双歧杆菌菌株.pdf

1、(10)授权公告号 CN 103037875 B (45)授权公告日 2014.11.05 CN 103037875 B (21)申请号 201080051602.X (22)申请日 2010.11.11 NCIMB 41675 2009.11.05 UCC 35624 1999.01.13 12/616,752 2009.11.11 US 2010/0290 2010.05.11 IE A61K 35/74(2006.01) C12N 1/20(2006.01) (73)专利权人 食物营养健康有限公司 地址 爱尔兰科克 专利权人 爱默思公司 (72)发明人 L奥马奥尼 B凯利 (74)专利代

2、理机构 上海专利商标事务所有限公 司 31100 代理人 陈文青 US 2004/0265279 A1,2004.12.30, 全文 . Imaola Akemi et al.Anti-inflammatory activity of probiotic bifi dobacterium:enhancement of IL-10 production in peripheral blood mononuclear cells from ulcerative colitis patients and inhibition of IL-8 secretion in HT-29 cells.Worl

3、d Journal of Gastroenterology .2008, 第 14 卷 ( 第 16 期 ),2511-2516. Medina M et al.Differential immunomodulatory properties of bifi dobacterium logum strains:relevance to probiotic selection and clinical applications.Clinical and Experimental immunology .2007,第150卷(第3期),531-538. (54) 发明名称 双歧杆菌菌株 (57)

4、摘要 双歧杆菌菌株 AH121A 在口服后具有显著的 免疫调节功能。所述菌株用于免疫调节生物治疗 剂。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2012.05.09 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/IE2010/000067 2010.11.11 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2011/058536 EN 2011.05.19 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 曲凯 权利要求书 1 页 说明书 25 页 序列表 4 页 附图 13 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书25页

5、序列表4页 附图13页 (10)授权公告号 CN 103037875 B CN 103037875 B 1/1 页 2 1. 一种分离的双歧杆菌菌株 (Bifi dobacterium longum)， 其保藏编号为 NCIMB41675。 2. 如权利要求 1 所述的双歧杆菌菌株， 其中所述的双歧杆菌菌株以活体细胞形式存 在。 3. 如权利要求 1 所述的双歧杆菌菌株， 其中所述的双歧杆菌菌株以非活体细胞形式存 在。 4. 如权利要求 1 至 3 中的任一项所述的双歧杆菌菌株， 其中所述双歧杆菌分离自猫科 动物受试者的结肠活组织。 5.如权利要求1至4中的任一项所述的双歧杆菌菌株在制备口服后

6、具有免疫调节功能 的物质中的应用。 6. 一种制剂， 所述制剂包含如权利要求 1 至 5 中的任一项所述的双歧杆菌菌株。 7. 如权利要求 6 所述的制剂， 所述制剂还包含益生菌材料。 8. 如权利要求 6 或 7 中的任一项所述的制剂， 所述制剂还包含益生元材料。 9. 如权利要求 6 或 7 中的任一项所述的制剂， 所述制剂还包含可摄取的载体。 10. 如权利要求 8 所述的制剂， 所述制剂还包含可摄取的载体。 11.如权利要求9或10所述的制剂， 其中所述可摄取的载体是选自胶囊、 片剂或粉末的 药用载体。 12.如权利要求9或10所述的制剂， 其中所述可摄取的载体是选自油悬浮液、 乳基悬

7、浮 液、 乳酪、 可可油基组合物、 肉汁和 / 或酸奶基组合物的食物产品。 13.一种食品， 所述食品包含如权利要求1至4中的任一项所述的双歧杆菌菌株或如权 利要求 6 至 12 中的任一项所述的制剂。 14. 如权利要求 13 所述的食品， 其中所述食品是干食品。 15. 如权利要求 13 所述的食品， 其中所述食品是湿食品。 16. 如权利要求 13 至 15 中的任一项所述的食品， 所述食品还包含益生菌材料。 17. 如权利要求 13 至 15 中的任一项所述的食品， 所述食品还包含益生元材料。 18. 如权利要求 16 所述的食品， 所述食品还包含益生元材料。 19. 如权利要求 13

