具有脂肪酶的用于表面处理的组合物和方法.pdf

1、10申请公布号CN104080902A43申请公布日20141001CN104080902A21申请号201380007788222申请日2013013012000745520120203EP12001034320120216EPC11D3/386200601C12N9/2020060171申请人宝洁公司地址美国俄亥俄州72发明人NJ兰特L厄兰德森CH汉森J温德A斯文森CP宋克森74专利代理机构上海专利商标事务所有限公司31100代理人陈文青54发明名称具有脂肪酶的用于表面处理的组合物和方法57摘要本发明描述了用具有特定脂肪酶的组合物来处理纺织品和硬质表面的方法和组合物。所述组合物具有增加的对

2、氧化降解的稳定性，具体地由于漂白催化剂。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014080186PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0237282013013087PCT国际申请的公布数据WO2013/116261EN2013080851INTCL权利要求书3页说明书56页序列表2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书56页序列表2页10申请公布号CN104080902ACN104080902A1/3页21一种清洁纺织品或硬质表面或在织物和家庭护理中的其它表面的方法，包括以下步骤A使所述表面与水性溶液接触，所述水性溶液包含I脂肪酶；和II漂白

3、剂组分以及III任选的洗涤剂助剂；B冲洗并干燥所述纺织品或硬质表面；其特征在于所述脂肪酶具有与SEQIDNO1的成熟多肽相比改善的对氧化降解的稳定性以及脂肪酶活性。2一种清洁纺织品或硬质表面或在织物和家庭护理中的其它表面的方法，包括以下步骤A使所述表面与水性溶液接触，所述水性溶液包含I脂肪酶；和II漂白剂组分以及III任选的洗涤剂助剂；B冲洗并干燥所述纺织品或硬质表面；其特征在于所述脂肪酶包含脂肪酶变体，所述脂肪酶变体包含在以下位置中的一个或多个处的取代，所述位置选自对应于SEQIDNO1的成熟多肽的T37、N39和G91的位置，其中所述变体具有脂肪酶活性。3一种制备包含脂肪酶的洗涤剂组合物的

4、方法，所述脂肪酶表现出改善的对氧化降解的稳定性，所述方法包括将脂肪酶变体与洗涤剂助剂混合的步骤，所述脂肪酶变体具有与SEQIDNO1的成熟多肽相比改善的对氧化降解的稳定性，并且其中所述变体具有脂肪酶活性，优选地包含在以下位置中的一个或多个处的取代，所述位置选自对应于SEQIDNO1的成熟多肽的T37、N39和G91的位置。4根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据本文实例1中定义的测试，所述脂肪酶在式2的化合物的存在下表现出改善的对氧化降解的稳定性式2其中R1为2丁基辛基。5根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述脂肪酶与漂白剂组分混合。6根据权利要求1、2或权利要求5所述的方法，其

5、中所述漂白剂组分包含漂白催化剂，所述漂白催化剂能够接受来自过氧酸的氧原子并将所述氧原子传递给可氧化底物和II二酰基和/或四酰基过氧化物种类，优选包含亚胺和/或羰基官能团的漂白催化剂，最优选唑烷OXAZIDINIUM和/或双环氧乙烷官能团，和/或能够在接受氧原子时形成过氧亚胺正离子和/或双环氧乙烷官能团。7根据权利要求5所述的方法，其中所述漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构权利要求书CN104080902A2/3页3其中N和M独立地为0至4；每个R1独立地选自取代或未取代的基团，所述基团选自氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤素、氰基、磺酸基、烷氧基、酮基、羧基，和烷

6、氧羰基基团，以及任何两个相邻R1取代基可组合以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个R2独立地选自取代或未取代的基团，所述基团独立地选自氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳甲酰基、羧甲基和酰胺基；任何R2可与任何其它R2结合在一起以形成普通环的一部分；任何成对的R2可组合以形成羰基；并且其中任何两个R2可组合以形成取代或未取代的稠合不饱和部分；R3为C1C20取代或未取代的烷基；R4为氢或部分QTA，其中Q为支化或非支化的亚烷基，T0或1，并且A为阴离子基团，所述阴离子基团选自OSO3、SO3、CO2、OCO2、OPO32、OPO3H和OPO2；R5为氢或部分

