互叶白千层总黄酮的制备及其检测方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510255669.X (22)申请日 2015.05.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104840525 A (43)申请公布日 2015.08.19 (73)专利权人 广西壮族自治区中医药研究院 地址 530022 广西壮族自治区南宁市青秀 区东葛路20-1号 (72)发明人 刘布鸣 林霄 邱宏聪 柴玲 黄艳 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所(普通合伙) 11350 代理人 罗保康 (51)Int.Cl. A61K 36/61(2

2、006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 37/08(2006.01) A61P 39/06(2006.01) G01N 21/31(2006.01) A61K 127/00(2006.01) A61K 135/00(2006.01) (56)对比文件 CN 103159724 A,2013.06.19, 李燕婧等， .互叶白千层醇提物的药理作用 研究. 广西中医药 .2013,第36卷(第3期),第 77-79页. 毕荣璐等.澳洲茶树黄酮提取研究. 安徽农 业科学 .2014,第42卷(第7期),第2126-21228 页. 范

3、超君.白千层枝和叶总黄酮含量的测定. 海南师范大学学报 （自然科学版） .2012,第25 卷(第1期),第63-65页. 审查员 何华山 (54)发明名称 互叶白千层总黄酮的制备及其检测方法 (57)摘要 本发明公开了互叶白千层总黄酮提取物及 其制备方法， 是从水蒸气提取精油后的互叶白千 层枝叶中经乙醇加热回流提取、 减压回收乙醇并 浓缩至无醇味、 用大孔吸附树脂分离纯化、 干燥 而制得， 并且采用紫外-可见分光光度法测定互 叶白千层总黄酮含量， 方法准确、 稳定、 操作简 单， 能适应工业生产的需要， 可有效的控制互叶 白千层总黄酮提取物的质量。 本发明互叶白千层 总黄酮提取物总黄酮含量可

4、达50%以上， 毒性小， 具有抗炎、 抑菌、 镇痛、 抗过敏、 抗氧化等药理作 用， 制备方法合理、 稳定、 生产周期短， 适合工业 化生产， 对互叶白千层资源深度开发利用具有重 要意义， 具有良好的开发前景。 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 104840525 B 2018.05.18 CN 104840525 B 1.一种互叶白千层总黄酮的制备方法， 其特征在于： 所述的互叶白千层总黄酮的制备 方法步骤如下： （1） 乙醇加热回流提取： 取经水蒸气蒸馏法提取精油后的互叶白千层茎叶， 按质量每 800-1200 g互叶白千层茎叶加入815升浓度为5095%的乙醇 ； 加热回流提取

5、3次， 每 次13小时， 过滤， 合并滤液； 减压回收乙醇， 并浓缩至无醇味， 加水稀释至总黄酮浓度为 0.20.8 mg/mL 的互叶白千层提取液， 离心取上清液， 待用； （2） 大孔吸附树脂分离纯化： 选择大孔吸附树脂； 吸附： 上柱互叶白千层提取液中 总黄酮浓度为0.20.8 mg/mL， 上柱互叶白千层提取液体积为填充大孔吸附树脂体积的2 5 倍， 上柱流速为 0.53 BV/h； 洗脱： 洗脱剂为5080%乙醇， 洗脱剂用量为填充大孔 吸附树脂体积的 25 倍， 洗脱流速为25BV/h； 收集 25倍洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩 至干， 60真空干燥， 即得互叶白千层总黄酮提取物

6、； 所述的大孔吸附树脂为X-5或 AB-8大孔吸附树脂； 所述的互叶白千层总黄酮， 该总黄酮含量以芦丁计算不少于 50.0%； 所述的互叶白千层总黄酮的制备方法， 得到的互叶白千层总黄酮用以下步骤进行检 测： （1） 对照品储备液的制备： 精密称取芦丁对照品适量， 加甲醇制成每1 mL含0.20mg芦丁 的溶液， 即得芦丁对照品储备液 ； （2） 标准曲线的制备： 精密量吸取芦丁对照品储备液 0.5、 1、 2、 3、 4、 5 mL， 分别置于 10mL 容量瓶中， 分别加入质量分数为5%的NaNO2 溶液 0.5mL， 摇匀放置8 min后， 分别加入 质量分数为10%的Al(NO3)3