8、 所述的食品， 其中所述食品是伴侣动物食品。 20. 如权利要求 1 至 4 中的任一项所述的双歧杆菌菌株在制备预防和 / 或治疗选自自 身免疫疾病和炎性失调的疾病的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103037875 B 2 1/25 页 3 双歧杆菌菌株 0001 引言 0002 本发明涉及双歧杆菌菌株及其作为益生菌， 具体地讲作为免疫调节生物治疗剂的 应用。 0003 保护人胃肠道不被肠细菌定植的防御机制是高度复杂的并涉及免疫和非免疫的 方面 (1)。先天的防御机制包括胃的低 pH、 胆汁盐、 蠕动、 粘蛋白层和抗微生物化合物如 溶菌酶 (2)。免疫学机制包括在 M 细胞下面的特

9、定淋巴聚集体， 称为派伊尔氏淋巴集结 (peyers patches)， 其遍布在小肠和结肠 (3)。在这些位置存在的内腔抗原对合适的 T 和 B 细胞亚群产生刺激， 建立细胞因子网络并分泌抗体到胃肠道中 (4)。此外， 可经由上皮细胞 将抗原递呈到上皮内的淋巴细胞和下面的固有层免疫细胞 (5)。因此， 宿主在胃肠道的免 疫防御上投入巨大。 然而， 因为胃肠粘膜是宿主与外部环境相互作用的最大表面， 其中必须 有特定的控制机制以调控对 100 吨食物的免疫应答， 这是胃肠道经平均寿命处理的食物数 量。此外， 超过 500 种菌种定植在肠内， 它们在结肠上的数量为 1011-1012/g。因此，

10、这些控 制机制必须能够分辨非病原的粘附细菌与侵入的病原菌， 所述病原菌将引起对宿主的显著 伤害。事实上， 肠内菌群通过与新摄取的潜在病原微生物竞争， 有助于宿主防御它们。 0004 据信益生菌当衍生自旨在治疗的菌种或密切相关菌种时更加有效。因此， 需要来 源于伴侣动物的益生菌菌株， 所述菌株用于伴侣动物， 它们不同于那些来源于人的菌株。 0005 WO 01/90311 公开了分离自排泄物样品的益生菌微生物， 所述样品得自具有益生 菌活性的猫。 然而， 这些细菌得自排泄物样品， 并且不可能形成存在于胃肠道上部的天然肠 微生物区系的部分。 0006 因此， 需要通过从胃肠道上部存在的天然肠微生物

11、区系中分离细菌菌株来提供可 获得的菌株， 所述菌株尤其适用于猫， 并且选择它们的益生菌特性和经加工后存活的能力， 以及将这些菌株掺入适用的组合物。 0007 发明声明 0008 根据本发明， 提供了分离的双歧杆菌菌株 NCIMB 41675。 0009 双歧杆菌菌株可为活体细胞形式， 双歧杆菌菌株可为非活体细胞形式。 0010 双歧杆菌可分离自猫科动物受试者的结肠活组织。 0011 双歧杆菌菌株在口服后可具有显著的免疫调节功能。 0012 如本文所述， 本发明也提供包含双歧杆菌菌株的制剂。 0013 所述制剂还可包含益生菌材料。所述制剂还可包含益生元材料。所述制剂还可包 含可摄取的载体。可摄取

12、的载体可为药用载体如胶囊、 片剂或粉末。可摄取的载体可为食 物产品如油悬浮液、 乳基悬浮液、 乳酪、 可可油基组合物、 肉汁和 / 或酸奶基组合物。 0014 本发明还提供包含双歧杆菌菌株或如本文所述制剂的食品。 0015 所述食品可为干食品。所述食品可为湿食品。所述食品还可包含益生菌材料。所 述食品还可包含益生元材料。所述食品可为伴侣动物食品。 0016 本发明还提供如本文所述用作药物的双歧杆菌菌株或制剂或食品。 0017 本发明还提供如本文所述用于预防和 / 或治疗不良炎活性的双歧杆菌菌株或制 说 明 书 CN 103037875 B 3 2/25 页 4 剂或食品。 0018 本发明还提

