一种高效表达制备UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811331180.6 (22)申请日 2018.11.09 (71)申请人 沈阳农业大学 地址 110000 辽宁省沈阳市东陵路120号 133栋1-3-2 (72)发明人 李拖平李苏红佟超男孙玥 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 胡洋 (51)Int.Cl. C12N 15/75(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 9/12(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称

2、一种高效表达制备UDP-葡萄糖-己糖-1-磷 酸尿苷酰转移酶的方法 (57)摘要 本发明涉及一种高效表达制备UDP-葡萄糖- 己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的方法， 是将UDP-葡 萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GalT)基因与 枯草芽孢杆菌用载体构建重组表达载体。 然后将 重组表达载体转化至枯草芽孢杆菌中构建重组 工程菌。 将重组工程菌在液体培养基中诱导培 养， 菌液离心， 取上清液。 本发明的方法UDP-葡萄 糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶产量高， 蛋白较纯 净， 回收纯化容易， 生产操作简单， 为GalT的工业 化大规模生产提供了便利， 提高了产量， 省时省 力， 节约成本。 尤其是对该

3、酶在食品工业中的应 用提供了安全保障， 具有重大意义。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 109295087 A 2019.02.01 CN 109295087 A 1.一种高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达载体， 其特征在 于， 所述的重组表达载体是将UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因与表达载体连 接， 构建的重组表达载体； 所述的表达载体是枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆 菌用穿梭载体。 2.根据权利要求1所述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达 载体， 其特征在于， 所述的表达载体是pHT系列载

4、体、 穿梭载体pMA5或穿梭载体pWB980。 3.根据权利要求2所述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达 载体， 其特征在于， 所述的pHT系列载体是pHT43、 pHT304或pHT01载体。 4.根据权利要求1所述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达 载体， 其特征在于， 所述的表达载体中含有或不含有蛋白纯化标签的。 5.根据权利要求1所述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达 载体， 其特征在于， 所述的蛋白纯化标签是组氨酸(His-tag)标签。 6.一种高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重

5、组工程菌， 其特征在于， 是将权利要求1-5任一项所述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表 达载体转化至宿主菌中构建的重组工程菌； 所述的宿主菌是枯草芽孢杆菌。 7.根据权利要求5所述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组工程 菌， 其特征在于， 所述的转化为电转化。 8.一种高效表达制备UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的方法， 其特征在于， 方 法如下： 将权利要求6或7所述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组工 程菌以1-10的接种量接种于液体培养基中， 于60-200rpm培养至OD6000.3-1.0时， 加入

6、 IPTG至终浓度为0.1-1.5mM， 然后在20-40、 80-220rpm条件下诱导培养9-36小时， 菌液 离心， 取上清液。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于： 所述的液体培养基是含有抗生素的LB液体 培养基。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109295087 A 2 一种高效表达制备UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的 方法 技术领域 0001 本发明涉及一种能高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组工程 菌以及用改进高效表达制备UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的方法， 属于基因工程 技术领域。 背景技术 0002 UDP-葡萄糖-己

7、 糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 (UDP-glucose-hexose 1- phosphaturidylyltransferase,GalT)， 又称己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶， 或半乳糖-1-磷酸 尿苷酰转移酶， 是由galt基因编码的催化UDP-glucose、 galactose-1-phosphate和UDP- galactose、 glucose-1-phosphate之间转化的蛋白酶。 其中glucose-1-phosphate是大多数 细胞主要的能量来源， 同时UDP-galactose是蛋白质和脂肪的重要组成部分， 这种经过修饰 的蛋白质在化学信号， 构建细胞结构， 转移小分子物

8、质， 制造能量方面发挥着重要的作用。 此外， 枯草芽孢杆菌被认为是动物肠道内的益生菌， 安全性高， 可应用于食品、 药品等工业 中， 具有非致病性； 外源DNA获取方便， 不仅质粒可作为异源基因的克隆载体， 噬菌体也可以 应用于此， 具有较强的遗传特性； 蛋白的分泌系统较为完善， 分泌的外源蛋白可跨过细胞膜 直接释放到细胞外， 具有较强的蛋白分泌能力， 从而简化蛋白的回收和纯化过程， 适用于工 业化生产； 在较为简单的培养基中培养， 就能达到很高的菌密度， 适用于工业化生产。 然而 现有技术中， UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶在野生菌中提取时的产率很低， 分离 精制困难， 不适合大

