药用载体。 26. 权利要求 25 的药物组合物， 其包括 1108-11012个颗粒单位的腺病毒载体。 27. 权利要求 26 的药物组合物， 其包括 1108-11010颗粒单位的腺病毒载体。 28. 权利要求 26 的药物组合物， 其包括 1109-11011颗粒单位的腺病毒载体。 29. 权利要求 26 的药物组合物， 其包括 11010-11012颗粒单位的腺病毒载体。 权 利 要 求 书 CN 1972958 B 3 1/35 页 4 应

13、用腺病毒载体诱导免疫应答的方法 0001 相关申请的交叉参考 0002 本专利申请要求 2004 年 4 月 12 日提交的美国临时专利申请号 60/561,341 的利 益。 0003 关于联邦政府资助的研究和研发的陈述 0004 在 由 Gen Vec， Inc. 和 代 表 敏 感 和 传 染 病 国 家 机 构 (National Institute ofAllergy and Infectious Diseases) 的美国公共卫生局之间签署的合作研究和研发协 议 (Coorperative Reasearch and Development Agreement， CRADA) 号

14、AI-1034 及其修改 下， 本发明部分由政府支持完成。在本发明中政府可以拥有某些权利。 0005 发明背景 0006 疾病控制和预防中心 (CDC) 估计， 在美国， 850,000-950,000 人正承受着 HIV 感 染， 并且大约 25的人没有觉察到他们的感染 (CDC， Morb.Mortal.Wkly.Rep.， 52(47)， 1145-8(2003)。在全世界， HIV 新感染率以难以接受的高水平持续增长。尽管由于高度活 性的抗反转录病毒治疗(HAART)的出现， 在发达国家， 新的AIDS诊断和死亡已经显著下降， 但是在发展中国家， HIV/AIDS 流行性继续加剧。所述

15、流行病的全球性影响是相当大的。按 照关于 HIV/AIDS 的联合国计划 (Joint United NationsProgramme on HIV/AIDS) 和世界 卫生组织， 到 2002 年底时， 估计有 4000-4200 万人正承受 HIV/AIDS， 其中全世界总人数的 95居住在发展中国家 (WHO， Treating 3 Million by 2005 ： The WHO Strategy， Geneva， Switzerland.第1-53页(2003)， 和UNAIDS， AIDS Epidemic UpdateDecember 2003)。 2003 年， 全世界估计有

16、 250-350 万例由 HIV/AIDS 导致的死亡 (UNAIDS， AIDS Epidemic Update December 2003)， 并且自从这种流行病的开始， 已经有多达 3000 万例由 HIV 感染导致的死 亡 (WHO， Treating3 Million by 2005 ： The WHO Strategy， Geneva， Switzerland. 第 1-53 页 (2003)。除了 HIV/AIDS 的人类灾难， 所述流行病的代价对许多国家的经济增长和政治 稳定造成显著的阻碍。在发展中国家以及在美国人口的部分地区中， 抗 HIV 治疗经常超出 财政范围。因此， 迫

17、切地需要用于 HIV 预防的有效的、 低成本的工具， 诸如疫苗， 以使得 HIV 流行病得到控制。 0007 几十年来， 以生物相应量运送蛋白作为疗法或者用于诱导免疫应答已成为药物和 疫苗开发的障碍。 已经证明为传统抗原运送途径的成功备选的一种解决方案是运送外源核 酸序列用于在体内产生抗原分子。 理想地， 基因转移载体进入广泛种类的细胞类型， 具有接 纳巨大的核酸序列的能力， 是安全的， 并且可以以治疗患者需要的量生产。 病毒载体具有这 些有利特征， 并且被用于治疗或预防生物疾病的许多方法中。 0008 除了它们的有利特征， 病毒基因转移载体的广泛应用受到一些因素的阻碍。在这 方面， 某些细胞