13、供如本文所述用于预防和 / 或治疗不良胃肠炎活性的双歧杆菌菌株 或制剂或食品。 0019 本发明还提供如本文所述用于预防和 / 或治疗由于不良炎活性引起的自身免疫 失调的双歧杆菌菌株或制剂或食品。 0020 本发明还提供如本文所述用于预防和 / 或治疗由于不良炎活性引起的腹泻疾病 的双歧杆菌菌株或制剂或食品。 0021 本发明还提供如本文所述用于调节或改善伴侣动物免疫系统的双歧杆菌菌株或 制剂或食品。 0022 本发明还提供如本文所述用于预防和 / 或治疗伴侣动物自身免疫疾病的双歧杆 菌菌株或制剂或食品。 0023 本发明还提供如本文所述用于预防和 / 或治疗伴侣动物炎症的双歧杆菌菌株或 制剂

14、或食品。 0024 我们描述了双歧杆菌菌株 AH121A(NCIMB 41675) 或其突变体或其变体。 0025 所述菌株可通过从切除并洗涤的猫科动物胃肠道分离获得。 0026 所述突变体可为经基因修饰的突变体。所述变体可为天然存在的双歧杆菌变体。 0027 所述菌株可为益生菌。它可为生物学纯培养物形式。 0028 我们也描述了分离的双歧杆菌菌株 NCIMB 41675。 0029 双歧杆菌菌株可为活体细胞形式。作为另外一种选择， 双歧杆菌菌株可为非活体 细胞形式。 0030 益生菌的一般使用形式可为活体细胞。然而， 也可将它扩展到非活体细胞例如 杀灭过的培养物或益生菌表达的包含有益因子的组

15、合物。这可包括热灭活的微生物， 或 者通过暴露于改变的 pH 或经过加压灭活的微生物。因为非活体细胞产物制剂可较简单， 可将细胞容易地掺入药物且贮藏要求与活体细胞相比受的限制要少得多。干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)YIT 9018提供25个加热灭活细胞的有效利用样品， 这作为治疗和/ 或防止肿瘤生长的方法在美国专利 US4347240 中进行了描述。 0031 我们也描述了利用通过从切除并洗涤的猫科动物胃肠道中分离的可获得细菌保 持并改善伴侣动物健康状态的方法和包含乳酸菌的组合物。 0032 我们描述了包含如本文所述的双歧杆菌菌株的制剂， 该制剂可包括另一种益生菌 材料

16、， 该制剂可包括益生元材料。 0033 双歧杆菌是共生微生物。它们已经从人胃肠道内的微生物区系中分离出来。因为 引起的炎活性也将破坏宿主细胞和组织功能， 所以胃肠道内的免疫系统不可能对这种区系 有显著的反应。因此， 存在一些机制， 从而免疫系统能够识别共生的非病原胃肠微生物区 系， 它们与病原生物不同。这确保对宿主组织的伤害受到限制并且仍旧保持防御屏障。 0034 在整个说明书中术语突变体、 变体和经基因修饰的突变体包括双歧杆菌菌 株， 其基因特性和 / 或表型特性与亲本菌株相比发生改变。天然存在的长双歧杆菌 (Bifi dobacterium longum)变体包括选择性分离的靶向特性的自发

17、改变。 通过常规(体外) 基因操纵技术如基因分裂、 接合转移等完成亲本菌株特性的有意改变。基因修饰包括将外 来和/或内源DNA序列导入双歧杆菌菌株基因组， 例如通过载体插入细菌菌株基因组， 所述 说 明 书 CN 103037875 B 4 3/25 页 5 载体包括质粒 DNA 或噬菌体。 0035 天然或诱导的突变包括至少单个碱基的改变例如缺失、 插入、 颠换或可引起所述 DNA 序列编码的氨基酸序列改变的其他 DNA 修饰。 0036 术语突变体、 变体和经基因修饰的突变体也包括已经发生基因改变的双歧杆菌菌 株， 所述基因改变在基因组中积聚的速率与所有微生物的 30 天然一致， 和 /