9、批量的制备。 有通过大肠杆菌表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转 移酶的， 但在大肠杆菌中是胞内表达， 易形成包涵体， 同时， 酶蛋白的获取需要对细胞进行 破碎处理， 杂蛋白含量高， 分离精制困难， 操作繁琐耗时， 蛋白表达量也不高。 发明内容 0003 为了解决上述技术问题， 本发明的目的之一是采用基因工程技术构建一种高效表 达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达载体及重组工程菌。 0004 本发明的目的之二是提供一种产量高， 蛋白较纯净， 回收纯化容易， 生产操作简单 的利用重组工程菌生产UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的方法。 0005 本发明采用的技术方

10、案是： 一种高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 的重组表达载体， 所述的重组表达载体是将UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GalT基 因与表达载体连接， 构建的重组表达载体； 所述的表达载体是枯草芽孢杆菌用载体或大肠 杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体。 0006 进一步的， 上述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达载 体， 所述的表达载体是pHT系列载体、 穿梭载体pMA5或穿梭载体pWB980等。 但不限于这些载 体， 所有枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体均可使用。 0007 更进一步的， 上述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1

11、-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达 说明书 1/6 页 3 CN 109295087 A 3 载体， 所述的pHT系列载体是pHT43、 pHT304或pHT01载体。 0008 进一步的， 上述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达载 体， 所述的表达载体中含有或不含有蛋白纯化标签。 0009 更进一步的， 上述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组表达 载体， 所述的蛋白纯化标签是组氨酸(His-tag)标签。 0010 一种高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组工程菌， 是将上述的 高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶

12、的重组表达载体转化至宿主菌中构建的 重组工程菌； 所述的宿主菌是枯草芽孢杆菌。 0011 进一步的， 上述的一种高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组工 程菌， 所述的转化为电转化。 0012 一种高效表达制备UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的方法， 具体如下： 将 上述的高效表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的重组工程菌以1-10的接种量 接种于液体培养基中， 于60-200rpm培养至OD6000.3-1.0时， 加入IPTG至终浓度为0.1- 1.5mM， 然后在20-40、 80-220rpm条件下诱导培养9-36小时， 菌液离心， 取上清液，

13、回收 蛋白。 0013 进一步的， 所述的液体培养基是含有抗生素的LB液体培养基。 0014 本发明的有益效果是： 0015 1 、 本 发 明 ， 采 用的 表 达 菌 株 是 枯 草 芽 孢 杆 菌 ， 该 菌 株 被 认 证 为 G R A S (GenerallyRecognized as Safe)， 在食品工业中可安全应用。 它具有很高的应用价值， 其 培养简单快速， 具有较强的分泌蛋白质的能力、 非致病性及良好的发酵基础和生产技术。 GalT在该表达系统中是细胞外分泌蛋白， 且蛋白较纯净， 回收纯化容易， 生产操作简单且省 时。 0016 2、 本发明采用基因工程技术， 将Gal

14、T基因与表达载体连接， 构建重组表达质粒。 然 后， 将其转化至枯草芽孢杆菌的宿主菌中， 构建了一种高效表达GalT的重组工程菌。 该工程 菌在液体培养基中培养后， 将菌液离心， 上清液即为含GalT的酶液。 其产量和生产效率明显 高于同种基因在野生菌种中的表达水平， 且操作简易， 成本低。 0017 3、 本发明的方法UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶产量高， 蛋白较纯净， 回 收纯化容易， 生产操作简单， 为GalT的工业化大规模生产提供了便利， 提高了产量， 省时省 力， 节约成本。 尤其是对该酶在食品工业中的应用提供了安全保障， 具有重大意义。 附图说明 0018 图1是实施例