18、不易接受通过目前可用的病毒载体运送基因。例如， 摄入腺病毒时， 淋巴细 胞被损害 (Silver 等 .， Virology 165， 377-387(1988) ； Horvath 等 .， J.Virology， 62(1)， 341-345(1988)。 0009 病毒基因转移载体的应用还受到病毒载体免疫原性的阻碍。 大多数的美国人口已 经暴露于目前处于作为基因转移载体的研发中的许多病毒(例如， 腺病毒)的野生形式。 因 说 明 书 CN 1972958 B 4 2/35 页 5 此， 许多美国人口已发展了针对某些基于病毒的基因转移载体的现有的免疫性。这样的载 体被迅速地从血流中清除，

19、因此降低了所述载体在运送生物相应量的基因产物中的功效。 并且， 某些病毒载体的免疫原性防止有效的重复给药， 其可以有利 “增强” 针对病原体的免 疫系统， 并且导致只有少部分剂量的病毒载体将其有效负荷运送到宿主细胞。 0010 另外， 设计作为 HIV 疫苗的病毒载体中的主要挑战是识别和靶向病毒结构， 所述 病毒结构是多样性的最广泛的可能范围内的保护性体液和细胞免疫应答的关键决定簇。 多 价疫苗的应用， 其包含来自许多流行 HIV 亚型的免疫原的明确的混合物， 可能是获得广泛 保护性 HIV 疫苗的可行途径。 0011 因此， 存在对于改进的方法和用于诱导针对 HIV 的免疫应答的组合物的需要

20、。本 发明提供这样的方法和组合物。 本发明的这些和其它优点， 以及附加的发明特征， 将通过本 文提供的发明详述而显而易见。 0012 发明简述 0013 本发明提供在哺乳动物中诱导针对人类免疫缺陷病毒 (HIV) 的免疫应答的方法。 所述方法包括给所述哺乳动物施用腺病毒载体组合物， 其中所述腺病毒载体组合物包括编 码两种或多种不同的 HIV 抗原的一种或多种腺病毒载体， 因此在哺乳动物中产生所述 HIV 抗原， 并且诱导针对 HIV 的免疫应答。 0014 本发明还提供腺病毒载体组合物， 其包括 (a) 包括编码 HIV 分化体 AEnv 蛋白的核 酸的腺病毒载体， (b) 包括编码 HIV

21、分化体 B Env 蛋白的核酸的腺病毒载体， (c) 包括编码 HIV 分化体 C Env 蛋白的核酸的腺病毒载体， 和 (d) 包括编码融合蛋白的核酸的腺病毒载 体， 所述融合蛋白包括 HIV 分化体 B Gag 蛋白和 Pol 蛋白。 0015 发明详述 0016 本发明提供在哺乳动物中诱导针对人类免疫缺陷病毒 (HIV) 的免疫应答的方法。 所述方法包括给所述哺乳动物施用腺病毒载体组合物， 其中所述腺病毒载体组合物包括编 码两种或多种不同的 HIV 抗原的一种或多种腺病毒载体。 0017 本发明还提供腺病毒载体组合物。所述腺病毒载体组合物包括 (a) 包括编码 HIV 分化体 A Env

22、 蛋白的核酸的腺病毒载体， (b) 包括编码 HIV 分化体 B Env 蛋白的核酸的腺 病毒载体， (c) 包括编码 HIV 分化体 C Env 蛋白的核酸的腺病毒载体， 和 (d) 包括编码融合 蛋白的核酸的腺病毒载体， 所述融合蛋白包括 HIV 分化体 B Gag 蛋白和 Pol 蛋白。 0018 “抗原” 是在哺乳动物中引发免疫应答的分子。 “免疫应答” 可以承担 (entail)， 例 如， 抗体产生和 / 或免疫效应细胞的激活。在本发明上下文中， HIV 抗原可以包括在哺乳动 物中激发免疫应答的任何蛋白质 HIV 分子或者其部分。 “HIV 分子” 是这样一种分子， 即， 其 为人

23、类免疫缺陷病毒的一部分， 由人类免疫缺陷病毒的核酸序列编码， 或者衍生于或合成 地基于任何这样的分子。按照本发明激发免疫应答的 HIV 抗原的施用优选地导致针对 HIV 的保护性免疫。在这方面， 针对 HIV 的 “免疫应答” 是针对任何一种或多种 HIV 抗原的免疫 应答。 0019 适合的HIV抗原的实例包括全部或部分的HIV Gag， Env， Pol， Tat， 反转录酶(RT)， Vif， Vpr， Vpu， Vpo， 整合酶， 或 Nef 蛋白。优选地， 所述两种或多种 HIV 抗原的每一种包括 全部或部分的 HIV Gag， Env， 和 / 或 Pol 蛋白。适合的 Env 蛋