7、CR11R12YGBYCCR9R10YOKR8，其中每个Y独立地选自O、S、NH或NR8；并且每个R8独立地选自烷基、芳基和杂芳基，所述部分为取代的或未取代的，并且无论被取代或未取代，所述部分具有的碳都少于21个；每个G独立地选自CO、SO2、SO、PO和PO2；R9和R10独立地选自氢和C1C4烷基；R11和R12独立地选自氢和烷基，或当其合在一起时，可参与形成羰基；B0或1；C可等于0或1，但如果B等于0，则C必须等于0；Y为1至6的整数；K为0至20的整数；R6为H、或烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分为取代或未取代的；并且当X存在时，其为合适的电荷平衡抗衡离子，优选地所述漂白催化剂具有对

8、应于以下化学式的化学结构其中R13为包含3至24个碳的支化烷基、或包含1至24个碳的直链烷基，最优选地其中R13选自2丁基辛基、2戊基壬基、2十六烷基、异十三烷基和异十五烷基。8根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亲本脂肪酶包含与SEQIDNO1的成熟多肽具有至少60的同一性的氨基酸序列；由SEQIDNO1的成熟多肽的氨基酸序列或其具有脂肪酶活性的片段组成。9根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述变体为A多肽，所述多肽包含与SEQIDNO1的成熟多肽具有至少60的同一性的氨基酸序列；B由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件下与以下杂交ISEQIDNO1的成熟多肽编码序

9、列；或III的全长互补链，或C由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与所述SEQIDNO1的成熟多肽编码序权利要求书CN104080902A3/3页4列具有至少60的同一性的核苷酸序列。10根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述脂肪酶变体中的取代选自T37A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y、N39A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y和G91D,H,I,P,Q。11根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述变体包含取代G91A。12根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述变体还包含在一个或多个位置处的取代，所述位置对应于SE

10、QIDNO1的成熟多肽的位置D96、T143、A150、E210、G225、T231、N233和P250，优选地包含选自D96G、T143A、A150G、E210Q、G225R、T231R、N233R和P250R以及它们的混合的取代。13根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述变体具有以下取代AG91AD96GT231RN233R；BG91QT143AE210QT231RN233RP250R；CG91QA150GE210QT231RN233RP250R；DT37RN39RG91AD96GT231RN233R；EG91AD96GG225RT231RN233R；FG91QE210QT231RN

11、233RP250R；GG91NE210QT231RN233RP250R；HG91IE210QT231RN233RP250R；IG91LE210QT231RN233R；或JG91AD96GA150GT231RN233R。14一种清洁和/或处理组合物，包含脂肪酶变体和洗涤剂助剂，所述脂肪酸变体具有脂肪酶活性并表现出改善的对氧化降解的稳定性。15一种清洁和/或处理组合物，包含脂肪酶变体和洗涤剂助剂，所述脂肪酶变体具有脂肪酶活性并包含在以下位置中的一个或多个处的取代，所述位置选自对应于SEQIDNO1的成熟多肽的T37、N39和G91的位置。权利要求书CN104080902A1/56页5具有脂肪酶的用

12、于表面处理的组合物和方法0001对序列表的标引0002本专利申请包含计算机可读格式的序列表，其以引用方式并入。技术领域0003本发明涉及组合物，其包含脂肪酶和漂白剂，以及制备和使用此类组合物的方法，所述组合物优选地为织物以及家庭护理产品。背景技术0004洗涤剂制造商一直尝试提供清洁组合物，尤其是织物和餐具清洁组合物，所述组合物提供最强力的清洁体系。就用脂肪酶清洁而言，它们可为特别容易氧化，特别是在储存期间或在洗涤或处理步骤中此类酶与漂白剂接触的情况下，或者同时在洗涤或处理步骤中掺入，或者来自预处理步骤尤其例如来自预处理漂白步骤遗留的一种或其它组分。这导致所述组合物作为一个整体损失活性或功效，并