7、溶液0.5 mL， 摇匀放置8min， 再分别加入质量分数为4% 的NaOH 溶液 4.0mL， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀放置 l5min 后， 在4982nm 波长处测定溶液的吸 光度值 A， 同时进行空白对照； 以浓度 （ g/mL） 为横坐标， 吸光度 （A） 为纵坐标绘制标准曲 线； （3） 测定法： 取制备得到的互叶白千层总黄酮提取物约 20mg， 精密称定， 置100 mL量 瓶中， 加甲醇适量使溶解并稀释至刻度， 摇匀， 精密量取 2mL， 置 10mL 量瓶中， 加入质 量分数为10% 的Al(NO3)3溶液 0.5 mL， 摇匀放置8 min， 再分别加入质量分数为4%的Na

8、OH 溶液 4.0 mL， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀放置l5min 后， 在4982nm 波长处测定溶液的吸光 度值 A， 同时进行空白对照； 本品总黄酮含量以芦丁计算不少于 50.0%。 2.权利要求1所述的互叶白千层总黄酮， 其特征在于： 该总黄酮应用在制备抗炎、 镇痛、 抑菌、 抗过敏、 抗氧化的药物中。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104840525 B 2 互叶白千层总黄酮的制备及其检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种黄酮提取物的制备领域， 具体涉及一种植物互叶白千层总黄酮的 纯化制备及其检测方法。 背景技术 0002 天然植物提取物是以植物为原料， 根据提取目

9、的和需要， 利用物理和化学的提取 分离方法， 定向获取并浓集植物中的某一种或多种有效成分， 而不改变其有效成分结构而 形成的产品。 与传统中草药、 中成药相比， 中药提取物具有明确的有效成分， 有质控的定量 指标， 有害成分或杂质大部分均被去除， 在安全性、 有效性、 可控性上比传统植物药得到提 升。 此外， 中药提取物还融合了现代制药新技术， 属于新型中药产品， 具有广阔的国际市场 空间， 其产业化有良好的发展前景， 体现了中药产业的技术进步， 适应了中药现代化的要 求。 0003 互叶白千层为桃金娘科(Myrtaceae)白千层属(MelaleucaL .)互叶白千层 (Melaleuca

10、 alternifolia)， 是提取天然茶树油的主要原料， 得油率大约在12%。（ 【文献】 白千层挥发油化学成分分析 【作者】 刘布鸣， 彭维 【刊名】 分析测试学报, 1999. 18(6): 70- 72 【摘要】 互叶白千层枝叶、 根茎均含有挥发油， 其枝叶含油0.8-1.3%， 对植物白千层枝叶挥 发油化学成分进行了分析研究， 分离确认了其中的35个成分， 占挥发油色谱冲峰面积的 90以上。 ） 互叶白千层枝叶经水蒸馏提取精油后通常作为生产废料处理提油后的植物部 分被作为废弃物丢弃， 植物未能得到充分的开发利用， 严重地浪费了药材资源。 有研究表 明， 互叶白千层的枝叶中可分离得到

11、槲皮素、 山奈酚等多种黄酮类活性化合物 （ 【文献】 互叶 白千层的化学成分研究 【作者】 刘布鸣， 董晓敏， 黄艳， 林霄， 卢文杰， 牙启康 【刊名】 中草药, 2011(07): 1282-1284 【摘要】 采用硅胶柱色谱和重结晶方法进行分离纯化， 根据理化性质 和波谱数据鉴定了11个化合物， 分别为:n-tricontyl-4-cinnamate、 槲皮素、 山柰酚、 白桦 脂酸、 没食子酸、 没食子酸乙酯、 -谷甾醇、 原儿茶酸、 胆甾醇、 三十二醇、 吉达酸。 ） ， 且含量 颇高 （ 【文献】 高效液相色谱法同时测定互叶白千层中的槲皮素和山奈酚 【作者】 林霄， 董晓 敏， 陈

12、明生， 黄艳， 刘布鸣 【刊名】 林产化学与工业, 2012, (04): 113-116 【摘要】 用高效液 相色谱法同时测定广西5地互叶白千层中槲皮素和山奈酚含量， 测定了不同产地互叶白千 层中的槲皮素和山奈酚质量分数,其中邕宁南晓的槲皮素和山奈酚的质量分数最高,分别 为5.151和2.530 mg/g， 邕宁的槲皮素和山奈酚的质量分数为最低， 分别为2.386和1.658 mg/g。【文献】 白千层枝和叶总黄酮含量的测定 【作者】 范超君， 鲍长余， 陈湛娟， 毕和平 【刊 名】 海南师范大学学报： 自然科学版 25(1): 63-65 【摘要】 以芦丁为对照品， NaNO2-Al （N