15、1重组表达载体pHT43-GalT的构建示意图。 0019 图2是实施例1双酶切验证图。 0020 图3是构建的重组表达载体pHT43-GalT的SDS-PAGE电泳图； M:Marker； 1:粗酶液。 0021 图4是构建的重组表达载体pHT43-GalT纯化后的SDS-PAGE电泳图； M:Marker； 1:酶 液。 具体实施方式 0022 实施例1 说明书 2/6 页 4 CN 109295087 A 4 0023 (一)重组表达载体pHT43-GalT的构建 0024 UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GalT)基因(序列如SEQ ID NO:1所示)来 源于Bifido

16、bacterium longum JCM 1217， 经PCR扩增、 纯化后与克隆载体pMD19连接， 构建 重组质粒pMD19-GalT。 0025 将重组质粒pMD19-GalT和表达载体pHT43， 分别以XbaI和KpnI为酶切位点进行双 酶切， 并于16连接过夜， 获得重组表达载体pHT43-GalT。 0026 将重组表达载体pHT43-GalT转化枯草芽孢杆菌WB800N， 涂布含有氯霉素(5ug/mL) 抗性的LB平板， 37培养过夜， 挑取转化子， 提取重组质粒并双酶切验证。 如图2所示， 酶切 后有两条片段， 大小分别为8000bp左右(表达载体pHT43)和2637bp(

17、UDP-葡萄糖-己糖-1-磷 酸尿苷酰转移酶)， 表示连接成功。 0027 (二)重组工程菌 0028 将构建的重组表达载体pHT43-GalT采用电击转化的方法， 取枯草芽孢杆菌WB800N 感受态细胞与重组表达载体pHT43-GalT质粒混合， 加入电击杯中冰浴(1-10min)后进行电 击， 电击条件： 22KV/cm， 获得含有重组表达载体pHT43-GalT的重组工程菌。 0029 取含有重组表达载体pHT43-GalT的重组工程菌， 加入1ml电击恢复液， 37100rpm 孵育3h， 涂布于氯霉素固体基础培养基LB平板上， 12-24h可见阳性菌落。 0030 (三)GalT的制

18、备与条件优化 0031 方法： 将含有重组表达载体pHT43-GalT的重组工程菌以1的接种量接种于含有 氯霉素的LB液体培养基中， 于180rpm培养至初始菌密度OD6000.8时， 加入IPTG至终浓度 为0.1-1.5mM， 在20-40、 120rpm件下诱导培养9-36小时， 菌液离心， 上清液即为含GalT 的酶液。 如表1和表2进行正交优化试验。 0032 表1 0033 水平A(诱导时间h)B(诱导温度)C(IPTG浓度mM) 19300.5 218351 327401.5 0034 表2 说明书 3/6 页 5 CN 109295087 A 5 0035 0036 根据表1、

19、 表2的结果， 因素主次顺序为A、 B、 C， 最佳工艺方案是A2B2C2。 进一步对 A2B2C2进行验证的结果表明， GalT的活性达到435U/mL。 由此可见， 最佳的工艺条件为加入 IPTG至终浓度为1mM， 诱导温度为35、 诱导培养时间为18小时。 0037 (四)对比例 0038 方法同(一)-(三)， 不同点在于， 将步骤(二)中的宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N变更 为大肠杆菌， 步骤(三)， 在最佳工艺条件(OD6000.8， IPTG至终浓度为1mM， 诱导温度为35 、 诱导培养18小时)下发酵产酶。 结果如表3。 0039 表3 0040 总蛋白大肠枯草 GalT98

20、mg199mg 0041 由表3可见， 采用大肠杆菌为宿主菌， GalT的产量只有98mg， 而采用枯草芽孢杆菌， GalT的产量高达199mg。 可见采用本发明的方法可以高表达UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷 酰转移酶。 0042 实施例2 0043 (一)重组表达载体pHT43-GalT的构建 0044 将实施例1制备的重组质粒pMD19-GalT和表达载体pHT43， 分别以XbaI和KpnI为酶 切位点进行双酶切， 并于16连接过夜， 获得重组表达载体pHT43-GalT。 0045 将重组表达载体pHT43-GalT转化枯草芽孢杆菌WB800， 涂布含有氯霉素(5ug/mL) 抗性