13、且具体地损失酶活性。某些漂白剂组分尤其成问题，如预成形的过酸和漂白催化剂或促进剂。WO2007/001262涉及清洁组合物，所述清洁组合物包含具有增强的酶相容性的有机催化剂，特别是针对淀粉酶增强了相容性。仍需要缓解该问题的组合物。发明内容0005根据本发明，提供了针对织物和/或家庭护理的清洁和/或处理纺织品、硬质表面和/或其它表面的方法，包括以下步骤0006A使纺织品、硬质表面和/或织物和/或家庭护理的其它表面与水性溶液接触，所述水性溶液包含I脂肪酶；和II漂白剂组分和III任选的洗涤剂助剂；0007B冲洗并干燥纺织品或硬质表面；0008其特征在于所述脂肪酶具有与SEQIDNO1的成熟多肽相比

14、改善的对氧化降解的稳定性以及脂肪酶活性，优选地所述脂肪酶变体包括包含在以下位置中的一个或多个处的取代的脂肪酶变体，所述位置选自对应于SEQIDNO1的成熟多肽的T37、N39和G91的位置。0009本发明也提供了制备包含脂肪酶变体的洗涤剂组合物的方法，所述脂肪酶变体表现出与SEQIDNO1的脂肪酶变体相比改善的对氧化降解的稳定性以及脂肪酶活性，所述方法包括将脂肪酶变体与洗涤剂助剂混合的步骤。优选地所述脂肪酶变体为包含在以下位置中的一个或多个处的取代的SEQIDNO1的变体，所述位置选自对应于SEQIDNO1的成熟多肽的T37、N39和G91的位置。0010根据本发明的另外的方面，其提供了一种组

15、合物，所述组合物包含脂肪酶变体和洗涤剂助剂，所述脂肪酶变体具有脂肪酶活性并表现出改善的对氧化降解的稳定性。本发明也提供了一种清洁和/或处理组合物，所述组合物包含脂肪酶变体和洗涤剂助剂，所述脂肪酶变体具有脂肪酶活性并包含在以下位置中的一个或多个处的取代，所述位置选自对说明书CN104080902A2/56页6应于SEQIDNO1的成熟多肽的T37、N39和G91的位置。可为优选的是所述组合物还包含漂白剂组分。0011根据本发明的另外的方面，提供了制备洗涤剂组合物的方法，所述洗涤剂组合物包含脂肪酶并表现出改善的对氧化降解的稳定性，所述方法包括将脂肪酶变体与洗涤剂助剂混合的步骤，所述脂肪酶变体包含在

16、以下位置中的一个或多个处的取代，所述位置选自对应于SEQIDNO1的成熟多肽的T37、N39和G91的位置，其中所述变体具有脂肪酶活性。0012可通过在实例1后的测试对表现出改善的对氧化降解的稳定性的脂肪酶变体进行测定。表现出改善的对氧化降解的稳定性的脂肪酶变体具有至少101、或至少12或甚至至少15的RPWASH。用于进行比较的常规脂肪酶是SEQIDNO1的脂肪酶。具体实施方式0013定义0014除非另外指明，所有组分或组合物含量参考该组分或组合物的活性物质部分，并且不包括可能存在于此类组分或组合物的可商购获得源中的杂质，例如残余溶剂或副产物。0015所有的百分比和比率是1按重量计来计算的，