13、O3） 3-NaOH为显色系统， 用紫外分光光度法， 在498nm波长测定白千层枝和叶中总黄酮的含量。 测定结果表明， 白千层枝和叶中总黄酮的质量分数分别为0.69和0.63。 ） 且其粗提物具 有明显的抗炎、 镇痛、 抗菌、 抗过敏、 抗氧化的药理作用。（ 【文献】 互叶白千层醇提物的药理 作用研究 【作者】 李燕婧, 钟正贤, 林霄, 刘布鸣 【刊名】 广西中医药, 2013(03): 77-79 【摘要】 互叶白千层醇提物能抑制巴豆油引起小鼠耳廓肿胀； 能提高小鼠热刺激疼痛的痛阈 说 明 书 1/8 页 3 CN 104840525 B 3 值;除枯草芽孢杆菌外， 互叶白千层醇提物对金黄

14、色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌、 白色念珠菌 等7种菌种均有抑菌作用； 能抑制小鼠被动皮肤通透性,具有抗皮肤过敏作用； 互叶白千层 醇提物的半数致死量(LD50)为51.749g/kg， 95%可信限为44.70059.911g/kg。 0004 结论： 互叶白千层醇提物具有抗炎、 镇痛、 抗菌、 抗过敏等药理作用， 且毒性小。 因 此研发一种互叶白千层总黄酮的制备及其质量控制方法， 对互叶白千层植物新的药用途径 开发与综合利用具有重大的实际应用意义。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种方法合理、 稳定、 简单易行， 适合工业化生产， 具有抗 炎、 抑菌、 镇痛、 抗过敏、 抗氧化等药理

15、作用的互叶白千层总黄酮的制备方法及质量控制方 法。 0006 本发明是这样实现的： 0007 本发明互叶白千层总黄酮的制备方法， 包括以下步骤： 0008 1. 乙醇加热回流提取 0009 取经水蒸气蒸馏法提取精油后的互叶白千层茎叶， 按质量每800-1200 g互叶 白千层茎叶加入815升浓度为5095%的乙醇； 0010 加热回流提取3次， 每次13小时， 过滤， 合并滤液； 0011 减压回收乙醇， 并浓缩至无醇味， 加水稀释至总黄酮浓度为0.20.8 mg/mL的 互叶白千层提取液， 离心取上清液， 待用。 0012 2. 大孔吸附树脂分离纯化 0013 选择弱极性的X-5或AB-8大

16、孔吸附树脂； 0014 吸附： 上柱互叶白千层提取液总黄酮浓度为0.20.8 mg/mL， 上柱互叶白千层 提取液体积为填充大孔吸附树脂体积的25倍， 上柱流速为0.53 BV/h；【注： BV/h 表示 单位时间 （h） 流经单位体积树脂平均液量】 ； 0015 洗脱： 洗脱剂为5080%乙醇， 洗脱剂用量为填充大孔吸附树脂体积的25倍， 洗脱流速为25 BV/h； 收集25倍洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩至干， 60真空干燥， 即得 互叶白千层总黄酮提取物。 0016 本发明互叶白千层总黄酮的检测方法， 包括以下步骤 ： 0017 1. 对照品储备液的制备 精密称取芦丁对照品适量， 加甲醇

17、制成每1 mL含0.20 mg的溶液， 即得芦丁对照品储备液； 0018 2. 标准曲线的制备 精密量吸取芦丁对照品储备液0.5、 1、 2、 3、 4、 5 mL， 分别置10 mL 量瓶中， 分别加入质量分数为5%的NaNO2溶液0.5 mL， 摇匀放置8 min后， 分别加入质量 分数为10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL， 摇匀放置8 min， 再分别加入质量分数为4%的NaOH溶液 4.0 mL， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀放置l5 min后， 在498 nm波长处测定溶液的吸光度值A， 同 时进行空白对照。 以浓度 （ g/mL） 为横坐标， 吸光度 （A） 为纵坐标绘制标准曲线

