丰加霉素在防治番茄早疫病中的应用.pdf

1、10申请公布号CN101961015A43申请公布日20110202CN101961015ACN101961015A21申请号201010127378X22申请日20100319CGMCCNO206020070525A01N43/90200601A01P3/0020060171申请人中国计量学院地址310018浙江省杭州市下沙高教园区学源街72发明人申屠旭萍俞晓平董胜张郝培应边亚琳陈春54发明名称丰加霉素在防治番茄早疫病中的应用57摘要本发明公开了一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法，属于微生物技术领域。该方法利用一种从浙江杭州临安天目山采集的土样中分离筛选出的淀粉酶产色链霉菌D，经过菌种

2、的活化培养；发酵培养；发酵物提取；将所提纯的活性化合物配以农用药物辅料等步骤，制备成多种剂型的农用药物。该微生物农药可用于防治黄瓜枯萎病、番茄灰霉病或番茄早疫病等蔬菜真菌病害，其防治效果较常规化学药剂相当或略优，且安全。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN101961016A1/1页21丰加霉素在防治番茄早疫病中的应用。2权利要求1所述的应用，其中丰加霉素由以下方法获得淀粉酶产色链霉菌STREPTOMYCESDIASTATOCHROMOGENESD经斜面活化培养和发酵培养获得含有丰加霉素的发酵液，向发酵液中加入等体积的正丁醇

3、进行萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，再以蒸馏水溶解，离心取上清液，而后上SEPHADEXLH20柱层析，以体积比1090的乙醇和蒸馏水梯度洗脱，分离纯化得活性化合物丰加霉素，所述的淀粉酶产色链霉菌D已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCCNO2060。权利要求书CN101961015ACN101961016A1/5页3丰加霉素在防治番茄早疫病中的应用技术领域0001本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及生防放线菌淀粉酶产色链霉菌STREPTOMYCESDIASTATOCHROMOGENESD的培养及其代谢产物的分离与应用。背景技术0002放线菌ACTIN

4、OMYCETES与人类的关系极为密切。据统计，在已发现的抗生素中，有70约为放线菌所产生。土壤是放线菌栖居的重要场所，从土壤中获得具有高效抗菌活性的放线菌产生抗生素是目前世界范围内研制开发新医药和新农药必不可少的基础工作。0003目前对植物病害的防治，主要采用化学农药防治的方法。化学农药虽然对多种病害有较理想的防治效果，但长期使用会诱发病菌的抗药性。另外，农药的频繁使用不仅增加了农产品的生产成本，农药残留问题也十分严重。利用放线菌产生的抗病原真菌的活性物质进行植物真菌病害的生物防治，则具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点。0004本发明从杭州的土壤中分离到一株生防放线菌，经微生物分类

5、学鉴定为淀粉酶产色链霉菌STREPTOMYCESDIASTATOCHROMOGENES，并对此生防放线菌发酵代谢产物中的抗菌成分进行分离，得到了活性成分，经四大光谱分析，证明为已知核苷类抗生素，丰加霉素TOYOCAMYCIN。该发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株和生物活性化合物。0005以往对丰加霉素活性的报道主要集中在抗肿瘤方面，但由于其对人正常细胞的毒性太大，无法应用于临床。在抗菌活性的报道方面，丰加霉素主要抑制白假丝酵母，新隐球酵母，草分支杆菌和金黄色葡萄球菌等，几乎没有对植物病原菌稻瘟病菌MAGNAPORTHEGRISEA除外抑制作用的相关报道陈伊，李舟，魏玉珍，等