17、除非另外指明，和2基于总体组合物计来计算的，除非另外指明。0016如本文所用，当用于权利要求书中时，冠词诸如“一个”和“一种”被理解为是指一种或多种受权利要求书保护或描述的物质。0017如本文所用，术语“包括”、“包含”和“含有”旨在为非限制性的。0018如本文所用，术语“固体”包括颗粒、粉末、条和片剂产品形式。0019如本文所用，术语“流体”包括液体、凝胶、糊剂和气体产品形式。0020如本文所用，术语“脂肪酶”或“脂解酶”或“类脂酯酶”是由酶命名法定义的分类EC31,1的酶。它可具有脂肪酶活性三酰基甘油脂肪酶，EC3113、角质酶活性EC31174、甾醇酯酶活性EC31113和/或蜡酯水解酶

18、活性EC31150。就本发明的目的而言，根据实例中所述的步骤测定脂肪酶活性。在一个方面，本发明的所述变体具有SEQIDNO1的成熟多肽的脂肪酶活性的至少20、例如，至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、或至少100。0021如本文所用，术语“等位变体”是指占据相同染色体座位的基因的任何两个或更多个的替代形式。等位变体天然来源于突变，并且可导致种群内的多态性。基因突变可为沉默突变不改变编码的多肽或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体为由基因等位变体编码的多肽。0022如本

19、文所用，术语“CDNA”是指能够通过逆转录从自真核或原核细胞获得的成熟的、经拼接的MRNA分子制备的DNA分子。CDNA缺少可存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。最初的初始RNA转录物是MRNA的前体，其在作为成熟的经拼接的MRNA出现之前，通过一系列步骤，包括拼接，被加工。0023如本文所用，术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接指定变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，它起始于起始密码子诸如ATG、GTG或TTG，并终止于说明书CN104080902A3/56页7终止密码子诸如TAA、TAG、和TGA。所述编码序列可为基因组DNA、CDNA、合成DNA或它们的组合。002

20、4如本文所用，术语“对照序列”是指编码本发明的变体的多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个对照序列对于编码所述变体的多核苷酸可为原生的即，出自相同基因或外源的即，出自不同基因，或彼此原生或外源的。此类对照序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最低限度，对照序列包括启动子以及转录和翻译停止信号。出于引入有助于对照序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接的特异性限制性位点的目的，对照序列可具有接头。0025如本文所用，术语“表达”包括变体的产生所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。0026如本文所用，术语“表达载体”是指

21、线性或环状DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸可操作地连接至提供其表达的对照序列。0027如本文所用，术语“片段”是指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一个或个例如，若干个氨基酸的多肽；其中所述片段具有脂肪酶活性。在一个方面，片段包含成熟多肽的氨基酸数量的至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90，以及至少95。0028如本文所用，术语“高严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准SOUTHERN印迹法步骤，在42下、在5XSSPE、03的SDS、200MG/ML经过剪切和变性的鲑鱼精DNA、以及50的甲酰胺中预杂

22、交和杂交12至24小时。在65下，用2XSSC、02的SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。0029如本文所用，术语“宿主细胞”是指对用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包括了由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何子代。0030如本文所用，术语“改善的特性”是指与变体相关联的与亲本相比改善的特性。此类改善的特性包括在有机催化剂的存在下改善的性能。在一些优选的实施例中，本发明涉及组合物或方法，其中所述变体具有改善的对有机催化剂的稳定性，所述有机催化剂选自具有以下公式的有机催化剂0031A公式1；0032B

23、公式2；或0033C它们的混合物，0034它们的混合物，其中每个R1独立地为包含3至24个碳的支化烷基或包含1至24个碳的直链烷基，具体地其中R为2丁基辛基，并且优选地改善的稳定性是在公式2的存在下，其中R为2丁基辛基。0035如本文所用，术语“分离的”是指处于非天然存在的形式或环境的物质。分离的物质的非限制性例子包括1任何非天然存在的物质，2包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、多肽或辅因子是或至少部分地从其天然相关联的组分去除了一种或多种或说明书CN104080902A4/56页8全部天然存在的组分的任何物质；3相对于天然存在的物质经过人手修改的任何物质；或4通过增加相对于其天然相关联的