18、； 0019 3. 测定法： 取制备得到的互叶白千层总黄酮提取物约20 mg， 精密称定， 置100 mL 量瓶中， 加甲醇适量使溶解并稀释至刻度， 摇匀， 精密量取2 mL， 置10 mL量瓶中， 加入质量 分数为10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL， 摇匀放置8 min， 再分别加入质量分数为4%的NaOH溶液 4.0 mL， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀放置l5 min后， 在498 nm波长处测定溶液的吸光度值A， 说 明 书 2/8 页 4 CN 104840525 B 4 同时进行空白对照。 本品总黄酮含量以芦丁 （C27H30O16） 计算不少于50. 0%； 0020 4. 结

19、果： 采用本发明的制备和质量控制方法， 经验证试验， 制备的互叶白千层总 黄酮含量以芦丁计， 可达50% 以上。 0021 与现有技术相比， 本发明突出的实质性特点和显著的进步是： 0022 1、 本发明首次从互叶白千层枝叶中制备出含量50%以上的总黄酮提取物， 为药材 资源的充分利用及提高其应用价值提供科学的依据。 0023 2、 本发明设计合理， 制备方法稳定、 可行、 能耗低， 利用醇水溶剂提取， 经过一次大 孔吸附树脂柱分离纯化即可得到含量较高的互叶白千层总黄酮提取物， 方法简便易行。 0024 3、 本发明提取、 分离速度快， 生产周期短， 适合工业化生产， 有很好的应用前景。 00

20、25 4、 本发明采用紫外-可见分光光度法测定互叶白千层总黄酮含量， 方法简单、 准 确， 能适应工业生产的需要， 可有效的控制互叶白千层总黄酮提取物的质量。 0026 5、 通过对互叶白千层总黄酮进行研究， 建立了一种互叶白千层总黄酮的制备和质 量控制方法， 有利于互叶白千层相关产品的进一步开发利用， 将会产生潜在而不可估量的 社会效益与经济效益。 0027 6、 本发明的互叶白千层总黄酮应用于抗炎、 抑菌、 镇痛、 抗过敏、 抗氧化的药物中。 附图说明 0028 图 1是互叶白千层总黄酮的制备工艺流程图； 0029 图2是互叶白千层提取物加入到 DPPH溶液中的吸光度随反应时间的变化。 具

21、体实施方式 0030 实施例一： 0031 取互叶白千层枝叶 1000g， 加水3L， 加热70分钟， 提取挥发油， 收油后， 弃去容器中 的水溶液， 加入12L 75%乙醇， 加热回流提取3次， 每次2小时， 合并提取液， 过滤， 滤液减压回 收至无乙醇味， 加水溶解， 配成总黄酮浓度为0.5 mg/mL的互叶白千层提取液。 取已处理好 的X-5大孔吸附树脂80 g (相当于干树脂30 g， 柱体积200 mL)， 湿法装柱， 将600 mL互叶白 千层提取液以3 BV/h 的上柱流速进行吸附， 用3 BV 的水洗脱至洗脱液基本澄清， 水洗脱 液弃去， 用4BV 75%乙醇以2BV/h 的流

22、速洗脱， 收集洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩至干， 60 真空干燥， 得到互叶白千层总黄酮提取物， 测定， 计算， 总黄酮含量为63. 5%。 0032 实施例二： 0033 取互叶白千层枝叶 1200g， 加水4L， 加热70分钟， 提取挥发油， 收油后， 弃去容器中 的水溶液， 加入15L 50%乙醇， 加热回流提取3次， 每次3小时， 合并提取液， 过滤， 滤液减压回 收至无乙醇味， 加水溶解， 配成总黄酮浓度为0.8 mg/mL的互叶白千层提取液。 取已处理好 的X-5大孔吸附树脂60g (相当于干树脂20g， 柱体积150mL)， 湿法装柱， 将750mL互叶白千层 提取液以2BV/

23、h 的上柱流速进行吸附， 用4BV 的水洗脱至洗脱液基本澄清， 水洗脱液弃 去， 用5BV 50%乙醇以4BV/h 的流速洗脱， 收集洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩至干， 60真空 干燥， 得到互叶白千层总黄酮提取物， 测定， 计算， 总黄酮含量为58.9%。 0034 实施例三： 0035 取互叶白千层枝叶 800g， 加水2L， 加热70分钟， 提取挥发油， 收油后， 弃去容器中 说 明 书 3/8 页 5 CN 104840525 B 5 的水溶液， 加入8L 95%乙醇， 加热回流提取3次， 每次1小时， 合并提取液， 过滤， 滤液减压回 收至无乙醇味， 加水溶解， 配成总黄酮浓度为0

