一种复合陶瓷支架及其制备方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711088223.8 (22)申请日 2017.10.31 (71)申请人 温州医科大学附属第二医院、 温州 医科大学附属育英儿童医院 地址 327000 浙江省温州市鹿城区学院西 路109号 (72)发明人 沈利燕 唐千 徐华梓 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人 胡永宏 (51)Int.Cl. A61L 27/10(2006.01) A61L 27/34(2006.01) A61L 27/50(2006.01) A61L 27/

2、54(2006.01) A61L 27/56(2006.01) (54)发明名称 一种复合陶瓷支架及其制备方法 (57)摘要 本发明属于生物医用材料领域， 特别涉及复 合陶瓷支架及其制备方法， 具体指多层膜修饰的 多孔双相陶瓷支架的制备， 以及其作为骨缺损修 复材料的应用。 本发明提供的复合陶瓷支架的制 备方法包括以下步骤： 将多孔陶瓷支架依次浸泡 于A溶液、 C洗液、 B溶液、 D洗液中， 得到一个双层 的多层膜， 重复以上步骤至少一次得到多个双层 的多层膜， 将多个双层的多层膜浸泡入交联剂的 水溶液中进行交联30min至24小时， 在洗液中充 分洗净得到交联后的复合陶瓷支架。 本发明提供

3、的通过复合陶瓷支架多层膜的富集和铆定作用， 使药物原位作用于创口， 促进干细胞的成骨分 化， 对于骨质疏松患者的骨再生有极大的促进作 用。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 107890585 A 2018.04.10 CN 107890585 A 1.一种复合陶瓷支架的制备方法， 其特征在于， 包括步骤， 将多孔陶瓷支架依次浸泡于 A溶液、 C洗液、 B溶液、 D洗液中， 得到一个双层的多层膜， 重复以上步骤至少一次得到多个双 层的多层膜， 将多个双层的多层膜浸泡入交联剂的水溶液中进行交联30min至24小时， 在洗 液中充分洗净得到交联后的复合陶瓷支架； 所述A溶液为带正电的聚电

4、解质溶液， 浓度为0.1-10mg/mL， pH值为2.5-9.5； 所述B溶液 为带负电的聚电解质溶液， 浓度为0.1-10mg/mL， pH值为2.5-5.0。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述多孔陶瓷支架为具有联通孔的多 孔支架， 支架材料包括 -TCP、 羟基磷灰石、 生物活性玻璃中的一种或多种。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述A溶液为壳聚糖、 改性后带正电的 透明质酸、 聚赖氨酸中的一种或多种的水溶液。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述C洗液和D洗液均为去离子水。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所

5、述B溶液为透明质酸、 海藻酸、 肝素、 硫酸软骨素及其可溶性盐中的一种或多种的水溶液。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述交联剂为碳化二亚胺类交联剂、 京尼平、 戊二醛、 琥珀酰亚胺中的一种或多种。 7.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 还包括将所述交联后的复合陶瓷支架 浸泡于药物溶液中以装载促进骨修复的药物的步骤。 8.根据权利要求7所述的制备方法， 其特征在于， 所述药物溶液为骨化三醇、 双膦酸盐、 雷尼酸锶、 地塞米松中的一种或多种的溶液。 9.根据权利要求8所述的制备方法， 其特征在于， 所述药物溶液的溶剂为乙醇。 10.用权利要求1-9中任何一种制备方

6、法制备的复合陶瓷支架。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107890585 A 2 一种复合陶瓷支架及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物医用材料领域， 特别涉及复合陶瓷支架及其制备方法， 具体指多 层膜修饰的多孔双相陶瓷支架的制备， 以及其作为骨缺损修复材料的应用。 背景技术 0002 由创伤、 骨髓炎、 骨肿瘤切除等引起的骨缺损， 往往治疗过程漫长， 疗效不确定， 对 患者的生理上和精神上都造成了巨大的痛苦。 现临床上在骨缺损的治疗上， 主要采取自体 髂骨移植以及Ilizarov骨延长术。 但是面对大面积骨缺损， 自体骨量无法达到需求， 骨延长 法则病人需忍受长期的痛苦