21、的LB平板， 37培养过夜， 挑取转化子， 提取重组质粒并双酶切验证。 如图2所示， 酶切 后有两条片段， 大小分别为8000bp左右(表达载体pHT43)和2637bp(UDP-葡萄糖-己糖-1-磷 酸尿苷酰转移酶)， 表示连接成功。 0046 (二)重组工程菌 0047 将构建的重组表达载体pHT43-GalT采用电击转化的方法， 取60ul枯草芽孢杆菌 说明书 4/6 页 6 CN 109295087 A 6 WB800电转化感受态细胞与1ul(50ng/ul)重组表达载体pHT43-GalT质粒混合， 加入电击杯 中冰浴5min后进行电击， 电击条件： 22KV/cm， 获得含有重组表

22、达载体pHT43-GalT的重组工 程菌。 0048 取含有重组表达载体pHT43-GalT的重组工程菌， 加入1ml电击恢复液， 37100rpm 孵育3h， 涂布于氯霉素固体基础培养基LB平板上， 12-24h可见阳性菌落。 0049 (三)GalT的制备 0050 方法： 将含有重组表达载体pHT43-GalT的重组工程菌以5的接种量接种于含有 氯霉素的LB液体培养基中， 于180rpm培养至初始菌密度OD6000.8时， 加入IPTG至终浓度 为1mM， 在35、 120rpm条件下诱导培养18小时， 菌液离心， 上清液即为含GalT的酶液， 酶活 性为430U/mL。 0051 取酶

23、液进行PCR验证。 酶液的SDS-PAGE电泳图如图3所示， 经纯化后结果如图4所 示， 均出现47kDa的GalT目的条带。 0052 实施例3 0053 (一)重组表达载体pMA5-GalT的构建 0054 将实施例1制备重组质粒pMD19-GalT和穿梭载体pMA5， 分别以XbaI和KpnI为酶切 位点进行双酶切， 并于16连接过夜， 获得重组表达载体pMA5-GalT。 0055 将重组表达载体pMA5-GalT转化枯草芽孢杆菌168， 涂布含有氨苄青霉素(100ug/ mL)抗性的LB平板， 37培养过夜， 挑取转化子， 提取重组质粒并双酶切验证， 经验证构建成 功。 0056 (

24、二)重组工程菌 0057 将构建的重组表达载体pMA5-GalT采用电击转化的方法， 枯草芽孢杆菌168电转化 感受态细胞与重组表达载体pMA5-GalT质粒混合， 加入电击杯中冰浴5min后进行电击， 电击 条件： 22KV/cm， 获得含有重组表达载体pMA5-GalT的重组工程菌。 0058 取含有重组表达载体pMA5-GalT的重组工程菌， 加入1ml电击恢复液， 37100rpm 孵育3h， 涂布于氨苄青霉素固体基础培养基LB平板上， 12-24h可见阳性菌落。 0059 (三)GalT的制备 0060 方法： 将含有重组表达载体pHT43-GalT的重组工程菌以10的接种量接种于含

25、有 氨苄青霉素的LB液体培养基中， 于180rpm培养至初始菌密度OD6000.8时， 加入IPTG至终 浓度为1mM， 在35、 120rpm条件下诱导培养18小时， 菌液离心， 上清液即为含GalT的酶液， 酶活性为431U/mL。 0061 实施例4 0062 (一)重组表达载体pHT43-GalT的构建 0063 将实施例1制备重组质粒pMD19-GalT和表达载体pHT43， 分别以XbaI和KpnI为酶切 位点进行双酶切， 并于16连接过夜， 获得重组表达载体pHT43-GalT。 0064 将重组表达载体pHT43-GalT转化枯草芽孢杆菌WB600， 涂布含有氯霉素(5ug/m

26、L) 抗性的LB平板， 37培养过夜， 挑取转化子， 提取重组质粒并双酶切验证， 经验证连接成功。 0065 (二)重组工程菌 0066 将构建的重组表达载体pHT43-GalT采用电击转化的方法， 取60ul枯草芽孢杆菌 WB600电转化感受态细胞与1ul(50ng/ul)重组表达载体pHT43-GalT质粒混合， 加入电击杯 说明书 5/6 页 7 CN 109295087 A 7 中冰浴5min后进行电击， 电击条件： 22KV/cm， 获得含有重组表达载体pHT43-GalT的重组工 程菌。 0067 取含有重组表达载体pHT43-GalT的重组工程菌， 加入1ml电击恢复液， 371

