细胞穿透性肽、包含该肽的缀合物、及包含该缀合物的组合物.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201380057722.4 (22)申请日 2013.09.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104768967 A (43)申请公布日 2015.07.08 (30)优先权数据 10-2012-0104144 2012.09.19 KR(续) (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2015.05.05 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/KR2013/008445 2013.09.17 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2014/046481 K

2、O 2014.03.27 (73)专利权人 珍白斯凯尔有限公司 地址 韩国大田广域市 专利权人 金商在 (72)发明人 金商在 (74)专利代理机构 北京三友知识产权代理有限 公司 11127 代理人 庞东成张培源 (51)Int.Cl. C07K 7/08(2006.01)(续) (56)对比文件 WO 00/02581 A1,2000.01.20,权利要求9- 14， 说明书第8页第3段至第9页第4段、 第15页第3 段、 第17页第3段. US 2007/0190561 A1,2007.08.16,权利要 求1-20、 序列605. US 2011/0318380 A1,2011.12.

3、29,权利要 求1， 说明书第620,649,732,1118-1137,2447段. Paal Fr. Brunsvig et al.Telomerase Peptide Vaccination in NSCLC: A Phase II Trial in Stage III Patients Vaccinated after Chemoradiotherapy and an 8-Year Update on a Phase I/II Trial. Clinical Cancer Research .2011,第17卷(第21期),OF1- OF11. Ritu Mishra et al.Ce

4、ll-Penetrating Peptides and Peptide Nucleic Acid-Coupled MRI Contrast Agents: Evaluation of Cellular Delivery and Target Binding. Bioconjugate Chem. .2009,第20卷1860- 1868. 审查员 毛颖 (54)发明名称 细胞穿透性肽、 包含该肽的缀合物、 及包含 该缀合物的组合物 (57)摘要 本发明公开了细胞穿透性肽、 作为活性成分 的缀合物及其应用。 具体而言， 本发明公开了具 有SEQIDNO:1至SEQIDNO:6中一种序列的细 胞穿

5、透性肽、 包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:6中 一种序列的片段的肽的缀合物、 或包含与所述肽 序列具有至少80同源性的肽的缀合物、 和包含 所述缀合物的组合物。 转续页 权利要求书1页 说明书21页 序列表9页 附图20页 CN 104768967 B 2019.02.15 CN 104768967 B (30)优先权数据 10-2012-0109216 2012.09.28 KR 10-2013-0017046 2013.02.18 KR 10-2013-0017169 2013.02.18 KR (51)Int.Cl. A61K 47/42(2017.01) 2/2 页 2 接上页

6、 CN 104768967 B 1.一种肽在制备包含所述肽与活性成分的缀合物的组合物中的应用， 其中， 所述肽为由SEQ ID NO:6的氨基酸序列构成的细胞穿透性载体肽， 并且所述细胞 穿透性载体肽将所述活性成分运输到细胞内。 2.如权利要求1所述的应用， 其中， 所述活性成分为选自蛋白质、 核酸、 肽、 对比造影剂 和荧光物质中的至少一种。 3.如权利要求1所述的应用， 其中， 所述活性成分为药物。 4.如权利要求1所述的应用， 其中， 所述载体肽通过共价键与所述活性成分直接缀合或 通过共价键与所述活性成分经接头间接缀合。 5.如权利要求1所述的应用， 其中， 所述载体肽及所述活性成分通过

7、非共价键缀合。 6.如权利要求2所述的应用， 其中， 所述活性成分为细胞因子、 抗体、 抗体片段、 治疗酶、 可溶受体或配体。 7.如权利要求1所述的应用， 其中， 所述载体肽与异硫氰酸荧光素结合。 8.如权利要求1所述的应用， 其中， 所述载体肽与绿色荧光蛋白结合。 9.如权利要求2所述的应用， 其中， 所述对比造影剂选自由不透射线对比造影剂、 顺磁 对比造影剂、 超顺磁对比造影剂及CT对比造影剂组成的组。 10.如权利要求9所述的应用， 其中， 所述对比造影剂基于铁。 11.如权利要求10所述的应用， 其中， 所述对比造影剂为二茂铁羧酸盐。 12.如权利要求2所述的应用， 其中， 所述对比