18、或通过自发突 变和 / 或基因获取和 / 或基因丢失发生的基因改变， 其不是通过有意 ( 体外 ) 操纵基因组 完成， 而是通过变体和 / 或突变体的天然选择完成， 所述天然选择提供当暴露于环境压力 如抗生素时在保持细菌存活率方面的选择性优势。可通过有意地 ( 体外 ) 将特定基因插入 到基因组中制备突变体， 其不会根本改变生物体的生物化学功能， 但是其产物可用于细菌 的鉴定或选择， 例如抗生素抗性。 0037 本领域的技术人员将认识到双歧杆菌菌株的突变体或变体能够通过与亲本菌株 的 DNA 序列同源性分析进行鉴定。双歧杆菌菌株具有与亲本菌株相近的序列同一性， 认为 它们是突变体或变体菌株。可

19、认为与亲本 DNA 序列具有 96或更高的序列同一性 ( 同源 性)， 例如97或更高， 或98或更高， 或99或更高的序列同一性的双歧杆菌菌株是突变 体或变体。序列同源性可使用在线同源性算法 “BLAST” 程序进行测定， 其在 http:/www. ncbi.nlm.nih， gov/BLAST/ 上公开可用。 0038 亲本菌株的突变体也包括衍生的双歧杆菌菌株， 其具有与亲本菌株的 16s-23s 基 因间隔区多核苷酸序列至少 85的序列同源性， 例如至少 90的序列同源性， 或至少 95 的序列同源性。这些突变体还可包含在细菌基因组的其他 DNA 序列中的 DNA 突变。 0039 附

20、图简述 0040 由以下描述将会更清楚地理解本发明， 其仅以举例的方式提供其中的参考附图 ； 0041 图 1 是长双歧杆菌 (B.longum)AH121A 在刚果红琼脂平板上生长的照片 ； 0042 图 2 是 示 出 受 刺 激 的 PBMC 与 长 双 歧 杆 菌 菌 株 121A( 双 歧 杆 菌 121A) 的 IL-10 IL-12p70 比率的柱形图 ； 0043 图 3 是示出菌株 121A 在低 pH 环境中的存活率的曲线图。菌株在 pH2.5 挑战 6 小 时， 并且使用平板计数评估它们的存活率 ； 0044 图 4 至 6 是从体外培养的外周血单核细胞 (PBMC) 中

21、分泌的细胞因子的曲线图 ； 0045 图 7A 至 E 是在用浓度增加的 121A 和 Bif 35624 体外刺激后 PBMC 中的 IL-10 诱导 特征曲线图 ； 0046 图 8A 至 D 是在用浓度增加的 121A 和 Bif 35624 体外刺激后 PBMC 中的 IL- 诱导 特征曲线图 ； 0047 图 9A 至 D 是在用浓度增加的 121A 和 Bif 35624 体外刺激后 PBMC 中的 IL-6 诱导 特征曲线图 ； 0048 图 10A 至 D 是在用浓度增加的 121A 和 Bif.35624 体外刺激后 PBMC 中的 IL-8 诱 导特征曲线图 ； 0049

22、图 11A 至 D 是在用浓度增加的 121A 和 Bif.35624 体外刺激后 PBMC 中的 IL-12p70 诱导特征曲线图 ； 0050 图 12A 至 E 是在用浓度增加的 121A 和 Bif.35624 体外刺激后 PMBC 中的 TNF- 诱导特征曲线图 ； 说 明 书 CN 103037875 B 5 4/25 页 6 0051 图 13A 至 C 是在用浓度增加的 121A 和 Bif.35624 体外刺激后 PMBC 中的 IFN- 诱导特征曲线图 ； 0052 图 14A 至 D 是在用浓度增加的 121A 和 Bif.35624 体外刺激后 PBMC 中的 G-CS

23、F 诱 导特征曲线图 ； 0053 图 15 是示出 121A 对人髓样树突状细胞分泌 IL-10 和 IL-12p70 的效应的柱状图 ； 并且 0054 图 16 是示出 121A 对人天然 CD4+T 细胞效应的柱状图。 0055 发明详述 0056 将长双歧杆菌菌株 AH121A 于 2009 年 11 月 5 日保存在 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)FergusonBuilding， Craibstone Estate， Bucksburn， Aberdeen， AB219Y