7、及因外固定支架感染的风险， 因此往往需要引入人工骨替代材 料。 在这之中， 双相陶瓷颗粒以及多孔的陶瓷支架、 螺钉等， 已经FDA批准应用于骨科手术 中。 然而单纯的陶瓷、 螺钉等材料的植入因缺乏有效的骨诱导作用， 成骨效果不甚理想， 尤 其是对于患有骨质疏松症等基础疾病的患者， 效果更差。 0003 层层自组装技术(layer-by-layer self-assembly， LBL)是一种能够将多种功能 分子有机结合于一体的简便成膜技术。 因其能在不改变材料本身的力学属性的情况下提高 植入体生物活性并赋予材料新的特性， 在骨科植入领域有了越来越广泛的应用。 该技术一 方面可以通过选择具有较高

8、生物亲和力的聚电解质构建涂层以促进细胞的黏附与增值， 另 一方面多层膜结构能够更好地促进药物/生长因子的富集， 是调节植入材料表面物理、 化 学、 生物因素的良好平台。 PICART等(Small， 2009， 5(5)： 598-608)利用层层组装技术将聚赖 氨酸(Poly-1-lysine， PLL)和透明质酸(Hyaluronic acid， HA)多层面包覆于多孔陶瓷支架 表面， 同时载入骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2， BMP-2)构建陶瓷基复 合支架， 皮下异位成骨效果良好。 然而， 研究显示该复合支架的成骨活性主要来自BMP-2而

9、非多层膜， 陶瓷支架上多层膜的包覆在体外细胞实验和体内异位成骨实验中均未见任何优 势。 而BMP-2蛋白的使用不仅异常昂贵， 而且存在较大隐患， 有引起炎症的风险。 发明内容 0004 为了解决上述技术问题， 为了增强多孔陶瓷支架的生物活性， 同时避免使用BMP等 生长因子而导致的高费用和炎症、 致癌等风险， 本发明欲构建一种简单、 安全、 有效的基于 多孔陶瓷材料的复合支架， 用于大面积骨缺损的骨修复和骨再生的治疗。 0005 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 0006 一种复合陶瓷支架的制备方法， 包括步骤， 将多孔陶瓷支架依次浸泡于A溶液、 C洗 液、 B溶液、 D洗液中， 得到

10、一个双层的多层膜， 重复以上步骤至少一次得到多个双层的多层 膜， 将多个双层的多层膜浸泡入交联剂的水溶液中进行交联30min至24小时， 在洗液中充分 洗净得到交联后的复合陶瓷支架； 0007 所述A溶液为带正电的聚电解质溶液， 浓度为0.1-10mg/mL， pH值为2.5-9.5； 所述B 溶液为带负电的聚电解质溶液， 浓度为0.1-10mg/mL， pH值为2.5-5.0。 0008 其中， 所述多孔陶瓷支架为具有联通孔的多孔支架， 支架材料包括 -TCP、 羟基磷 说 明 书 1/5 页 3 CN 107890585 A 3 灰石、 生物活性玻璃中的一种或多种。 0009 其中， 所述

11、A溶液为壳聚糖、 改性后带正电的透明质酸、 聚赖氨酸中的一种或多种 的水溶液。 0010 其中， 所述C洗液和D洗液均为去离子水。 洗液即能将表面吸附不牢固的聚电解质 洗去的溶液， 可以是水、 缓冲液、 盐溶液。 0011 其中， 所述B溶液为透明质酸、 海藻酸、 肝素、 硫酸软骨素及其可溶性盐中的一种或 多种的水溶液。 0012 其中， 所述交联剂为碳化二亚胺类交联剂、 京尼平、 戊二醛、 琥珀酰亚胺中的一种 或多种。 0013 其中， 还包括将所述交联后的复合陶瓷支架进一步浸泡于药物溶液中以装载促进 骨修复的药物， 以增强疗效。 0014 其中， 所述药物溶液为骨化三醇、 双膦酸盐、 雷尼

12、酸锶、 地塞米松中的一种或多种 的溶液。 0015 其中， 所述药物溶液的溶剂为乙醇， 但是不限于乙醇， 能溶解的溶剂都是可以的。 0016 用上述制备方法制备的复合陶瓷支架。 0017 天然多糖如透明质酸与壳聚糖和天然多肽如聚赖氨酸等均为广泛存在的天然大 分子， 具有生物可降解性， 生物相容性良好， 且具有促进间充质干细胞增殖、 黏附和分化的 作用。 0018 骨化三醇为维生素D在体内的活化形式， 是治疗骨质疏松症的口服药物， 其口服后 能够作用于小肠内皮细胞促进小肠对钙离子的吸收， 维持全身骨生成与骨吸收的平衡。 骨 化三醇在病灶部位的直接应用有望能够作用于间充质干细胞， 诱导其成骨分化，