8、造影剂用于对比造影细胞。 13.如权利要求12所述的应用， 其中， 所述细胞为干细胞。 14.如权利要求1所述的应用， 其中， 所述活性成分用于治疗或预防疾病， 且所述组合物 为药物组合物。 15.如权利要求1所述的应用， 其中， 所述活性成分为功能性化妆品的活性成分， 且所述 组合物为化妆品组合物。 16.如权利要求1所述的应用， 其中， 所述活性成分为健康功能食品的活性成分， 且所述 组合物为健康食品组合物。 17.一种细胞穿透性载体肽与活性成分的缀合物， 其中， 所述载体肽由SEQ ID NO:6的 氨基酸序列构成， 其中， 所述载体肽与异硫氰酸荧光素缀合。 18.一种细胞穿透性载体肽与

9、活性成分的缀合物， 其中， 所述载体肽由SEQ ID NO:6的 氨基酸序列构成， 其中， 所述载体肽与绿色荧光蛋白缀合。 19.一种细胞穿透性载体肽与活性成分的缀合物， 其中， 所述载体肽由SEQ ID NO:6的 氨基酸序列构成， 其中， 所述活性成分是选自由不透射线对比造影剂、 顺磁对比造影剂、 超 顺磁对比造影剂及CT对比造影剂组成的组的对比造影剂。 20.如权利要求19所述的缀合物， 其中， 所述对比造影剂基于铁。 21.如权利要求20所述的缀合物， 其中， 所述对比造影剂为二茂铁羧酸盐。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104768967 B 3 细胞穿透性肽、 包含该肽的缀合物

10、、 及包含该缀合物的组合物 技术领域 0001 本发明涉及源自 人端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase； hTERT)的细胞穿透性肽、 细胞穿透性肽及活性成分的缀合物、 以及包含该 缀合物的组合物。 背景技术 0002 尽管低分子量物质、 核酸、 蛋白质、 纳米粒子等在分子水平上具有作为治疗物质的 极大可能性潜力， 但低分子量物质、 核酸、 蛋白质、 粒子等的使用其应用由于不能无能力穿 透组织及细胞膜而受限。 输送此类物质至细胞内的的系统的开发展已成为过去二十年来活 跃的研究领域。 细胞内部运输物质已成为分子处理治疗方法中的的话题。 低

11、分子量物质、 核 酸或纳米粒子通过系通过多种若干试剂、 电穿孔或热休克而运送到运输到细胞内。 然而， 难 以找到一种适当方法在不破坏蛋白质的活性及完整性的情况下将蛋白质输送到在细胞内 部输送蛋白质。 在20世纪80年代， 在对人类人免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus； HIV)的细胞穿透能力进行的研究中， 已发现， 由特定的11种个氨基酸构组成的的 HIV-TAT蛋白质在于在向细胞内部的运输的过程中起重要作用。 因此， 在20世纪90年代， 探 索运输到细胞内蛋白质将蛋白质运输到细胞内的恰当方法的研究成为重点研究领域。 0003 已知端粒是染色体末端发现的遗

12、传物质重复序列， 端粒防止染色体损伤或防止合 并至其它染色体上。 端粒的长度在每次细胞分裂时缩短， 且在一定次数的细胞分裂的后， 端 粒长度极度缩短至细胞停止分裂且死亡的程度。 在另一方面， 已知端粒延伸可延长细胞的 寿命。 作为实例， 癌细胞分泌称为端粒酶的酶， 该酶防止端粒缩短， 因此导致癌细胞增殖。 0004 本发明的目标在于提供一种新型肽。 0005 本发明的另一目标在于提供编码该新型肽的多核苷酸。 0006 本发明的另一目标在于提供细胞穿透性肽。 0007 本发明的另一目标在于提供作为细胞内活性成分的载体的有用的肽。 0008 本发明的另一目标在于提供作为细胞内活性成分的载体的有用的

13、肽， 尤其是将活 性成分局部地输送至粒线体的有用的肽。 0009 本发明的另一目标在于提供用于输送活性成分至粒线体以改善、 预防或治疗粒线 体相关疾病或病症的有用的肽。 0010 本发明的另一目标在于提供活性成分与细胞穿透性肽缀合成的缀合物。 0011 本发明的另一目标在于提供包含活性成分与细胞穿透性肽的缀合物的组合物。 0012 本发明的另一目标在于提供包含活性成分与细胞穿透性肽的缀合物的药物组合 物。 0013 本发明的另一目标在于提供包含活性成分与细胞穿透性肽的缀合物的功能性化 妆组合物。 0014 本发明的另一目标在于提供包含活性成分与细胞穿透性肽的缀合物的健康食品 组合物。 说明书