24、A， Scotland， UK， 并且授予编号 NCIMB 41675。 0057 将长双歧杆菌菌株 UCC 35624 于 1999 年 1 月 13 日保存在 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)Ferguson Building， Craibstone Estate， Bucksburn， Aberdeen， AB219YA， Scotland， UK， 并且授予编号 NCIMB 41003。 0058 长双歧杆菌可为经基因修饰的突变体或它可为其天然存在的变体。 0059 优选地， 长双

25、歧杆菌是活体细胞的形式。 0060 作为另外一种选择， 长双歧杆菌可为非活体细胞形式。 0061 本文所用，“伴侣动物” 是指家畜。优选地，“伴侣动物” 指家养猫科动物 ( 猫 )、 犬 科动物 ( 狗 )、 兔子、 雪貂、 马、 奶牛等。更优选地，“伴侣动物” 指家养猫科动物。 0062 乳酸双歧杆菌 (Lactic Acid Bifi dobacteria) 菌株 0063 本发明的第一方面包括双歧杆菌属乳酸菌菌株， 其可通过从切除并洗涤的猫科动 物胃肠道中分离获得， 该胃肠道在动物中具有益生菌活性。益生菌是或活体或死亡的微生 物、 微生物的加工组合物、 它们的组分如蛋白或碳水化合物、 或

26、对宿主有有益影响的细菌发 酵产物的纯化组分。益生菌的一般使用形式为活体细胞。然而， 可将它扩展到非活体细胞 例如杀灭过的培养物或益生菌表达的包含有益因子的组合物。这可包括热灭活的微生物， 或者通过暴露于改变的 pH 或经过加压灭活的微生物。就本发明目的而言， 除非另外指明， “益生菌” 还旨在包括本发明微生物在发酵期间生成的代谢产物。可将这些代谢物释放到发 酵培养基中， 或可将它们储存在微生物中。如本文所用，“益生菌” 还包括细菌、 细菌匀浆、 细 菌蛋白、 细菌提取物、 细菌发酵悬浮液、 以及它们的混合物， 它们当以治疗剂量提供时对宿 主动物行使有益功能。 0064 已发现， 可通过从哺乳动

27、物切除并洗涤的胃肠道中直接分离获得的双歧杆菌属乳 酸菌在喂食活体细菌细胞后粘附到胃肠道上， 并且当以活体、 非活体或破碎形式喂食给动 物时也具有显著的免疫调节功能。不受理论的约束， 据信双歧杆菌可通过从切除并洗涤的 胃肠道中分离获得， 所述胃肠道与肠粘膜组织紧密缔合。 不受理论的约束， 据信这导致本发 明的益生菌双歧杆菌产生选择性的宿主反应， 此反应导致它的益生行为。 已经发现， 分离自 切除并洗涤的胃肠道的益生菌通过直接作用于粘膜上皮和宿主的免疫细胞能调节宿主的 免疫系统。 这种免疫调节， 与益生菌传统的作用机制相结合， 例如通过闭合和竞争营养物质 阻止病原菌粘附在肠上， 致使本发明的双歧杆

28、菌作为益生菌生物体是高度有效的。 0065 分离自切除并洗涤的猫科动物胃肠道的本发明双歧杆菌具有对许多病原菌菌株 说 明 书 CN 103037875 B 6 5/25 页 7 / 菌种的体外抗菌活性。不受理论的约束， 据信这种体外抗微生物活性是动物体内的潜 在益生菌活性的指示， 所述动物优选地是伴侣动物如猫科动物。本发明的乳酸菌优选地 具有体外抗微生物活性， 其对鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)、 单核细胞增多 性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)， 无害李斯特菌 (Listeria innocua) 或大肠杆菌 (Eschericia

29、 coli)， 更优选这些菌株的混合物， 更优选所有这些菌株具有抗性。 0066 不受理论的约束， 据信本发明乳酸菌的抗微生物活性可为本文乳酸菌的许多不同 作用的结果。 本领域以前提出分离自排泄物样品的几种细菌菌株通过闭合作用阻止病原生 物体附着在肠上， 从而在口服后发挥其在胃肠道中的益生菌功效。 为了能在肠中建立菌群， 这需要口服 “活的” 或活体细菌细胞。然而， 据信本发明的由切除并洗涤的猫科动物胃肠道 分离获得的双歧杆菌， 如提供其活体形式的话同时由于闭合作用发挥一些益生菌功效， 可 以活体或非活体的形式递送基本的益生菌功效， 这是由于其在体外发酵过程中产生一种或 多种能抑制病原微生物生