24、白在本领域内已知， 并且包 括， 例如， gp160， gp120， gp41， gp145 和 gp140。另外， HIV 抗原可以为在体内展现出增强的 说 明 书 CN 1972958 B 5 3/35 页 6 免疫原性的修饰的 Env 蛋白。例如， 所述抗原可以为在 Env 蛋白的切割位点、 融合肽、 或者 螺旋间卷曲的卷曲结构域包括突变的 Env 蛋白 ( CFI Env 蛋白 )( 参见， 例如， Cao 等 .， J.Virol.， 71， 9808-9812(1997)， 和 Yang 等 .， J.Virol.， 78， 4029-4036(2004)。 0020 HIV 的任

25、何分化体适用于抗原选择， 其包括 HIV 分化体 A， B， C， D， E， MN 等。因 此， 应该理解下述 HIV 抗原可以用于本发明的方法 ： HIV 分化体 A gp140， Gag， Env， 和 / 或 Pol ； HIV 分化体 B gp140， Gag， Env， 和 / 或 Pol 蛋白 ； HIV 分化体 C gp140， Gag， Env， 和 / 或 Pol 蛋白 ； 以及 HIV 分化体 MNgp140， Gag， Env， 和 / 或 Pol 蛋白。尽管优选地所述抗原 为 Gag， Env， 和 / 或 Pol 蛋白， 能够在哺乳动物中诱导免疫应答的任何 HIV

26、蛋白或者其片 段可以与本发明的方法联合应用。来自不同 HIV 分化体 ( 例如， HIV 分化体 A， B， C， MN， 等 ) 的 HIV Gag， Env 和 Pol 蛋白， 以及编码这些蛋白的核酸序列， 和用于将所述核酸序列 操作和插入载体的方法， 是已知的 ( 参见， 例如， HIV Sequence Compendium， Division of AIDS， National Institute ofAllergy and Infectious Diseases(2003)， HIV Sequence Database(http:/hiv-web.lanl.gov/content/

27、hiv-db/mainpage.html)， Sambrook 等 .， Molecular Cloning， a Laboratory Manual， 第二版， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， N.Y.(1989)， 和 Ausubel 等 .， Current Protocols inMolecular Biology， Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons， New York， N.Y.(1994)。 0021 应该理解产生免疫应答不需要全部的、 完好无缺的 HIV

28、 蛋白。事实上， HIV 蛋白的 大部分抗原表位大小相对较小。因此， HIV 蛋白， 诸如本文所描述的任何 HIV 蛋白的片段 (例如， 表位或其它抗原片段)， 可以被用作HIV抗原。 HIV Gag， Env， 和Pol蛋白的抗原片段 和表位， 以及编码这些抗原片段和表位的核酸序列是已知的 ( 参见， 例如， HIV Immunology andHIV/SIV Vaccine Databases， 卷1， Division of AIDS， National Institute ofAllergy and Infectious Diseases(2003)。 0022 HIV 抗原还包括融合

29、蛋白和多蛋白 (ployproteins)。融合蛋白可以包括融合到另 外一种， 或者融合到全部或部分的不同 HIV 蛋白或其它多肽上的一种或多种抗原性 HIV 蛋 白片段 ( 例如， 表位 )。所述融合的蛋白可以包括本文所描述的任何 HIV 抗原的全部或部 分。例如， 全部或部分的 HIVEnv 蛋白 ( 例如， gp120 或 gp160)， 可以融合到全部或部分的 HIV Pol 蛋白上， 或者全部或部分的 HIV Gag 蛋白可以融合到全部或部分的 HIV Pol 蛋白 上。 这样的融合蛋白有效地提供本发明的上下文中的多种HIV抗原， 并且与由单一HIV抗原 产生的免疫应答相比， 所述融