24、其它组分的物质的量而改性的任何物质例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子。分离的物质可存在于发酵液体培养基样品中。0036如本文所用，术语“低严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准SOUTHERN印迹法步骤，在42下、在5XSSPE、03的SDS、200MG/ML经过剪切和变性的鲑鱼精DNA、以及25的甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在50下，用2XSSC、02的SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。0037如本文所用，术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰诸如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等后最终形式的多肽

25、。在一个方面，所述成熟多肽是SEQIDNO1的1至269位氨基酸。0038如本文所用，术语“中等严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准SOUTHERN印迹法步骤，在42下、在5XSSPE、03的SDS、200MG/ML经过剪切和变性的鲑鱼精DNA、以及35的甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在55下，用2XSSC、02的SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。0039如本文所用，术语“中高严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准SOUTHERN印迹法步骤，在42下、在5XSSPE、03的SDS、200MG/ML经过剪切和变性的鲑鱼精DNA、以及任一35的甲

26、酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在60下，用2XSSC、02的SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。0040如本文所用，术语“突变体”是指编码变体的多核苷酸。0041如本文所用，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，它是从天然存在的基因分离的，或者是以否则将不会天然地存在的方式经过修改以包含核酸的片段的，或者它是合成的，其包含一个或多个对照序列。0042如本文所用，术语“可操作地连接”是指一种构型，对照序列在其中被置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置上，使得所述对照序列指导编码序列的表达。0043如本文所用，术语“亲本”或“亲本脂肪酶”是指对其进行改变以制备本发明的所述酶变体的脂

27、肪酶。亲本可为天然存在的野生型多肽或其变体或片段。0044序列同一性用参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的相关性。针就本发明的目的而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性使用NEEDLEMANWUNSCH算法NEEDLEMAN和WUNSCH，1970，JMOLBIOL48443453如EMBOSS程序包的NEEDLE程序中实施的EMBOSSTHEEUROPEANMOLECULARBIOLOGYOPENSOFTWARESUITE，RICE等人，2000，TRENDSGENET16276277来确定，优选500或更新的版本。所用的参数是，为10的空位罚分，为05的空位延伸罚分，和

28、EBLOSUM62EMBOSS版的BLOSUM62取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的NEEDLE输出使用NOBRIEF选项获得作为百分比同一性，并且如下计算0045相同残基100/序列长度序列中的总空位数0046就本发明的目的而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性使用如EMBOSS软件包在NEEDLE程序中实现的EMBOSS欧洲分子生物学开放软件包THEEUROPEANMOLECULARBIOLOGYOPENSOFTWARESUITE，RICE等人，2000，同上NEEDLEMANWUNSCH算说明书CN104080902A5/56页9法NEEDLEMAN和WUNSCH，1970，同上

29、优选500或更新的版本来确定。所用的参数是10的空位罚分，05的空位延伸罚分，和EDNAFULLEMBOSS版的NCBINUC44取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的NEEDLE输出使用NOBRIEF选项获得作为百分比同一性，并且如下计算0047相同脱氧核糖核苷酸100/序列长度序列中的总空位数0048如本文所用，术语“亚序列”是指从成熟多肽编码序列的5和/或3端缺失了一个或多个例如，若干个核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有脂肪酶活性的片段。在一个方面，亚序列包含成熟多肽编码序列的核苷酸数量的至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90，以及至

30、少95。0049如本文所用，术语“变体”是指具有脂肪酶活性的多肽，所述多肽包含在一个或多个例如，若干个位置处的取代。取代是指占据一个位置的氨基酸被不同的氨基酸替换。本发明的所述变体具有SEQIDNO1的成熟多肽的脂肪酶活性的至少20、例如，至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、或至少100。0050如本文所用，术语“非常高的严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准SOUTHERN印迹法步骤，在42下、在5XSSPE、03的SDS、200MG/ML经过剪切和变性的鲑鱼精