14、1/21 页 3 CN 104768967 B 4 0015 本发明的另一目标在于提供包含活性成分与细胞穿透性肽的缀合物的对比造影 剂。 发明内容 0016 根据本发明的一个实施方式的缀合物可为细胞穿透性载体肽与活性成分的缀合 物， 其中所述载体肽为包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中至少一个氨基酸序列的肽、 与上 述序列具有至少80同源性的肽、 或上述肽的片段， 且其中具有至少80同源性的所述肽 和所述片段保留SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中的任一氨基酸序列的细胞穿透能力。 0017 根据本发明中的缀合物的另一实施方式， 所述片段可由3个或更多氨基酸构成。 0

15、018 根据本发明中的缀合物的另一实施方式， 所述载体肽可由30个或更少氨基酸构 成。 0019 根据本发明中的缀合物的另一实施方式， 上述载体肽可为由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任一氨基酸序列构成的肽。 0020 根据本发明的一个实施方式的对比造影剂可包含上述的任一种缀合物。 0021 根据本发明的一个实施方式的对比造影剂可用于细胞对比造影。 0022 根据本发明的对比造影剂的另一实施方式， 所述细胞可为干细胞。 0023 根据本发明的一个实施方式的组合物可包含上述的任一种缀合物。 0024 根据本发明的组合物的另一实施方式， 所述活性成分可用于治疗或预防疾病， 且 所述

16、组合物可为药物组合物。 0025 根据本发明的组合物的另一实施方式， 所述活性成分可为用于功能性化妆品的活 性成分， 且所述组合物可为化妆品组合物。 0026 根据本发明的组合物的另一实施方式， 所述活性成分可为用于功能健康食品的活 性成分， 且所述组合物可为健康食品组合物。 0027 根据本发明方法的一个实施方式， 所述方法可为用于输送活性成分至细胞内的方 法， 其中该方法包括对有需要的对象施用权利要求1至12中任一项所述的缀合物， 且其中载 体肽为将活性成分输送至细胞内的细胞穿透性肽， 且其中具有至少80同源性的所述肽及 上述肽的片段保留由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任

17、一氨基酸序列构成的肽的细胞穿透 能力。 0028 根据本发明的方法的另一实施方式， 所述方法可用于将所述活性成分局部地输送 至细胞内部的粒线体内。 0029 根据本发明细胞穿透性肽的另一实施方式， 上述载体肽可以为具有SEQ ID NO:1 至SEQ ID NO:6中任意一个或多个氨基酸序列的肽。 0030 根据本发明的多核苷酸可编码上述细胞穿透性肽。 0031 根据本发明的载体可包含上述多核苷酸。 0032 根据本发明的转化细胞可包含上述载体。 0033 产业利用性 0034 难以运输到细胞内的活性成分可通过使用本发明所公开的肽或肽及活性成分的 缀合物而易于运输到细胞内。 这意味着可增加活性

18、成分的功效且因此可减少活性成分的剂 量。 因此， 可最小化由于药物施用造成的副作用且可增加治疗的有效性。 特别地， 当将药物 说明书 2/21 页 4 CN 104768967 B 5 局部地输送至粒线体内时， 可改善粒线体相关的疾病或病症， 且可增加疾病预防及治疗疾 病的有效性。 在化妆品的情况中， 通过少量活性成分可产生显著效果。 通过使肽与对比造影 物质缀合， 可将该肽用作对比造影物质以监测细胞移植的过程或在细胞治疗中的移植细 胞。 特别地， 该肽可实际上用作用于注入身体内的干细胞的对比造影物质。 附图说明 0035 图1描绘SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的报告基因是通过

19、重组DNA克隆法制备的增 强型绿荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein； EGFP)融合构建体。 0036 图2至图7描绘通过流式细胞术分析的在FITC与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的肽 融合后治疗的HeLa细胞中细胞摄入的细胞数量。 对照细胞仅以FITC处理。 0037 图8至图11描绘通过流式细胞术分析的在FITC与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:6的肽融合后治疗的Huh7细胞中细胞摄入的细胞数量。 对照细胞仅以FITC处理。 0038 图12至图15描绘通过流式细胞术分析的在FITC与SEQ