13、 从而加速 缺损部位的骨再生。 0019 双膦酸盐是用于各类骨疾患及钙代谢性疾病的一类药物。 通常药物通过口服吸 收， 能特异的与骨质中的羟膦灰石结合， 抑制破骨细胞活性， 从而抑制骨质吸收。 同样， 通过 在病灶部位的原位应用， 可能会直接作用于缺损部位的破骨细胞及其它骨细胞， 进而促进 成骨。 雷尼酸锶、 地塞米松等传统的口服药物的原位应用亦有望在局部促进骨修复， 同时避 免全身用药带来的毒副作用。 0020 本发明所得的复合陶瓷支架在保持了原有陶瓷支架成骨活性的基础上， 引入多 糖/多肽生物大分子对间充质干细胞黏附、 增殖、 分化的诱导作用， 具有很好地诱导缺损处 的骨再生， 适合大块骨

14、缺损的修复； 通过引入骨质疏松及钙代谢疾病治疗用的传统药物， 能 够进一步加速骨再生， 即便在患有骨质疏松症等全身骨骼系统疾病的情况下也有较好的疗 效。 0021 本发明提供复合陶瓷支架的优点和特点如下： 0022 1.本发明通过对现有的已临床推广的材料进行简单的修饰以及药物的搭载， 达到 加成的治疗效果， 构建涂层的透明质酸与壳聚糖等均为可广泛获得且经济实用的生物材 料， 具有经济优势。 0023 2.本发明通过调控层层自组装过程中pH的变化， 以形成多孔结构的多层膜， 其在 不影响材料本身离子释放的前提下， 多孔粗糙的膜表面更有利于细胞的黏附与增殖。 0024 3.骨化三醇等药物为FDA批

15、准的用于临床骨质疏松患者治疗的药物， 应用上安全 说 明 书 2/5 页 4 CN 107890585 A 4 可靠。 本发明通过多层膜的富集和铆定作用， 使药物原位作用于创口， 促进干细胞的成骨分 化， 对于骨质疏松患者的骨再生有极大的优势。 附图说明 0025 图1为本发明的复合陶瓷支架的制备流程示意图， 图中a为陶瓷支架。 0026 图2为实施例1-8和对比例1-2的钙离子体外释放曲线。 其中1-8代表实施例1-8， 9- 10代表对比例1-2。 0027 图3a为实施例1的陶瓷表面形貌图， 标尺为5微米。 0028 图3b为对比例1的陶瓷表面形貌图， 标尺为5微米。 0029 图4a为

16、实施例1-8和对比例1-2中正常间充质干细胞在复合陶瓷支架上的生长行 为。 其中1-8代表实施例1-8， 9-10代表对比例1-2。 0030 图4b为实施例1-8和对比例1-2中骨质疏松间充质干细胞在复合陶瓷支架上的生 长行为。 其中1-8代表实施例1-8， 9-10代表对比例1-2。 具体实施方式 0031 下面结合实施例， 对本发明作进一步说明： 0032 本发明的具体实施如下。 0033 结合附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。 0034 由图1所示的方法制备本发明所述的复合支架， 将陶瓷支架基材先浸泡到A溶液中 静置10min吸附一层A分子， 在洗液中洗三下洗去吸附不牢固的A物质

17、， 再浸泡到B溶液中浸 泡10min吸附一层B分子， 在洗液中洗三下洗去吸附不牢固的B物质， 得到一个双层的多层 膜， 重复以上步骤， 以制备所需多层膜。 0035 实施例中采用的支架基材均为直径8mm， 厚度2mm的圆块， 多孔结构为联通空， 具体 参数为60羟基磷灰石， 40 -磷酸三钙， 支架孔隙率75-85， 平均孔径为200um。 其它常 用的多孔陶瓷支架也能达到类似的效果。 0036 实施例中所用的A、 B溶液均由去离子水配制， 通过滴加1M的氢氧化钠溶液或者1N 的盐酸溶液调节至所需pH， 洗液为去离子水。 实施例中所用的所述药物溶液的溶剂为乙醇， 浸泡药物溶液后在乙醇中清洗，