31、DNA、以及50的甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在70下，用2XSSC、02的SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。0051如本文所用，术语“非常低的严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准SOUTHERN印迹法步骤，在42下、在5XSSPE、03的SDS、200MG/ML经过剪切和变性的鲑鱼精DNA、以及25的甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在45下，用2XSSC、02的SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。0052如本文所用，术语“野生型”脂肪酶是指由天然存在的微生物诸如细菌、酵母或天然存在的丝状真菌表达的脂肪酶。0053变体设计的规则0054出于本发明的

32、目的，SEQIDNO1中公开的成熟多肽被用于确定另一个脂肪酶中对应的氨基酸残基。将另一个脂肪酶的氨基酸序列与SEQIDNO1中公开的成熟多肽比对，并且基于上述比对，对应于SEQIDNO1中公开的成熟多肽的任一个氨基酸残基的氨基酸位置数使用NEEDLEMANWUNSCH算法NEEDLEMAN和WUNSCH，1970，JMOLBIOL48443453如EMBOSS程序包的NEEDLE程序中实施的EMBOSSTHEEUROPEANMOLECULARBIOLOGYOPENSOFTWARESUITE，RICE等人，2000，TRENDSGENET16276277来确定，优选500或更新的版本。所用的参数

33、是，为10的空位罚分，为05的空位延伸罚分，和EBLOSUM62EMBOSS版的BLOSUM62取代矩阵。0055另一个脂肪酶中对应的氨基酸残基的鉴定可通过多个多肽序列的比对来确定，使用若干个计算机程序包括但不限于MUSCLEMULTIPLESEQUENCECOMPARISONBYLOGEXPECTATION；版本35或更新的；EDGAR，2004，NUCLEICACIDSRESEARCH3217921797、MAFFT版本6857或更新的；KATOH和KUMA，2002，NUCLEICACIDSRESEARCH3030593066；KATOH等人，2005，NUCLEICACIDSRESEA

34、RCH33511518；KATOH和TOH，2007，BIOINFORMATICS23372374；KATOH等人，2009，METHODSINMOLECULARBIOLOGY说明书CN104080902A6/56页105373964；KATOH和TOH，2010，BIOINFORMATICS2618991900、和EMBOSSEMMA使用CLUSTALW183或更新的；THOMPSON等人，1994，NUCLEICACIDSRESEARCH2246734680，使用它们相应的默认参数。0056当其它的酶与SEQIDNO1的成熟多肽不一致，使得常规的基于序列的比对未能检测到它们的关联时LIND

35、AHL和ELOFSSON，2000，JMOLBIOL295613615，可使用其它两两序列比对算法。使用利用了多肽家族的概率表现谱来检索数据库的检索程序能够获得基于序列的检索中的更高灵敏度。例如，PSIBLAST程序通过迭代的数据库搜索过程来生成谱，并且能够检测远缘同系物ATSCHUL等人，1997，NUCLEICACIDSRES2533893402。如果多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表，能够实现甚至更高的敏感性。例如GENTHREADERJONES，1999，JMOLBIOL287797815；MCGUFN和JONES，2003，BIOINFORMATICS19874

36、881的程序利用多种来源的信息PSIBLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶解能作为预测查询序列的结构性折叠的神经网络的输入。类似地，GOUGH等人，2000，JMOLBIOL313903919的方法可被用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型比对。这些比对可以继而用于生成多肽的同源性模型，且可以使用多种为此目的开发的工具来评估这类模型的精确性。0057对于已知结构的蛋白质，已经有数种用于检索和生成其结构性比对的工具和资源。例如，蛋白质的SCOP超家族已经过结构性比对，并且可以获取和下载那些比对。可以使用多种算法来比对两种或更多种的蛋白质结构，例如距离比对矩阵HOLM和SAND

37、ER，1998，PROTEINS338896或组合延伸SHINDYALOV和BOURNE，1998，PROTEINENGINEERING11739747，并且还可以利用这些算法的具体实施在结构数据库中查询所关注的结构，以发现可能的结构性同源物例如，HOLM和PARK，2000，BIOINFORMATICS16566567。0058在对本发明的所述变体的描述中，使用以下命名法以便于参考。使用了公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。0059取代就氨基酸取代而言，使用以下命名初始氨基酸，位置，取代的氨基酸。因此，将在位置226处用丙氨酸取代苏氨酸表示为“THR226ALA”或“T226A”。用加