20、ID NO:1至SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:6的肽融合后治疗的人T淋巴球细胞系(Jurkat细胞)中细胞摄入的细胞数量。 对 照细胞仅以FITC处理。 0039 图16至图21描绘通过流式细胞术分析的在FITC与SEQ ID No:1至SEQ ID NO:6的 肽融合后治疗的HeLa细胞的毒性及细胞活性的结果。 对照细胞仅以FITC处理。 0040 图22至图27描绘通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析的pep(CPP)-EGFP融合蛋白 的细胞穿透。 具体实施方式 0041 尽管蛋白质、 核酸、 肽或病毒等具有作为治疗物质的极大可能性潜力， 但蛋白质、 核酸、 肽或病毒等的使用

21、由于无能力不能穿透组织及细胞膜而受限。 即使分子大小很小， 但 该等这种分子由于分子的结构或特性而无法穿透脂质双层。 因此， 试图经由通过使用电穿 孔、 热休克等将蛋白质、 核酸、 肽或病毒运输到细胞内； 难以在既不破坏细胞膜又保持上述 分子的活性状态的情况下转移彼等所述蛋白质、 核酸、 肽或病毒。 已进行的许多研究显示源 自人免疫缺乏病毒(Human Immuno-deficiency Virus； HIV)的反式转录活化因子(Trans- Activating Transcriptional activator； TAT activator)蛋白质可用作细胞穿透性肽， 该细胞穿透性肽可将巨

22、极大的活性物质到运输细胞内。 具体地， 已进行了关于下列物质的 研究， 与在细胞内部产生毒性的TAT蛋白质不同， 该等该物质可在不产生任何毒性的情况下 运输诸如蛋白质、 核酸、 肽或病毒的极巨大分子到细胞内。 因此， 本发明是通过本发明人发 现源自端粒酶的肽具有作为细胞穿透性肽的显著功效而无显著明显毒性而完成的。 0042 肽在下表1中所示的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6公开。 SEQ ID NO:8是人端粒酶蛋 白质的全长序列。 下表1中的 “名称” 系用于区别肽。 在本发明的不同特定实施方式中， 在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中超过一个肽包括 “合成肽”

23、， 即， 端粒酶的选定区域的合成肽。 在本 说明书中， 术语 “pep” 在本文系指具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任一氨基序列者的肽、 包含与上述序列具有超过80同源性的氨基酸序列的肽或上述肽的片段。 0043 表1 说明书 3/21 页 5 CN 104768967 B 6 0044 说明书 4/21 页 6 CN 104768967 B 7 0045 0046 在本发明的一个实施方式中， 一种多核苷酸编码以下的肽： 包含SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:6中至少一个氨基酸序列的肽， 与上述序列具有至少80同源性的肽或作为上 述肽的片段的肽。 如上所述的多核

24、苷酸能够使得所述肽大量地产生。 举例而言， 培养包括编 码肽的多核苷酸的载体使得肽大量产生。 0047 本文公开的肽可包括包含同源性超过80、 超过85、 超过90、 超过95、 超过 96、 超过97、 超过98、 超过99的氨基酸序列的肽。 此外， 本发明中所公开的肽可包 括： 包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任一氨基酸序列的肽或该肽的片段， 及具有超过1个 转化(transformed)氨基酸、 超过2个转化氨基酸、 超过3个转化氨基酸、 超过4个转化氨基 酸、 超过5个转化氨基酸、 超过6个转化氨基酸或超过7个转化氨基酸的肽。 0048 在本发明的一个实施方式中，

25、氨基酸序列中的改变属于肽的物理及化学特性的变 化。 举例而言， 氨基酸转化可经执行而用于改善肽的热稳定性、 改变底物特异性及改变最佳 pH值。 0049 术语 “氨基酸” 在本文不仅包括经天然引入到肽中的22种标准氨基酸， 还包括D-异 构体及转化氨基酸。 因此， 在本发明的特定实施方式中， 本文的肽包括具有D-氨基酸的肽。 在另一方面， 肽可包括非标准氨基酸， 诸如已经翻译后修饰的那些氨基酸。 翻译后修饰的实 例包括磷酸化、 糖基化、 酰化(包括乙酰化、 豆蔻酰化、 棕榈酰化)、 烷化、 羧化、 羟化、 糖化、 生 物素化、 泛素化、 化学性质的转化(例如， -移除脱酰亚胺、 脱酰胺)及结构