24、.2 mg/mL的互叶白千层提取液。 取已处理好 的AB-8大孔吸附树脂50g (相当于干树脂20g， 柱体积150mL)， 湿法装柱， 将450mL互叶白千 层提取液以0.5BV/h 的上柱流速进行吸附， 用4BV 的水洗脱至洗脱液基本澄清， 水洗脱液 弃去， 用3BV 80%乙醇以5BV/h 的流速洗脱， 收集洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩至干， 60真 空干燥， 得到互叶白千层总黄酮提取物， 测定， 计算， 总黄酮含量为61.2%。 0036 互叶白千层总黄酮的检测方法 0037 总黄酮的含量测定 0038 精密称取芦丁对照品适量， 加甲醇制成每1 mL含0.20 mg芦丁的溶液， 即得

25、芦丁对 照品储备液。 另取制备得到的互叶白千层总黄酮提取物约20 mg， 精密称定， 置100 mL量瓶 中， 加甲醇适量使溶解并稀释至刻度， 摇匀， 精密量取2 mL， 置10 mL量瓶中， 加入质量分数 为10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL， 摇匀放置8 min， 再分别加入质量分数为4%的NaOH溶液4.0 mL， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀放置l5 min后， 在498 nm波长处测定溶液的吸光度值A， 同时进 行空白对照。 本品总黄酮含量以芦丁计算不少于50. 0%。 0039 含量测定方法学试验如下： 0040 1. 标准曲线的制备 精密量吸取芦丁对照品储备液0.5、 1、 2

26、、 3、 4、 5 mL， 分别置10 mL 量瓶中， 分别加入质量分数为5%的NaNO2溶液0.5 mL， 摇匀放置8 min后， 分别加入质量 分数为10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL， 摇匀放置8 min， 再分别加入质量分数为4%的NaOH溶液 4.0 mL， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀放置l5 min后， 在498 nm波长处测定溶液的吸光度值A， 同时进行空白对照。 以浓度 （ g/mL） 为横坐标， 吸光度 （A） 为纵坐标绘制标准曲线， 得回归 方程Y=11.85X+0.0277， r = 0.9998， 表明在10100 g/mL范围内时， 芦丁线性关系良好。 0041

27、2. 精密度试验 取同一供试品溶液， 连续测定6次， 结果 RSD 为1.50%。 0042 3. 稳定性试验 取同一供试品溶液， 在加入NaOH溶液并用甲醇定容15min后， 分别 在此后的0、 30、 45、 60、 90、 120 min 测定A值， 结果RSD为1.37%， 表明供试品溶液在 120 分钟内稳定。 0043 4. 重复性试验 取同一批样品制备供试品溶液 6 份， 按拟定方法测定， 结果 RSD 为2.22%。 0044 5. 回收率试验 取已知含量的互叶白千层总黄酮提取物10 mg， 分别精密加入芦 丁对照品适量， 按拟定方法测定含量， 并计算回收率， 回收率平均值为

28、98. 2%， RSD 为 2. 4%。 0045 方法学试验结果表明该方法准确、 稳定、 操作简单， 可确保产品的质量。 0046 互叶白千层提取物毒性小， 同时具有抗炎、 抑菌、 镇痛、 止痒、 抗氧化等药理作用， 用互叶白千层提取物进行药效学和急性毒性试验， 结果如下： 0047 1. 抗炎试验 0048 取雄性小鼠50只， 随机分为空白对照组、 阳性 （阿司匹林0.2 g/kg） 对照组、 互叶白 千层提取物 （高浓度剂量： 5.1 g生药/kg、 中浓度剂量： 2.6 g生药/kg、 低浓度剂量： 1.3 g生 药/kg） 组， 每组10只小鼠。 每天灌胃连续给药阿司匹林和互叶白千层