18、并在真空干燥箱中干燥， 除去残余乙醇。 0037 实施例1.在陶瓷支架表面交替沉积壳聚糖溶液(A溶液， 浓度1mg/mL， pH4.0)和透 明质酸钠溶液(B溶液， 浓度3mg/mL， pH3.0)， 得到10双层的多层膜， 将多层膜包覆的支架浸 泡到碳化二亚胺-琥珀酰亚胺溶液中交联24小时， 充分洗净后干燥， 灭菌后备用。 0038 实施例2.在陶瓷支架表面交替沉积聚赖氨酸溶液(A溶液， 浓度0.1mg/mL， pH9.5) 和肝素钠溶液(B溶液， 浓度5mg/mL， pH5.0)， 得到20双层的多层膜， 将多层膜包覆的支架浸 泡到京尼平溶液中交联12小时， 充分洗净后干燥， 灭菌后备用。

19、 0039 实施例3.将陶瓷支架表面交替沉积氨基化透明质酸溶液(A溶液， 浓度5mg/mL， pH8.0)和硫酸软骨素溶液(B溶液， 浓度0.1mg/mL， pH2.5)， 得到5双层的多层膜， 将多层膜包 覆的支架浸泡到戊二醛溶液中交联0.5小时， 充分洗净后干燥， 灭菌后备用。 0040 实施例4.在陶瓷支架表面交替沉积壳聚糖溶液(A溶液， 浓度10mg/mL， pH2.5)和海 藻酸钾溶液(B溶液， 浓度10mg/mL， pH3.0)， 得到50双层的多层膜， 将多层膜包覆的支架浸泡 说 明 书 3/5 页 5 CN 107890585 A 5 到碳化二亚胺溶液中交联18小时， 充分洗净

20、后干燥， 灭菌后备用。 0041 实施例5.在陶瓷支架表面交替沉积壳聚糖溶液(A溶液， 浓度1mg/mL， pH4.0)和透 明质酸钠溶液(B溶液， 浓度3mg/mL， pH3.0)， 得到10双层的多层膜， 将多层膜包覆的支架浸 泡到碳化二亚胺-琥珀酰亚胺溶液中交联24小时。 充分洗净干燥后， 浸泡到药物溶液(地塞 米松的醇溶液)中， 清洗后干燥， 灭菌后备用。 0042 实施例6.在陶瓷支架表面交替沉积聚赖氨酸溶液(A溶液， 浓度0.1mg/mL， pH9.5) 和肝素钠溶液(B溶液， 浓度5mg/mL， pH5.0)， 得到20双层的多层膜， 将多层膜包覆的支架浸 泡到京尼平溶液中交联1

21、2小时。 充分洗净干燥后， 浸泡到药物溶液(雷尼酸锶的醇溶液)中， 清洗后干燥， 灭菌后备用。 0043 实施例7.将陶瓷支架表面交替沉积氨基化透明质酸溶液(A溶液， 浓度5mg/mL， pH8.0)和硫酸软骨素溶液(B溶液， 浓度0.1mg/mL， pH2.5)， 得到5双层的多层膜， 将多层膜包 覆的支架浸泡到戊二醛溶液中交联0.5小时。 充分洗净干燥后， 浸泡到药物溶液(阿仑膦酸 钠的醇溶液)中， 清洗后干燥， 灭菌后备用。 0044 实施例8.在陶瓷支架表面交替沉积壳聚糖溶液(A溶液， 浓度10mg/mL， pH2.5)和海 藻酸钾溶液(B溶液， 浓度10mg/mL， pH3.0)，

22、得到50双层的多层膜， 将多层膜包覆的支架浸泡 到碳化二亚胺溶液中交联18小时。 充分洗净干燥后， 浸泡到药物溶液(骨化三醇的醇溶液) 中， 清洗后干燥， 灭菌后备用。 0045 对比例1.参照对比文献， 在陶瓷支架表面交替沉积聚赖氨酸(A溶液， 浓度0.5mg/ mL， pH7.4)和透明质酸钠溶液(B溶液， 浓度1mg/mL， pH7.4)， 得到24双层的多层膜， 将多层膜 包覆的支架浸泡到碳化二亚胺-琥珀酰亚胺溶液中交联18小时， 充分洗净后干燥， 灭菌后备 用。 0046 对比例2.陶瓷支架， 不做表面处理， 灭菌后备用。 0047 以上实施例1-8为实验组， 对比例1-2为对照组，