26、转化(例如， 形成 双硫键)。 同样， 包括氨基酸的改变， 氨基酸由于在为形成肽缀合物而与交联剂组合过程中 发生化学反应而发生改变。 0050 本文公开的肽可为已经识别且从天然源分离出的野生型肽。 在另一方面， 当与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任一氨基酸序列的肽片段相比时， 本文公开的肽可为人工突变株 突变体， 该人工突变株包含一个或多个经取代、 删除缺失及/或嵌入添加的一或更多个氨基 酸。 在野生型多肽中变化(不仅在人工突变株中)的氨基酸变化包含不显著影响活性蛋白质 折迭折叠及/或活性的氨基酸的保守取代。 保守取代的实例属于由碱性氨基酸(精氨酸、 赖 氨酸及组氨酸)、 酸

27、性氨基酸(谷氨酸及天冬氨酸)、 极性氨基酸(谷酰胺及天冬酰胺)、 疏水 性氨基酸(亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸及甲硫氨酸)、 芳香族氨基酸(苯丙氨酸、 色氨酸及酪氨 说明书 5/21 页 7 CN 104768967 B 8 酸)及小型氨基酸(甘氨酸、 丙氨酸、 丝氨酸及苏氨酸)组成的组。 通常不改变特定活性的氨 基酸取代在本技术领域中已知。 最常发生的变化为丙氨酸/丝氨酸、 缬氨酸/异亮氨酸、 天冬 氨酸/谷氨酸、 苏氨酸/丝氨酸、 丙氨酸/甘氨酸、 丙氨酸/苏氨酸、 丝氨酸/天冬酰胺、 丙氨酸/ 缬氨酸、 丝氨酸/甘氨酸、 酪氨酸/苯丙氨酸、 丙氨酸/脯氨酸、 赖氨酸/精氨酸、 天冬氨酸/

28、天 冬酰胺、 亮氨酸/异亮氨酸、 亮氨酸/缬氨酸、 丙氨酸/谷氨酸、 天冬氨酸/甘氨酸， 及相反的变 化。 保守取代的另一实例显示在下表2中。 0051 表2 0052 0053 肽的生物学性质的实质转化通过选择下列功效方面的显著不同的置换而执行： (a)保持置换区域中的多肽主链结构的功效， 诸如片状或三维螺旋结构， (b)保持靶区域中 分子的电荷或疏水性的功效， 或(c)保持侧链的整体的功效。 自然残基根据一般侧链性质划 分成如下组： 0054 (1)疏水性： 正亮氨酸、 甲硫氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸； 0055 (2)中性亲水性： 半胱氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸； 00

29、56 (3)酸性： 天冬氨酸、 谷氨酸； 0057 (4)碱性： 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 组氨酸、 赖氨酸、 精氨酸； 说明书 6/21 页 8 CN 104768967 B 9 0058 (5)影响链取向(chain orientation)的残基： 甘氨酸、 脯氨酸； 和 0059 (6)芳香性： 色氨酸、 酪氨酸、 苯丙氨酸。 0060 非保守置换可通过将上述种类的成员更换为不同种类的成员而进行。 与保持肽的 适当三维结构无关的任何半胱氨酸残基可通常经置换为丝氨酸， 因此增加分子的氧化稳定 性且防止不适当交联。 反之， 稳定性的改善可通过给肽添加一个或更多个半胱氨酸键而实 现。 0061

30、 肽的氨基酸变体的经改变类型为已改变抗体糖基化方式的那些氨基酸。 术语 “改 变” 在本文是指删除在肽中发现的至少一个糖残基和/或添加在肽内不存在的至少一个糖 基化残基。 0062 肽中的糖基化作用通常经N连接或O连接。 术语 “N-连接” 在本文是指将糖残基附着 至天冬酰胺残基的侧链。 作为三肽序列， 天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X 为除脯氨酸的外的任何氨基酸)为用于将糖残基酶法附着至天冬酰胺的侧链的识别序列。 因此， 在多肽中存在该三肽序列中的一种的情况下， 创建可能的糖基化作用位点。“O-连接 糖基化作用” 意味着将糖N-乙酰半乳胺糖、 半乳糖或木糖中的一种附着至羟基

31、氨基酸。 羟基 氨基酸大部分通常为丝氨酸或苏氨酸， 但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。 0063 对肽添加糖基化作用位点通过改变氨基酸序列为含有上述三肽序列(用于N连结 的糖基化作用位点)而便利地执行。 该改变可通过给第一抗体序列添加至少一个丝氨酸或 苏氨酸残基或通过以那些残基(用于O连结的糖基化作用位点)置换而进行。 0064 在本发明的一个实施方式中， 提供包含肽的细胞穿透肽， 其中该肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任一氨基酸序列， 该肽具有与上述序列超过80同源性的氨基酸序 列， 或肽为上述肽的片段。 0065 在本发明的一个实施方式中， 提供药物组合物，