30、合蛋白可以用于产生针对给出的 HIV 病原体的更加完整的免 疫应答。相似地， 多蛋白也可以提供多种 HIV 抗原。与本发明联合应用的多蛋白包括提供 两种或多种 HIV 抗原， 诸如本文所描述的两种或多种任何 HIV 抗原的那些蛋白。应用单独 的核酸序列， 通过腺病毒载体将融合蛋白或多蛋白运送到哺乳动物， 允许将免疫系统暴露 于多种抗原， 并且因此， 便利地允许单一组合物提供针对多种 HIV 抗原或单一抗原的多种 表位的免疫性。可以通过已知的方法制备编码 HIV 抗原的融合蛋白和多蛋白的核酸序列， 并将其插入载体中 ( 参见， 例如， 美国专利 5,130,247 和 5,130,248， Sa

31、mbrook 等 .， 如上文 所述， 和 Ausubel 等 .， 如上文所述 )。 0023 所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同 HIV 抗原的一种或多种腺病毒 载体。应该明白腺病毒载体通过已被插入所述腺病毒载体的核酸序列的方式 “编码” 抗原。 如果它们包括不同的抗原性氨基酸序列， 那么 HIV 抗原是 “不同的” 。所述两种或多种不同 说 明 书 CN 1972958 B 6 4/35 页 7 HIV 抗原可以是任何 HIV 抗原， 诸如本文所描述的两种或多种 HIV 抗原。优选地， 所述腺病 毒载体组合物包括一种或多种腺病毒载体， 其编码三种或多种， 或者甚至四种或更多种不

32、同的 HIV 抗原。应该理解将哺乳动物的免疫系统暴露于不同的 HIV 抗原 “混合物” ， 可以引 起比将所述免疫系统仅暴露于单一的 HIV 抗原更广泛的和更有效的免疫应答。 0024 所述两种或多种不同的HIV抗原可以由来自不同的HIV蛋白(例如， HIV Gag， Env， Pol， 等 ) 或不同的 HIV 分化体 ( 例如， HIV 分化体 A， B， C， D， E， MN， 等 ) 的两种或多种抗原 提供。例如， HIV Gap 蛋白和 Pol 蛋白为不同的抗原。类似地， HIV 分化体 A Env 蛋白和 HIV 分化体 B Env 蛋白为不同的 HIV 抗原。优选地， 所述两种

33、或多种不同的 HIV 抗原包括来自 两种或多种不同的 HIV 分化体的 HIV 抗原。更优选地， 所述腺病毒载体组合物包括腺病毒 载体， 其编码来自三种或多种不同的HIV分化体的三种或多种不同的HIV抗原， 或者甚至是 来自四种或多种不同的 HIV 分化体的四种或多种不同的 HIV 抗原。备选地， 所述两种或多 种 HIV 抗原的至少一种可以为嵌合抗原， 其包括衍生于从两种或多种不同的 HIV 分化体获 得的相同抗原的氨基酸序列。例如， 嵌合 Env 蛋白可以包括从分化体 A HIV 获得的 Env 氨 基酸序列的一部分， 和从分化体 B HIV 获得的 Env 氨基酸序列的一部分。 0025

34、 例如， 所述腺病毒载体组合物可以由下述组合物提供， 即， 包括一种或多种腺病毒 载体(例如， 单一的腺病毒载体)的组合物， 其中每一种腺病毒载体编码两种或多种不同的 HIV 抗原， 或者包括两种或多种腺病毒载体 ( 例如， 多腺病毒载体 ) 的组合物， 其中每一种 腺病毒载体编码一种或多种不同的HIV抗原， 并且因此， 共同编码两种或多种不同的HIV抗 原。当所述腺病毒载体组合物包括每一种编码两种或多种 HIV 抗原的一种或多种腺病毒载 体 ( 例如， 单一腺病毒载体 ) 时， 每一种腺病毒载体可以包括 (i) 编码两种或多种不同 HIV 抗原 ( 例如， 多蛋白或融合蛋白 ) 的核酸序列，