29、提取物1次， 连续给药7 天。 在第7次给药1 小时后， 取2%巴豆油50 L抹涂于小鼠的右耳致炎造模， 4小时后拉颈处 死小鼠， 延小鼠左右耳廓用6 mm打孔器取下相同部位耳片， 称重， 并以两耳片质量差值 （mg） 说 明 书 4/8 页 6 CN 104840525 B 6 作为肿胀度指标计算肿胀抑制率 （%） 。 抗炎试验结果表明， 与正常对照组相比较， 互叶白千 层提取物高、 中、 低三个剂量对巴豆油所致小鼠耳廓肿胀具有抑制作用 （P0.05或P0.01） ， 抑制率分别为36.44%、 29.07%和30.67%， 但未见剂量依赖性关系， 提示互叶白千层提取物对 早期炎症具有一定的

30、抑制作用。 0049 0050 2. 镇痛试验 0051 选用雌性小鼠， 将小鼠放在在电热恒温水浴箱锅上， 调节温度至55 ， 记录小鼠 从投入热板到出现舔后足反应的时间(s)为指标， 测定每只小鼠的痛反应潜伏期， 测试两次 取均值， 筛选出痛反应潜伏期在530 s范围的合格雌性小鼠50只， 将合格小鼠随机分为正 常对照组、 阿司匹林 （0.2 g/kg） 组、 互叶白千层提取物 （高浓度剂量： 5.1 g生药/kg、 中浓度 剂量： 2.6 g生药/kg、 低浓度剂量： 1.3 g生药/kg） 组， 给药组每天灌胃给药以上剂量的阿司 匹林和互叶白千层提取物1次， 连续给药7天。 在末次给药1

31、小时后， 于15min、 30min和60 min 按上述方法测定各只小鼠的痛反应潜伏期， 重复测定2次， 超出60 s无反应的小鼠则按60 s 计， 求出各组平均值。 镇痛试验结果表明， 与正常对照组相比较， 互叶白千层提取物高、 中、 低三个剂量组在一定的时间范围内均明显延长小鼠热刺激性疼痛的潜伏期 （P0.05或P 0.01） ， 且随给药时间延长而改变， 表明互叶白千层提取物具有中枢镇痛作用。 说 明 书 5/8 页 7 CN 104840525 B 7 0052 0053 3. 抑菌试验 0054 用MH营养肉汤对表皮葡萄球菌、 金黄色葡萄球菌、 乙型副伤寒沙门菌、 大肠埃希杆 菌、

32、 铜绿假单胞菌、 福氏志贺氏菌、 枯草芽孢杆菌、 白色念珠菌8个菌种进行接种， 在37 的 细菌培养箱中培养18小时复活菌种后进行实验。 取MH营养肉汤和生药含量为0.5 g/mL 的 醇提物各50 L加入96孔细胞培养板第一行各孔中， 混匀后采用二倍稀释法稀释至下行各 孔， 取0.05% TTC无菌溶液和麦氏比浊度菌液适量加入无菌离心管中， 混合均匀后分别吸取 50 L加入对应的微孔中， 使1至7行的药物分别为125、 62.5、 31.25、 15.63、 7.82、 3.91、 1.95 mg/mL的浓度梯度。 在第8行设肉汤对照孔、 菌液对照孔和溶剂对照孔。 将此微孔板于细菌培 养箱中

33、37 下培养24 小时， 取出观察， 肉眼观查孔板中肉汤颜色， 以不显红色的微孔所对 应的药物浓度为最小抑菌浓度。 试验结果表明， 互叶白千层提取物对表皮葡萄球菌、 金黄色 葡萄球菌、 白色念珠菌有较强抗菌作用； 对福氏志贺氏菌、 铜绿假单胞菌、 大肠埃希杆菌具 有中度抗菌作用； 对乙型副伤寒沙门菌具有低度抗菌作用； 对枯草芽孢杆菌无抗菌作用。 0055 互叶白千层提取物体对8株菌种MIC的测定 说 明 书 6/8 页 8 CN 104840525 B 8 0056 0057 4. 小鼠被动皮肤过敏试验 0058 抗血清的制备： 称取医用天花粉37.5 mg溶于15 mL氢氧化铝凝胶中。 取健