32、该药物组合物包含肽作为运送一 个以上活性成分的药物递送系统， 其中该肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任一氨基酸 序列， 该肽具有与上述序列超过80的同源性， 或该肽为上述肽的片段。 0066 包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任一氨基酸序列的肽、 上述肽的片段或与上述 序列具有超过80同源性的肽是安全的且具有作为细胞穿透肽的显著功效。 因此， 肽可与 药物缀合以在细胞内部运送药物。 0067 在本发明的一个实施方式中， 提供肽与待运送的活性成分的缀合物， 其中该肽包 含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任一氨基酸序列， 该肽为上述肽的片段或

33、该肽与上述肽具 有超过80的同源性。 在本发明的一个实施方式中， 活性成分可为选自以下物质中的至少 一种： 蛋白质、 核酸、 肽、 脂质、 醣脂质、 矿物质、 糖、 对比造影物质、 药物和化合物。 在本发明 的一个实施方式中， 活性成分可为肽。 在本发明的一个实施方式中， 活性成分可为细胞因 子、 抗体、 抗体片段、 治疗性酶、 可溶性受体或配体。 0068 本文揭示的细胞穿透肽意指可自体外和/或体内运送货物(cargo)至细胞内部的 肽。 本文揭示的 货物 包含可通过与细胞穿透肽的缀合作用在细胞内部运送的所有物质， 例如， 想要增加细胞穿透功效的所有物质， 具体而言， 药物、 化妆品或健康食

34、品的活性成分， 更具体而言， 无法通过一般途径在细胞内部运送的物质， 更具体而言， 糖、 纳米颗粒、 生物制 剂、 病毒、 对比造影物质或其它化合物， 该其它化合物可例如具有蛋白质、 核酸、 肽、 矿物质、 葡萄糖， 但不限于那些物质。 本文揭示的 “药物” 为宽泛概念， 包括待运送用于缓和、 预防、 治 说明书 7/21 页 9 CN 104768967 B 10 疗或诊断疾病、 创伤或特定症状的物质。 0069 本文揭示的 “载体肽” 为可通过与活性成分的缀合作用运送活性成分至靶位点的 肽。 0070 在本发明的一个实施方式中， 作为货物的蛋白质或肽包含以下的一或更多者： 激 素、 激素类

35、似物、 酶、 酶抑制剂、 信号转移蛋白质(或肽)、 抗体和疫苗， 但不限于那些物质。 在 本发明的一个实施方式中， 核酸为以下分子： 可为自发或人工的、 单链或双链的DNA分子或 RNA分子。 核酸分子可为相同类型(例如， 具有相同的核苷酸序列)的一或更多个核酸或不同 类型的核酸。 核酸分子包含以下的一或更多者： DNA、 互补DNA(cDNA)、 诱饵DNA(decoy DNA)、 RNA、 小干扰RNA(siRNA)、 微小RNA(miRNA)、 小发夹式RNA(shRNA)、 小时序RNA(stRNA)、 小核 仁RNA(snoRNA)、 小胞核RNA(snRNA)、 戊糖核酸(pent

36、ose nucleic acid； PNA)、 反义寡聚物、 质粒和其它修饰核酸， 但不限于那些物质。 在本发明的一个实施方式中， 病毒包含全病毒或 包括病毒的核酸的病毒核心。 在本发明的一个实施方式中， 化学物质为包含天然或合成物 质的宽泛指示， 该天然或合成物质可充当药物。 0071 其中特定DNA表达在DNA表达的过程中通过双链RNA(double stranded RNA； dsRNA)控制的现象被称为RNA干扰； RNAi。 因为该现象于1998年在C线虫中首先发现， 据发 现， 该现象在植物、 果蝇和哺乳动物中是常见的(Fire等人，自然 ， 391:806-811， 1998年；

37、 Novina & Sharp，自然 ， 430:161-164， 2004年)。 0072 RNA干扰通过具有19-25bps的dsRNA调控， 该dsRNA进入细胞、 接着与RNA诱导沉默 复合体(RNA-induced silencing complex； RISC)结合。 dsRNA至互补信使RNA(messenger RNA； mRNA)序列的反义链的结合通过在RISC复合体内发现的核酸内切酶触发目标信使RNA 的降解(Rana,T.M.， Nat.Rev.Mol.Cell Biol.， 8:23-36， 2007年； Tomari,Y.和Zamore, P.D.， Genes De