6、根际放线菌I0603431产生的核苷类抗生素3431的研究生物学杂志，2009，2641720。本研究通过对淀粉酶产色链霉菌抗菌活性成分丰加霉素的研究发现，丰加霉素在低浓度就能强烈抑制黄瓜枯萎病菌FUSARIUMOXYSPORUM、番茄灰霉病菌BOTRYTISCINEREA和番茄早疫病菌ALTERNARIASOLANI孢子萌发和菌丝生长。本发明正是填补了这项空白，拓宽了丰加霉素的应用。同时本发明中淀粉酶产色链霉菌产丰加霉素的发酵水平在1056MG/L，相比文献MCFLICKINGER，MGREENSTEIN，CBREMMON，ETALSTRAINSELECTION，MEDIUMDEVELOPM

7、ENTANDSCALEUPOFTOYOCAMYCINPRODUCTIONBYSTREPTOMYCESCHRESTOMYCETICUSBIOPROCESSENGINEERING，51990143153报道的产素水平约12MG/L要高出78倍。发明内容0006本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一种从杭州土壤中分离筛选出的放线菌淀粉酶产色链霉菌D；本发明的另一目的是提供利用该菌株通过发酵提取其代谢产物制备成防治部分植物真菌病害的微生物农药及其制备方法。说明书CN101961015ACN101961016A2/5页40007本发明淀粉酶产色链霉菌的分离、筛选与鉴定000

8、8是于2006年8月在浙江杭州临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为淀粉酶产色链霉菌STREPTOMYCESDIASTATOCHROMOGENES，定名为淀粉酶产色链霉菌STREPTOMYCESDIASTATOCHROMOGENESD。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCCNO2060。保藏文件参见专利ZL2007101568337的公开文本，公开号为CN101225368A。0009淀粉酶产色链霉菌D显微形态特征孢子丝直、钩状、松

9、散螺旋形，孢子长圆、椭圆或卵圆形。0010本发明所述的淀粉酶产色链霉菌D，经发酵提取可获得对部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的活性化合物丰加霉素TOYOCAMYCIN。0011本发明目的通过以下技术方案来实现0012一种防治番茄灰霉病、黄瓜枯萎病或番茄早疫病等植物真菌病害微生物农药的制备方法，按以下步骤进行00131菌种的活化培养将分离保存的淀粉酶产色链霉菌D菌种移至试管内高氏一号斜面上，在281条件下，培养至试管斜面长满孢子；00142发酵培养发酵培养液为每1000ML中含有玉米粉215G，可溶性淀粉10G，麸皮5G，CACO325G，NH4NO315G，FESO405G，KH2PO415

10、G，灭菌；待冷却至40，在无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌D至发酵培养液中，在281条件下，培养5天；00153发酵物提取发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得活性化合物TOYOCAMYCIN，该化合物分子式为C12H13N5O4，结构式见下式；001600174将此活性化合物配以农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。0018本发明的有益效果0019一是本发明从杭州土壤分离筛选出代谢物产量高、并对部分植物真菌病害病原菌具有较强抑制作用的淀粉酶产色链霉菌D，这为农业上防治植物真菌病害病原菌提供了一种微生物菌株；0020二是本发明提供了从淀粉酶产色链霉菌D的发酵物中提取其活性

11、代谢产物丰加霉素TOYOCAMYCIN，并进而制备成可防治植物真菌病害的微生物源农药的制备方法；该农药应用于植物真菌病害的防治，其效果较常规化学药剂相仿或略优见试验例表13，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。说明书CN101961015ACN101961016A3/5页5具体实施方式0021实施例1淀粉酶产色链霉菌D的分离与筛选0022本发明于2006年8月在浙江临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤，从中获得淀粉酶产色链霉菌STREPTOMYCESDIASTATOCHROMOGENESD，保存。0023淀粉酶产色链霉菌STREPT

12、OMYCESDIASTATOCHROMOGENESD抑菌活性测定取其发酵上清液1ML于无菌培养皿内，与9ML冷却至50的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4MM的黄瓜枯萎病菌或番茄灰霉病菌或番茄早疫病菌等供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央培养皿直径为9CM，置培养箱中28培养36H，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率00240025测定结果表明淀粉酶产色链霉菌STREPTOMYCESDIASTATOCHROMOGENESD代谢产物对黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑制率分别为869、83和852。0026实施例2淀粉