23、 进行以下测试： 0048 1.钙离子体外释放行为检测 0049 将所得复合陶瓷支架放入100mL磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中， 密封后置于37摇 床中， 分别于1天、 3天、 7天、 12天、 20天、 35天时取0.5mL释放后的PBS液体， 通过原子吸收光 谱检测钙离子浓度， 所得不同实施例的钙离子释放曲线如图2所示。 0050 由图2可知， 实施例1-8的钙离子释放行为与对比例2(未修饰的陶瓷支架)类似， 而 对比例1钙离子的释放明显减缓。 本发明通过降低层层组装过程中聚阴离子(B溶液)的pH 值， 获得多孔的多层膜结构(图3a)， 使得所得复合陶瓷支架中的钙离子能快速释放， 这将大

24、 大促进材料表面及周围间充质干细胞的成骨活性。 0051 2.间充质干细胞黏附增殖测试 0052 首先进行骨质疏松大鼠造模： 选取健康的200-220g的SD雌性大鼠进行双侧卵巢摘 除术， 饲养三个月后建立绝经后骨质疏松模型(简称OVX).该模型很好的模拟了由于女性绝 经后由于雌激素大量下降导致的骨质疏松病症， 是FDA批准的用于研究骨质疏松治疗相关 的药物和医疗器械的标准动物模型。 0053 取造模成功骨质疏松SD大鼠与相同周龄的正常SD大鼠， 经过量戊巴比妥钠麻醉处 死后， 无菌环境下取双侧股骨干， 行全骨髓贴壁法提取骨髓间充质干细胞(MSC)。 得到正常 大鼠间充质干细胞BMSC和骨质疏

25、松大鼠间充质干细胞OVX-BMSC。 说 明 书 4/5 页 6 CN 107890585 A 6 0054 将BMSC和OVX-BMSC分别接种在所得的复合陶瓷支架上， 在接种3天、 7天或14天后 通过CCK-8试剂盒测定细胞的黏附增殖情况。 测试结果如图4所示。 0055 由图4a可知， 正常间充质干细胞在实验组的多层膜上更容易黏附， 增殖也更加迅 速， 这可以归功于这些多层膜的多孔结构， 这些多孔结构不仅有利于钙离子的正常释放， 还 对间充质干细胞的黏附和增殖有很强的促进和诱导作用。 而实施例9中的平整的多层膜， 其 上的细胞黏附和增殖反而不如未处理的陶瓷支架， 这点也与文献报道相符。

26、 0056 图4b给出了OVX-BMSC在不同复合陶瓷支架上的黏附增殖情况， 可见骨质疏松大鼠 中提取的间充质干细胞增值速度明显降低， 但多孔多层膜的存在同样可以有效促进其黏附 和增殖， 同时骨质疏松药物的引入进一步促进了OVX-BMSC的增殖。 0057 3.体内骨缺损再生实验检测 0058 每组取6只骨质疏松大鼠， 通过慢速牙科环形钻在大鼠颅骨表面钻取直径8mm的圆 形极量缺损(无法自我修复的缺损范围)， 并予所得支架材料填充。 随后逐层缝合关闭创口。 在骨修复中期(6周)和后期(12周)， 分别处死3只大鼠， 取出颅骨， 经micro-CT扫描并三维重 建， 计算成骨量。 结果如表2所示

27、。 0059 包覆了本发明多孔多层膜的陶瓷支架(实施例1-4)在骨质疏松大鼠中其中期和后 期成骨量均优于未修饰陶瓷支架(对比例2)， 新生骨量为后者的两倍； 进一步在复合陶瓷支 架中引入传统的口服骨质疏松药物(实施例5-8)， 新生骨量进一步增加， 这种增加大大超过 了之前细胞实验中药物加入对细胞增殖所带来的促进作用， 可见药物更多地对间骨质疏松 大鼠充质干细胞的成骨分化起作用。 0060 表1： 骨质疏松大鼠植入陶瓷复合支架后6周和12周的成骨量 0061 (以新生成骨体积(bone volume)占植入陶瓷支架总体积(totalvolume)比例来表 示) 0062 0063 以上所述为本发明的较佳实施例而已， 但本发明不应该局限于该实施例所公开的 内容。 所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改， 都落入本发明保护的范 围。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107890585 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 107890585 A 8 图3a 图3b 图4a 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 107890585 A 9 图4b 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 107890585 A 10