27、00rpm 孵育3h， 涂布于氯霉素固体基础培养基LB平板上， 12-24h可见阳性菌落。 0068 (三)GalT的制备 0069 方法： 将含有重组表达载体pHT43-GalT的重组工程菌以10的接种量接种于含有 氯霉素的LB液体培养基中， 于180rpm培养至初始菌密度OD6000.8时， 加入IPTG至终浓度 为1mM， 在35、 120rpm条件下诱导培养18小时， 菌液离心， 上清液即为含GalT的酶液， 酶活 性为430U/mL。 0070 实施例5 0071 (一)重组表达载体pWB980-GalT的构建 0072 将实施例1制备重组质粒pMD19-GalT和穿梭载体pWB98

28、0， 分别以XbaI和KpnI为酶 切位点进行双酶切， 并于16连接过夜， 获得重组表达载体pWB980-GalT。 0073 将重组表达载体pWB980-GalT转化枯草芽孢杆菌WB600， 涂布含有卡那霉素(50ug/ mL)抗性的LB平板， 37培养过夜， 挑取转化子， 提取重组质粒并双酶切验证， 经验证连接成 功。 0074 (二)重组工程菌 0075 将构建的重组表达载体pWB980-GalT采用电击转化的方法， 枯草芽孢杆菌WB600电 转化感受态细胞与重组表达载体pWB980-GalT质粒混合， 加入电击杯中冰浴5min后进行电 击， 电击条件： 22KV/cm,获得含有重组表达

29、载体pWB980-GalT的重组工程菌。 0076 取含有重组表达载体pWB980-GalT的重组工程菌， 加入1ml电击恢复液， 37 100rpm孵育3h， 涂布于卡那霉素固体基础培养基LB平板上， 12-24h可见阳性菌落。 0077 (三)GalT的制备 0078 方法： 将含有重组表达载体pWB980-GalT的重组工程菌以3的接种量接种于含有 卡那霉素的LB液体培养基中， 于180rpm培养至初始菌密度OD6000.8时， 在35、 120rpm条 件下诱导培养18小时， 菌液离心， 上清液即为含GalT的酶液， 酶活性为433U/mL。 说明书 6/6 页 8 CN 109295

30、087 A 8 沈阳农业大学 一种高效表达制备UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的方法 1 PatentIn Version 2.1 1 2637 DNA UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因 （UDP-glucose-hexose 1- phosphat uridylyltransferase, GalT） AB303573 1 1 caccagagcg agaccattga ggaaagtgag caaacccatg gctgatttcg ccaactacac 61 ccccggggag tatgcgaagg agcacatccg catcacgccg acgacgctt

31、g ccgacggccg 121 tgacttcttc tacctggacg acgaccccga gttcgtctcc ggtgccaaga cccgcgagct 181 caaggacccg cgcccgctgg actaccgttt cgccccgcac ctggacgccg acggcaacga 241 agtgccgtac gccgccccgc agatgcgccg cgacccgctg accggcgact ggatcccgat 301 ggccaccgcc cgtatgaacc gcccgatcac cgccggcccc ggcgccaccg ccaagggcaa 361 ccc

32、gctggcc gcccgcaagc ccggtgaccc gtaccaggac ggcgaagtgc cggacaccga 421 ctacaacgtc gtcgtgttcg agaaccgctt cccctccatg gtgcgcgtgc ccggcgtctc 481 cgaggacgtg acctacgttg acggcaaccc gctgtgggag aagaagctcg ccgccggccg 541 ctgcgaggtc atctgcttcg acccgaacga ggacggcctg ccggccgatc tgccggtctc 601 ccgcctgcgc accgtggttg a