38、v.， 19:517-529， 2005年)。 换言之， 小干扰RNA通过抑制特定蛋白质的产生且 因此干扰DNA表达而包括在RNA干扰中。 由19至23个核苷酸组成的小干扰RNA根据信使RNA对 于形成双链RNA的特定mRNA的互补顺序形成碱基对。 随后， 在信使RNA自细胞移除的同时特 别分解双链RNA。 小干扰RNA已作为用于基因治疗的物质而受到关注， 因为小干扰RNA在近代 动物研究中显示了对抑制特定DNA的表达的显著的效应。 在过去20年里已研究了具有DNA的 较高活化和精确选择的小干扰RNA， 且期望替换目前正用作治疗物的反义寡核苷酸。 因此， 许多药物公司现在正开发基于小干扰RNA

39、的治疗物。 与现有反义寡核苷酸相比， 小干扰RNA 系熟知为以少10倍的数量抑制基因表达且仅以基因的显著选择性抑制目标基因。 小干扰 RNA技术， 特别对于治疗目的， 具有显著益处， 因为小干扰RNA技术与其它药物相比可容易设 计且具有诸如高目标选择性和抑制特定基因表达的特性。 同样， 因为通过RNA干扰抑制基因 表达利用体内天然存在的机制， 故毒性很低。 然而， 小干扰RNA具有无法将该小干扰RNA轻易 运送至细胞内的缺点， 因为小干扰RNA由于小干扰RNA是阴离子而无法穿透细胞膜且由于体 内低稳定性的原因容易在短时间周期内被分解。 小干扰RNA的此缺点可通过与本文揭示的 载体肽缀合来解决。

40、 0073 在本发明的一个实施方式中， 通过细胞穿透肽在细胞内部运送的药物可包含一个 或更多个药物运送载体， 诸如脂质粒、 胶束、 纳米颗粒、 磁性颗粒或量子点。 0074 本文揭示的术语 “对比造影物质” 为宽泛指示， 该宽泛指示包含用来在医学影像中 对比躯体内的结构或流体的所有物质。 适当对比造影物质包含不透射线对比造影剂、 顺磁 说明书 8/21 页 10 CN 104768967 B 11 对比造影剂、 超顺磁对比造影剂、 计算机断层扫描(computed tomography； CT)和其它对比 造影物质， 但不限于那些物质。 举例而言， 不透射线对比造影剂(用于X射线影像)将包含无

41、 机碘化合物和有机碘化合物(例如， 泛影酸盐(diatrizoate)、 不透射线金属和该不透射线 金属的盐(例如， 银、 金、 铂等)和其它不透射线化合物(例如， 钙盐、 诸如硫酸钡的钡盐、 钽和 氧化钽)。 适当的顺磁对比造影物质(用于MR影像)包含钆二乙三胺五乙酸(gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid； Gd-DTPA)和Gd-DTPA的衍生物、 其它钆、 锰、 铁、 镝、 铜、 铕、 铒、 铬、 镍和钴复合体， 例如， 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N ,N” ,N” -四乙酸 (1,4,7,10-tetraazacycl

42、ododecan-N,N ,N” ,N” -tetraacetic acid； DOTA)、 乙二胺四乙 酸(ethylenediaminetetraacetic acid； EDTA)、 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,-N ,N” -三 乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,-N ,N” -triacetic acid； DO3A)、 1,4,7-三氮杂 环壬烷-N,N ,N” -三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-N,N ,N” -TRIACETIC ACID； NOTA)、 1, 4,8,10-四氮杂环十四烷-N,N ,N” ,

43、N” -四乙酸(1,4,8,10-tetraazacyclotetradecane-N, N ,N” ,N” -tetraacetic acid； TETA)、 羟基苄基乙二胺二乙酸(hydroxybenzylethylene- diamine diacetic acid； HBED)。 适当的超顺磁对比造影物质(用于MR影像)包含磁铁矿、 超 顺磁氧化铁(super-paramagnetic iron oxide； SPIO)、 超小超顺磁氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide； USPIO)和单晶氧化铁。 其它适当的对比造影物质为碘化、 非碘