34、康小鼠 10只， 雌雄参半， 注射上述氢氧化铝凝胶混悬液50 L于小鼠两后脚掌， 共注射100 L。 15天 后， 将小鼠断头取血， 离心分离抗血清， 混匀， 置冰箱备用。 0059 被动皮肤致敏和激发： 另取小鼠50只， 雌雄参半， 随机分为正常对照组， 息斯敏(10 mg/kg)， 互叶白千层提取物 （高浓度剂量： 5.1 g生药/kg、 中浓度剂量： 2.6 g生药/kg、 低浓 度剂量： 1.3 g生药/kg） 组， 每天灌胃给药息斯敏和互叶白千层提取物1次， 连续给药5天。 第 5天取混合抗血清， 按1:5稀释至生理盐水中， 于每只小鼠腹壁皮内注射两个点， 每点0.03 mL， 并继

35、续灌胃给药2天， 于末次给药12 小时后， 对每只小鼠进行抗原攻击， 每只小鼠按0.2 mL/只的剂量尾静脉注射2.5 mg/mL天花粉 （1%伊文思蓝-生理盐水配制） ， 20 min后处死小 鼠， 取下腹部蓝斑皮片， 剪碎后浸泡于含5 mL丙酮-生理盐水溶液(7:3 v/v)的试管中， 放置 48小时， 离心取上清液， 在波长610 nm处测定吸光值， 进行组间比较， 评价药物的抗过敏作 用。 0060 皮肤过敏实验结果表明， 与空白对照组比较， 互叶白千层提取物高、 中、 低三个剂 量均能降低小鼠皮肤蓝斑吸光度 （P0.05或P0.01） ， 并呈剂量依赖性关系， 表明互叶白千 层提取物

36、能抑制小鼠皮肤通透性， 具有一定的抗皮肤过敏作用。 0061互叶白千层提取物对小鼠被动皮肤过敏反应的影响( s， n=10) 说 明 书 7/8 页 9 CN 104840525 B 9 0062 0063 5. 自由基清除率测定实验 0064 5.1 反应时间的确定 0065 将优化条件下的互叶白千层提取物配制成一定浓度溶液， 取0.10 mL待测液加入 3.90 mL浓度为10 mol/L DPPH由自基甲醇溶液中， 迅速摇匀后在515 nm条件下对其进行时 间扫描， 以确定合适的反应时间。 由图2可知， 提取物加入 DPPH溶液中后， 前15 min其吸光 度下降非常迅速 (从0.968

37、下降到0.12 ) ， 反应30 min后基本趋于稳定， 因此本实验采用 30 min作为反应测定时间。 0066 5.2 互叶白千层提取物清除DPPH自由基能力的测定 0067 精密称定100 mg 互叶白千层提取物， 乙醇定容至100 mL。 分别配制浓度为1.0、 0.8、 0.6、 0.4、 0.2、 0.1 mg/ mL的乙醇溶液， 作为实验组。 同时配制等浓度梯度的槲皮素作 为对照组。 采用动力学监测法测定溶液随时间变化的吸光度A， 每30 s取值1次， 待吸光度基 本不变时， 药物与自由基反应完全， 记录最终吸光度。 0068 自由基清除率( %) =1-(Ai-Aj)/A010

38、0 0069 式中： A0为未加药DPPH溶液的空白吸光度， Ai为加药后DPPH 溶液的吸光度， Aj为样 品溶液自身的吸光度。 0070 5.3 清除自由基的半数有效量(EC50)的计算和自由基清除能力(AE)的评价 0071 根据药物添加量与自由基清除率(%)， 制作二者的关系曲线， 通过非线性回归分析 得到回归方程计算得到DPPH自由基原始质量浓度减少至50%(稳定态)时互叶白千层提取物 的用量为半数有效量(EC50)， 得出互叶白千层提取物清除DPPH自由基的EC50为17.48 g/ mL。 0072 急性毒性试验 0073 取小鼠40只， 雌雄参半， 随机分为4组， 每组10只，

39、 灌胃前12小时禁食不禁水。 给药 组按0.04 mL/g的小鼠体重灌胃给药互叶白千层提取物1次， 对照组灌胃给予同体积蒸馏 水， 给药后常规饲养， 观察小鼠的运动、 呼吸、 腹部刺激症状， 持续观察14天， 并记录小鼠毒 性反应、 死亡数和死亡情况。 统计各组的死亡率， 用Bliss法计算得到互叶白千层提取物对 小鼠灌胃给药的LD50为50.9 g/kg， LD50的95%置信区间为44.3557.65 g/kg。 表明互叶白 千层提取物具有较小的毒性。 说 明 书 8/8 页 10 CN 104840525 B 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 11 CN 104840525 B 11