33、ggcttgggc cttccgtacc gccgaaatct ccaagatgga 661 aggcatcgag cagatcttcc cgttcgagaa ccacggccag gaaatcggcg tctccctcgc 721 tcacccgcac ggccaggtct actgctaccc gttcatcgcc ccgaagatgg agaaggaact 781 ccagcacacc gaggcctacc acgagaagac cggcggcaac ctgcttaagg acatcatgaa 841 cgccgagctc gaagccggcg aacgcatcgt gatgcgcaac

34、 cacagctggg tcgcctacgt 901 gccggccgcc gcccgttggc ccctcgaggt ccacgtggct ccggtgcgcg acgtgctcac 961 cctcgaccag ctcaacgacg aagaacgctg ggacctcgcc tccatgtact cgcacctcct 1021 gaagcgcggc aacgccttct tcgacaaggg cgacggcaag ggcatggacc tgccatacat 1081 cgccgcctgg caccaggccc cgatccacga cgcccgccgc gagaactacc gcctga

35、acct 1141 gcagttcttc tccttccgcc gcgccgccaa caagatcaag tacctcgccg gctccgaatc 1201 cggcatggcc gcctggatct ccgacaccac gccggaactc atcgccaagc gcttccacga 1261 gctcggctcc atcgacatcg ccgactgata gaaagaaaac atcaatgact gctgttgaat 1321 tcattgagcc gctgacccat gaggaaggcg tctcgcaagc taccaagctg ttcgtcgaca 1381 cctacg

36、gcgc tgcgcccgag ggcgtgtggg ctgctccggg ccgtgtgaac ctgatcggtg 1441 agcacaccga ttacaacgcc ggcctgtgcc tgccgatcgc tctgccgcac cgcaccttca 1501 tcgctctgaa gccgcgcgaa gacaccaagg ttcgcgtcgt ctccgacgtg gctcccgaca 1561 aggttgccga agctgatctc gatggcctca aggcccgtgg cgtggacggc tggtccgcct 1621 acccgaccgg cgtggcctgg

37、gcgctgcgtg aagccggctt cgacaaggtc aagggctttg 序列表 1/2 页 9 CN 109295087 A 9 1681 acgccgcttt cgtctcctgc gtgccgctgg gctctggcct gagctcctcc gccgccatga 1741 cctgctccac cgctctggct ctggacgacg tgtacggcct tggttacggc gattccgacg 1801 ccggccgcgt gaccctcatc aacgctgcca tcaagtccga gaacgagatg gccggcgctt 1861 ccaccggtg

38、g tcttgaccag agcgcctcca tgcgttgcac cgaaggccac gcgctgctgc 1921 tcgactgccg cccggagctc accccgctgg agaacgtctc ccagcaggag ttcgatctcg 1981 acaagtacaa cctcgaattg cttgtggtcg atacccaggc tccgcaccag ctcaacgatg 2041 gtcagtacgc tcagcgccgc gccacctgcg agcaggccgc gaagatcctc ggcgtggcca 2101 acctgcgcgt caccgccgac ggc

39、atcgcca aggccgacga cccgttccag gcgctcaagg 2161 agacgctgga cgcgctgccg gacgagacga tgaagaagcg cgtgcgccat gtggtcaccg 2221 agatcgagcg cgtgcgctcc ttcgtgcgcg ccttcgccag cggcgacatc gaggccgcgg 2281 gccgcctgtt caacgcctcc catgattcgc tggccgcgga ctacgaggtc actgtgcccg 2341 agctcgacgt ggccgtggac gtggcccgca agaacggt

40、gc ctacggtgcg cgtatgaccg 2401 gcggcggctt cggtggctcc atcatcgcgc tggtggacaa gggtcgttct caggaagtcg 2461 ctcagaagat cgccgacgaa ttcgaaaagc aaggcttcca cgcaccgcgc gcgcttgccg 2521 cgtacgcggc gaaatccgct tcacgcgagg catgataata aatcacaatg ctaaatggcg 2581 ggtgtcttcc ctatacttgg gtagtcaccc gctttttgta tacgaccagg gagagcc 序列表 2/2 页 10 CN 109295087 A 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 109295087 A 11 图3 图4 说明书附图 2/2 页 12 CN 109295087 A 12