44、化、 离子和非离子的CT对比造影剂、 类似旋转标记或诊断上有效制剂的对比造影物质。 0075 对比造影物质的其它实例包含 -半乳糖苷酶、 绿色荧光蛋白、 青色荧光蛋白、 荧光 素酶(但不限于那些物质)和编码在表示于细胞内时可容易检测到的蛋白质的标识基因。 可 使用各种标记， 诸如放射性同位素、 flour、 酶、 酶基质、 酶辅因子、 酶抑制剂、 配体(尤其是半 抗原(heptan)。 0076 在本发明的一实例中， 对比造影物质为下文化学式2的二茂铁羧酸。 二茂铁的结构 系表示在化学式1中。 0077 化学式1 0078 0079 化学式2 0080 0081 在本发明的一个实例中， 细胞穿

45、透肽与对比造影物质的缀合物为下文化学式3中 表示的二茂铁羧基-pep。 0082 化学式3 说明书 9/21 页 11 CN 104768967 B 12 0083 0084 在本发明的一个实施方式中， 肽或组合物可与一个或更多个可检测标记融合。 标 记可为可在化学反应、 物理反应或酶反应中检测到的化合物或在反应中直接或间接地产生 信号的化合物。 标记和检测随后可根据此技术领域所熟知的方法来执行(例如， Sambrook, J.和Russel,D.W.(2001)； 和Lottspeich,F.和Zorbas H.(1998)Bioanalytik， Spektrum Akademischer

46、 Verlag， 海德堡/柏林， 德国)。 标记包含荧光标记、 酶标记、 显色标记、 发光标 记、 辐射标记、 半抗原、 生物素、 金属复合体、 金属和胶体金， 但不限于那些标记。 该标记的所 有形式在此工作领域是众所周知的， 该标记的所有形式可自各供货商购得。 0085 在本发明的一个实施方式中， 货物可与肽直接结合。 在本发明的另一个实施方式 中， 货物可通过诸如共价键或非共价键的各种类型的键与肽结合。 例如， 在本发明的一个实 施方式中， 货物可与肽的N端或C端结合。 举例而言， 货物可通过二硫键或共价键键结至肽。 共价键为可将货物键结至N端谷氨酸的 -胺或C端赖氨酸残基的胺的键。 同样

47、， 肽和货物可 通过非共价键结合， 此可使肽或货物可将彼此封装为胶囊形式。 0086 在本发明的另一个实施方式中， 肽可通过接头与货物结合。 举例而言， 肽可通过在 将诸如联肼尼克酰胺(6-肼基吡啶-3-羧酸)接头(Hynic(6-hydrazinopyridine-3- carboxylic acid)linker)的接头引入N端谷氨酸的 -胺或C端赖氨酸残基的胺之后将货物 结合至接头而与货物结合。 0087 在本发明的另一个实施方式中， 当货物为DNA或RNA时， 将SH基团(硫醇基)引入肽， 且将马来酰亚胺基引入DNA或RNA， 随后， 肽的SH基团和DNA或RNA的马来酰亚胺基结合，

48、因此 产生在货物与肽之间的结合。 0088 在本发明的另一个实施方式中， 当货物为肽或蛋白质时， 表达货物的DNA与表达载 体肽的DNA结合， 且通过表达该DNA结合， 可将货物与肽结合为融合蛋白质的形式。 通过融合 蛋白质结合的特定实例如下： 当制造引物用于产生融合蛋白质时， 编码载体肽的核苷酸经 附着在表达货物的核苷酸前面， 且使用限制酶将所获得核苷酸嵌入诸如聚对苯二甲酸乙二 醇酯(Polyethylene Terephthalate； pET)载体的载体， 且核苷酸系以转化到诸如BL-21 (DE3)的细胞中来表达。 此时， 融合蛋白质将通过以类似异丙基-1-硫代- -D-半乳糖吡喃糖

49、苷(isopropyl-1-thio- -D-galactopyranoside； IPTG)的表达诱导制剂处理该融合蛋白质 而有效表达。 随后， 所表达的融合蛋白质系通过His标签纯化来纯化， 且以PBS透析， 且经添 加至试剂盒以在2000rpm至4000rpm、 5至20分钟的此类条件下通过离心分离作用而浓缩。 0089 在本发明的一个实施方式中， 载体肽与染色物质、 荧光物质、 特别是异硫氰酸荧光 素(fluorescein isothiocyanate； FITC)或绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein； GFP)结合。 在本发明的一个实施方式中， FITC系与在载体肽的N端或C端的赖氨酸的胺基 (NH3+)结合。 在其中赖氨酸不存在于肽的端的肽情况中， 肽可通过包括赖氨酸的接头与 说明书 10/21 页 12 CN 104768967 B 13 FITC结合。 0090 本文揭示的载体肽可以1:1的摩尔分数