38、号“”分隔多个突变，例如“GLY205ARGSER411PHE”或“G205RS411F”代表在位置205和411处分别用精氨酸R取代甘氨酸G以及用苯丙氨酸F取代丝氨酸S。0060多个取代包含多个取代的变体用加号“”分开，例如“ARG170TYRGLY195GLU”或“R170YG195E”代表分别在位点170和195用酪氨酸取代精氨酸及用谷氨酸取代甘氨酸。0061不同的取代在某一个位置处可以引入不同的改变的情况下，用逗号分开不同的改变，例如“ARG170TYR，GLU”或“R170Y，E”代表在位置170处用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。因此，“TYR167GLY，ALAARG170GLY，AL

39、A”命名了以下变体“TYR167GLYARG170GLY”、“TYR167GLYARG170ALA”、“TYR167ALAARG170GLY”、和“TYR167ALAARG170ALA”。0062脂肪酶变体0063为了评估所述脂肪酶变体对氧化降解的稳定性，测定了相对性能值RPWASH，即待测脂肪酶变体的洗涤性能P，除以SEQIDNO1的脂肪酶的洗涤性能。因此RPWASHP发明的脂肪酶变体/PSEQIDNO1脂肪酶。具有改善的对氧化降解的稳定性的脂肪酶变体会具有至少101，优选地至少11，或甚至至少15的RPWASH值。0064适用于本发明的脂肪酶变体包含在以下位置中的一个或多个处的取代，所述位

40、置说明书CN104080902A107/56页11选自对应于T37、N39和G91的位置。优选地所述脂肪酶变体为分离的脂肪酶变体。本发明中所用的合适的脂肪酶变体优选地包含在一个或多个例如，若干个位置处取代，所述位置对应于SEQIDNO1的成熟多肽的位置T37A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y、N39A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y、和G91D,H,I,P,Q或甚至G91A，其中所述变体具有脂肪酶活性。最优选地此类一个或多个取代与T231R和N233R的一个，优选地两者混合。0065优选地所述变体与所述亲本脂肪酶的氨基酸序列具有至少6

41、0、例如，至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、或至少99，但少于100的序列同一性。0066在另一个实施例中，所述变体与SEQIDNO1的成熟多肽具有至少60，例如，至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95，诸如至少96、至少97、至少98、或至少99，但少于100的序列同一性。0067在一个方面，本发明的变体中取代的数量是120个，例如，110个和15个，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14

42、、15、16、17、18、19、或20个取代。0068在另一方面，变体包含在一个或多个例如，若干个位置处取代，所述位置对应于SEQIDNO1的成熟多肽的位置T37A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y、N39A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y和G91D,H,I,P,Q。在另一方面，变体包含在两个位置处的改变，所述位置对应于SEQIDNO1的成熟多肽的位置T37A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y、N39A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y和G91D,H,I,P,Q中的任一个。在另一方

43、面，变体包含在三个位点的改变，所述位置对应于SEQIDNO1的成熟多肽的位置T37A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y、N39A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y和G91D,H,I,P,Q中的任一个。0069在另一方面，所述变体包含在一个位置处的取代或由其组成，所述位置对应于SEQIDNO1的成熟多肽的位置T37，其被ALA、ARG、ASN、ASP、CYS、GLN、GLU、GLY、HIS、ILE、LEU、LYS、MET、PHE、PRO、SER、THR、TRP、TYR、或VAL取代，优选地被ALA、ARG、ASN、ASP、GLN、GLU、G