35、 或者 (ii) 两种或多种核酸序列， 其中每一种 编码不同的 HIV 抗原。与构型 (i) 一致， 应用包括编码多于两种不同的 HIV 抗原 ( 例如， 三 种或更多种， 四种或更多种， 或者甚至是五种或更多种不同的 HIV 抗原 ) 或者编码同一抗 原的多个拷贝的核酸序列的腺病毒在本发明的范围内， 条件是其编码至少两种或多种不同 的 HIV 抗原。同样地， 与构型 (ii) 一致， 应用包括每一种编码不同的 HIV 抗原或同一抗原 的多个拷贝的一些核酸序列 ( 例如， 三种或更多种， 四种或更多种， 或者甚至是五种或更多 种不同的核酸序列 ) 的腺病毒载体在本发明的范围内， 条件是所述腺病

36、毒载体编码至少两 种不同的 HIV 抗原。不论通过构型 (i) 或 (ii)， 所述腺病毒载体组合物优选地包括编码三 种或更多种， 或者甚至是四种或更多种不同的HIV抗原的一种或多种腺病毒载体(例如， 其 中所述的每一种载体包括编码三种或更多种， 或者四种或更多种不同的 HIV 抗原的核酸序 列， 或者其中所述的每一种载体包括三种或更多种， 或者四种或更多种核酸序列， 并且每种 核酸序列编码不同的HIV抗原)。 理想地， 所述两种或更多种， 三种或更多种， 或者四种或更 多种不同的HIV抗原来自两种或更多种， 三种或更多种， 或者四种或更多种不同的HIV分化 体。 0026 优选地， 所述腺病

37、毒载体组合物包括编码两种或多种不同的 HIV 抗原的两种或多 种腺病毒载体， 并且每一种腺病毒载体包括编码所述两种或多种不同的 HIV 抗原的至少一 种的核酸序列。尽管所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同 HIV 抗原的两种或多 种腺病毒载体， 对于所应用的腺病毒载体的数目， 或者由此编码的不同 HIV 抗原的数目， 没 有上限。优选地， 所述腺病毒载体组合物包括编码三种或多种不同 HIV 抗原的三种或多种 说 明 书 CN 1972958 B 7 5/35 页 8 腺病毒载体， 并且每一种腺病毒载体包括编码所述三种或多种不同 HIV 抗原的至少一种的 核酸序列。最优选地， 所述腺病毒载

38、体组合物包括编码四种或多种不同 HIV 抗原的四种或 多种腺病毒载体， 并且每一种腺病毒载体包括编码所述四种或多种不同 HIV 抗原的至少一 种的核酸序列。理想地， 所述两种或更多种， 三种或更多种， 或者四种或更多种不同 HIV 抗 原是来自两种或更多种， 三种或更多种， 或者四种或更多种不同的 HIV 分化体。 0027 当然， 可以应用上述腺病毒载体构型的组合， 而并不背离本发明的精神和范围。 例 如， 按照本发明所应用的腺病毒载体组合物可以包括第一种腺病毒载体， 其编码单一的 HIV 抗原， 和第二种腺病毒载体， 其编码不同于第一种腺病毒载体所编码的 HIV 抗原的两种或 多种 HIV

39、 抗原。其它类似的本文所公开的腺病毒载体构型的组合和排列是显而易见的， 并 且可以按照本发明应用。 0028 当所述腺病毒载体组合物包括两种或多种腺病毒载体时， 包含在所述组合物中的 两种或多种腺病毒载体中的每一种的相对量将取决于许多因素， 其包括与其它 HIV 抗原相 比的具体的 HIV 抗原的免疫原性。所述腺病毒载体组合物可以包括等量的所述两种或多种 腺病毒载体的每一种。备选地， 所述腺病毒载体组合物可以包括不同量的所述两种或多种 腺病毒载体的每一种。 0029 在本发明特别优选的实施方案中， 所述腺病毒载体组合物包括 4 种腺病毒载体， 其中每一种分别包括编码分化体 B Gag-Pol