13、酶产色链霉菌D发酵代谢产物的制备方法0027按以下步骤进行00281菌种试管斜面活化培养斜面培养基为高氏一号培养基，其组分与含量为K2HPO405G、KNO31G、MGSO405G、可溶性淀粉20G、NACL05G、FESO4001G、琼脂20G，溶化后补足水至1L；在无菌条件下用接种环挑取少许淀粉酶产色链霉菌D的孢子，至已灭菌的高氏一号培养基试管15150MM中，置培养箱内281，活化培养96H，至试管斜面长满孢子；00292发酵培养发酵培养液为每1000ML中含有黄玉米粉215G，可溶性淀粉10G，麸皮5G，CACO325G，NH4NO315G，FESO405G，KH2PO415G，余量为

14、水；每300ML三角瓶装40ML发酵培养液，配制后121灭菌20MIN，待冷却至40在无菌条件下，挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D孢子接种，281，发酵培养5天；00303发酵物提取发酵完毕后收集发酵液，向发酵液中加入等体积的正丁醇进行萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，再以蒸馏水溶解，离心取上清液，而后上SEPHADEXLH20柱层析，以体积比1090的乙醇和蒸馏水梯度洗脱，分离纯化得活性化合物TOYOCAMYCIN。0031本发明中淀粉酶产色链霉菌产丰加霉素的发酵水平在1056MG/L，相比文献MCFLICKINGER，MGREENSTEIN，CBREMMON，ETALSTRAINSEL

15、ECTION，MEDIUMDEVELOPMENTANDSCALEUPOFTOYOCAMYCINPRODUCTIONBYSTREPTOMYCESCHRESTOMYCETICUSBIOPROCESSENGINEERING，51990143153报道的产素水平约12MG/L要高出78倍。0032以下实施例3、4中所述的淀粉酶产色链霉菌D代谢产物均为实施例2所制产品；所述产品的百分含量均为质量百分比。0033实施例3利用淀粉酶产色链霉菌D发酵代谢产物制备成可湿性粉剂说明书CN101961015ACN101961016A4/5页60034其中0035白炭黑上海富奇化工有限公司生产0036农乳0203B邢

16、台蓝星助剂厂生产0037木质素磺酸钠上海威呈化工有限公司生产0038轻质碳酸钙上海大宇生化有限公司生产0039产品含15活性化合物TOYOCAMYCIN，加入2的白炭黑作为吸附剂，并加入1的农乳0203B和3的木质素磺酸钠辅料，最后用轻质碳酸钙补足到100，混匀后，经气流粉碎制成可湿性粉剂以下内容中称“产品A”。0040实施例4利用淀粉酶产色链霉菌D发酵代谢产物制备成乳油0041其中0042乙醇上海申兴制药厂生产0043农乳0204邢台蓝星助剂厂生产0044二甲苯上海申兴制药厂生产0045产品2的活性化合物TOYOCAMYCIN，用4的乙醇溶解，加入质量5农乳0204C作为乳化剂，最后用二甲苯

17、补足到100，搅拌混匀制成乳油以下内容中称“产品B”。0046试验例本发明产品与常规农药防治效果对比试验0047将“产品A、B”对黄瓜枯萎病或番茄灰霉病或番茄早疫病等植物病害进行防治试验，以常规化学农药、清水为对照，如表1、表2和表3所示，试制的农用杀菌剂“产品A、B”比常规化学农药防治效果相仿或略优。0048表1产品A对番茄灰霉病防效统计表0049药效试验均于2009年7月9月在杭州市郊试验农田进行00500051表2产品B对黄瓜枯萎病防效统计表0052药效试验均于2009年7月9月在杭州市郊试验农田进行说明书CN101961015ACN101961016A5/5页700530054表3产品B对番茄早疫病防效统计表0055药效试验均于2009年7月9月在杭州市郊试验农田进行0056说明书CN101961015A