44、LY、HIS、ILE、LEU、PHE、PRO、SER、TRP、TYR、或VAL取代。在另一方面，所述变体包含在SEQIDNO1的成熟多肽的取代T37A、T37D、T37E、T37F、T37G、T37H、T37I、T37L、T37N、T37P、T37Q、T37R、T37S、T37V、T37W、或T37Y或由其组成。0070在另一方面，所述变体包含在一个位置处的取代或由其组成，所述位置对应于SEQIDNO1的成熟多肽的位置N39，其被ALA、ARG、ASN、ASP、CYS、GLN、GLU、GLY、HIS、ILE、LEU、LYS、MET、PHE、PRO、SER、THR、TRP、TYR、或VAL取代，

45、优选地被ALA、ARG、ASN、ASP、CYS、GLN、GLU、GLY、ILE、LEU、LYS、MET、PHE、PRO、THR、TRP、TYR、或VAL取代。在另一方面，所述变体包含在SEQIDNO1的成熟多肽的取代N39A、N39C、N39D、N39E、N39F、N39G、N39I、N39K、N39L、N39M、N39P、N39Q、N39R、N39T、N39V、N39W、N39Y或由其组成。0071在另一方面，所述变体包含在一个位置处的取代或由其组成，所述位置对应于SEQIDNO1的成熟多肽的位置G91，其被ALA、ARG、ASN、ASP、CYS、GLN、GLU、GLY、HIS、ILE、LE

46、U、LYS、MET、PHE、PRO、SER、THR、TRP、TYR、或VAL取代，优选地被ASP、GLN、HIS、ILE、或PRO取代。在另一方面，所述变体包含SEQIDNO1的成熟多肽的取代G91D、G91H、G91I、G91P、说明书CN104080902A118/56页12G91Q或由其组成。在一个优选的方面，所述变体包含一个位置处的取代或由其组成，所述位置对应于G91其为G91A。0072在另一方面，所述变体包含在多个位置处的取代或由其组成，所述位置对应于位置T37和N39，诸如上述的那些。0073在另一方面，所述变体包含在多个位置处的取代或由其组成，所述位置对应于位置T37和G91，

47、诸如上述的那些。0074在另一方面，所述变体包含在多个位置处的取代或由其组成，所述位置对应于位点N39和G91，诸如上述的那些。0075在另一方面，所述变体包含在多个位置处的取代或由其组成，所述位置对应于位点T37、N39和G91，诸如上述的那些。0076所述变体还可包含在一个或多个例如，若干个其它位置处的一个或多个另外的取代。0077氨基酸改变可为次要性质的，即保守氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；小缺失，通常为130个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基；至多2025个残基的小的接头肽；或通过改变净电荷或另一种功能以利于纯化的小的延伸，诸如聚组氨酸束

48、、抗原表位或结合结构域。0078保守取代的例子在碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸和组氨酸、酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸、极性氨基酸谷氨酰胺和天冬酰胺，疏水氨基酸亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸、芳族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，和小氨基酸甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸和甲硫氨酸的组内。0079作为另外一种选择，氨基酸变化具有此类性质使所述多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸变化可改善所述多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适PH等等。0080例如，所述变体可包含在一个位置处的取代，所述位置对应于SEQIDNO1的成熟多肽的位置D96、T143、A150、E210、G225、T231、N233和P250。在一

49、些实施例中，所述取代选自D96G、T143A、A150G、E210Q、G225R、T231R、N233R和P250R。0081在一个优选的实施例中，本发明中所用的脂肪酶变体涉及选自以下的变体0082G91QT143AE210QT231RN233RP250RG91QA150GE210QT231RN233RP250RT37RN39RG91AD96GT231RN233RG91QE210QT231RN233RP250RG91IE210QT231RN233RP250RG91AD96GT231RN233RG91AD96GG225RT231RN233R说明书CN104080902A129/56页13G91NE210QT231RN233RP250RG91LE210QT231RN233RG91AD96GA150GT231RN233R00830084多肽中的必需氨基酸可根据本领域已知的方法进行鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变CUNNINGHAM和WELLS，1989，SCIENCE24410811085。在后一种技术中，单个丙氨酸突变被引入分子