40、融合蛋白， 分化体 A gp140， 分化体 B gp140 和 分化体 C gp140 的核酸序列。最优选地， 所述腺病毒载体组合物包括具有核酸序列 SEQ ID NO ： 4， SEQ ID NO ： 5， SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7 的 4 种腺病毒载体。SEQ ID NO ： 4 是编 码分化体 B Gag-Pol 融合蛋白的 E1/E4- 缺失腺病毒载体的核酸序列。SEQ IDNO ： 5 是编码 分化体 A gp140 蛋白的 E1/E4- 缺失腺病毒载体的核酸序列。SEQ ID NO ： 6 是编码分化体 B gp140 蛋白的 E1/E4- 缺失

41、腺病毒载体的核酸序列。SEQ ID NO ： 7 是分化体 C gp140 蛋白 的核酸序列。理想地， 所述腺病毒载体组合物以 3:1:1:1 的重量比例包括下述腺病毒载体， 分别为 ： 包括编码分化体 B Gag-Pol 融合蛋白的核酸序列的腺病毒载体， 包括编码分化体 A gp140 的核酸序列的腺病毒载体， 包括编码分化体 B gp140 的核酸序列的腺病毒载体， 和包 括编码分化体 C gp140 的核酸序列的腺病毒载体。 0030 典型地， 所述腺病毒载体包括编码一种或多种 HIV 抗原的核酸作为表达盒的一部 分， 即， 拥有有助于核酸序列的亚克隆和回收 ( 例如， 一个或多个限制性

42、酶切位点 ) 或核酸 序列的表达 ( 例如， 多聚腺苷化作用或剪接位点 ) 功能的具体核苷酸序列。所述核酸优选 地位于腺病毒基因组的 E1 区 ( 例如， 完全或部分地置换 E1 区 ) 或 E4 区。例如， E1 区可以 由包括编码抗原的核酸的可用启动子表达盒置换。所述表达盒任选地可以以 3 -5方向 插入， 例如， 以所述表达盒的转录方向与周围临近的腺病毒基因组的方向相反这样的方向 导向。然而， 对于所述表达盒， 以与周围基因组的转录方向相关的 5 -3方向插入也是适 当的。除了包括编码抗原的核酸的表达盒， 所述腺病毒载体包括包含其它外源核酸的其它 表达盒， 所述表达盒可以置换腺病毒基因组

43、的任何删除的区域。将表达盒插入所述腺病毒 基因组 ( 例如， 插入基因组的 E1 区 ) 可以通过已知方法实现， 例如， 通过在腺病毒基因组的 给出位置引入独特的限制性酶切位点。如上文所提出的， 优选地所述腺病毒载体的全部或 部分 E3 区也被删除。 0031 优选地， 将所述编码抗原的核酸可操作地连接到(即， 在其转录控制下)一种或多 说 明 书 CN 1972958 B 8 6/35 页 9 种启动子和 / 或增强子元件上， 例如， 作为可用启动子表达盒的一部分。在本领域， 用于有 效地将序列连接到一起的技术是公知的。 “启动子” 是指导 RNA 聚合酶的结合并且由此启动 RNA 合成的

44、DNA 序列。将核酸序列 “可操作地连接” 到启动子上， 此时所述启动子能够指导 核酸序列的转录。对于可操作连接的核酸序列的启动子可以是天然的或非天然的。 0032 任何启动子 ( 即， 不管是从天然分离的还是通过重组 DNA 或合成技术产生的 ) 可 以与本发明结合应用以提供核酸序列的转录。所述启动子优选地能够在真核 ( 理想地哺乳 动物 ) 细胞中指导转录。所述启动子的功能可以被在载体上存在的一种或多种增强子和 / 或沉默基因而改变。 “增强子” 为激活或抑制相邻基因的转录的 DNA 的顺式作用元件。抑制 转录的增强子也叫做 “沉默基因” 。增强子与用于只在启动子中发现的序列特异性 DNA

45、 结合 蛋白的 DNA 结合位点不同 ( 其也叫做 “启动子元件” )， 原因在于增强子可以以任何方向， 并 且在多达几千碱基对 (kb) 的距离， 甚至从转录区的下游位置起作用。 0033 启动子区可以在长度和序列上不同， 并且还可以包括用于序列特异性 DNA 结合蛋 白的一种或多种 DNA 结合位点和 / 或增强子或沉默基因。增强子和 / 或沉默基因可以类似 地存在于本质上在启动子外的核酸序列上。理想地， 细胞或病毒增强子， 诸如巨细胞病毒 (CMV)早期增强子， 位于接近启动子的地方， 以增强启动子活性。 另外， 核酸序列上可以存在 剪接受体和供体位点， 以增强转录。 0034 在本发明

46、的上下文中任何适当的启动子或增强子序列都可以应用。在这方面， 编 码抗原的核酸序列可以可操作地连接到病毒启动子上。适当的病毒启动子包括， 例如， 巨 细胞病毒 (CMV) 启动子， 诸如 CMV 早期启动子 ( 例如， 在美国专利 5,168,062 和 5,385,839 中所描述 )， 衍生于人类免疫缺陷病毒 (HIV) 的启动子， 诸如 HIV 长末端重复启动子， 劳 斯肉瘤病毒 (RSV) 启动子， 诸如 RSV 长末端重复， 小鼠乳癌病毒 (MMTV) 启动子， HSV 启动 子， 诸如 Lap2 启动子或疱疹胸苷激酶启动子 (Wagner 等 .， Proc.Natl.Acad.S

47、ci.， 78， 144-145(1981)， 衍生于SV40或埃巴病毒的启动子， 腺伴随病毒启动子， 诸如p5启动子， 等 等。 0035 备选地， 本发明应用细胞启动子， 即， 促进细胞蛋白表达的启动子。优选地用于本 发明的细胞启动子将取决于产生抗原的理想的表达模式。一方面， 所述细胞启动子优选地 为在多种细胞类型， 诸如本文所述的免疫细胞中作用的组成型启动子。适当的组成型启动 子可以促进编码转录因子的基因， 持家基因， 或者真核细胞常见的结构基因的表达。例如， Ying Yang1(YY1) 转录因子 ( 也叫做 NMP-1， NF-E1 和 UCRBP) 是一种普遍存在的核转录因 子，

48、 其为核基质的固有组分 (Guo 等 .， PNAS， 92， 10526-10530(1995)。尽管认为本文所描 述的启动子是组成型启动子， 在本领域应该明白组成型启动子可以被上调节。启动子分析 表明， 相对于从启动子的转录起始位点， 基础转录的关键元件位于YY1基因的-277到+475， 并且包括 TATA 和 CCAAT 盒。JEM-1( 也叫做 HGMW 和 BLZF-1) 也是在正常和肿瘤组织中鉴别 出的普遍存在的核转录因子 (Tong 等 .， Leukemia， 12(11)， 1733-1740(1998)， 和 Tong 等 .， Genomics， 69(3)， 380-

49、390(2000)。JEM-1 参与细胞生长控制和成熟， 并且可以通过视黄酸 上调节。相对所述启动子的转录起始位点， 负责 JEM-1 启动子最大活性的序列位于 JEM-1 基因的 -432 到 +101。与 YY1 启动子不同， JEM-1 启动子不包括 TATA 盒。遍在蛋白启动子 (ubiquitin promoter)， 特别地 UbC， 是在一些物种中有作用的强组成型活性启动子。在 Marinovic 等 .， J.Biol.Chem.， 277(19)， 16673-16681(2002) 中进一步特征性描述 UbC 启 说 明 书 CN 1972958 B 9 7/35 页 10 动子。 0036 许多上文所述的启动子为组成型启动子。除了为组成型启动子， 所述启动子可以 为可调节启动子， 即， 应答适当的信号上调和 / 或下调的启动子。可调节启动子或表达控制 序列的应用特别适用于作为抗原蛋白的 DNA 疫苗开发， 所述抗原蛋白包括病毒和寄生虫抗 原， 通常对互补细胞系是毒性的。 在一个实施方案中， 可操作地连接到编码抗原的核酸序列 的调节序列包括四环素表达系统组分， 例如， tet 操纵子位点。例如， 将编码抗原的核酸序 列可操作地连接到启动子上， 所述启动子可操作地连接一种或多种 tet 操纵子位点。包括