30、长或杀死病原微生物和 / 或改变宿主动物的免疫能力的物质。此 益生菌活性的形式是人们所期望的， 因为本发明的细菌能以活性或非活性培养基或者纯化 发酵产物的形式提供， 这些形式仍递送有益治疗效果给宿主动物。 0067 优选地， 本发明的乳酸菌在通过胃肠道后能够保持存活。为了能口服细菌的活性 培养基和细菌在通过食管与胃后能寄居在肠内， 这是人们所期望的。为了长期递送益生菌 有益效果给宿主， 期望本发明的乳酸菌能寄居在肠内。非活体细胞或其纯化分离物的口服 剂量诱导出暂时的有益效果， 但是因为细菌不是活体， 它们不能够生长并持续地原位递送 益生菌效应。 因此这可能需要宿主定期给药以保持健康状态有益效果

31、。 反之， 活体细胞能以 活体形式通过胃， 随后附着在肠粘膜上增生扩散， 从而能就地持续递送益生菌效果。因此， 本发明的乳酸菌优选在悬浮于 pH2.5 的介质中 1 小时后仍保持存活。如本文所用，“保持存 活” 指至少 25的最初悬浮于测试介质的细菌当使用本领域的技术人员已知的平板计数法 计数时是活体。优选地，“保持存活” 指至少 50的最初悬浮的细菌是活体。本发明的乳酸 菌期望在暴露于低 pH 环境后保持存活， 这种低 pH 环境模拟动物口服后暴露于胃和小肠上 部的胃液中的体内环境。 0068 通过从切除并洗涤的猫科动物胃肠道中分离得到的双歧杆菌属乳酸菌菌株可用 于在由动物， 优选伴侣动物或

32、人口服后递送益生菌有益效果。此益生菌有益效果通常保持 并改善动物的总体健康状态。有益于或者治疗学上减轻以下疾病症状或者通过预防防止 以下疾病的动物健康状态和生理的非限制性要素包括炎性失调、 免疫缺陷、 炎性肠疾病、 过 敏性肠综合症、 癌症 ( 尤其是那些胃肠和免疫系统癌症 )、 腹泻疾病、 抗生素相关的腹泻、 阑 尾炎、 自身免疫失调、 多发性硬化症、 阿兹海默病、 淀粉样变性病、 类风湿性关节炎、 关节炎、 关节运动性、 糖尿病、 胰岛素抗性、 细菌感染、 病毒感染、 真菌感染、 牙周病、 泌尿生殖器疾 病、 外科手术相关的创伤、 外科手术诱导的转移性疾病、 败血病、 重量损失、 重量增加

33、、 过多 脂肪组织积聚、 厌食症、 发烧控制、 恶病质、 伤口痊愈、 溃疡、 肠屏障感染、 过敏、 哮喘、 呼吸失 调、 循环障碍、 冠心病、 贫血、 凝血系统失调、 肾病、 中枢神经系统失调、 肝病、 局部缺血、 营养 失调、 骨质疏松、 内分泌失调和表皮失调， 优选地是治疗胃肠道， 包括治疗或预防腹泻 ； 免疫 系统调节， 优选地治疗或预防自身免疫疾病和炎症 ； 保持或改善皮肤和 / 或毛皮系统的健 康状态， 优选地治疗或预防皮肤特应性疾病 ； 改善或减轻衰老效应， 包括精神意识和活性水 平 ； 预防与下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴相关的失调， 以及改善关节健康状态从而改善运动性。 说 明

34、 书 CN 103037875 B 7 6/25 页 8 0069 上文公开的失调治疗可使用本领域的技术人员已知的技术进行测量。 例如包括自 身免疫疾病和炎症的炎性失调可使用体内免疫功能测试进行检测和监控， 例如淋巴细胞母 细胞化、 自然杀伤细胞活性、 疫苗抗体反应、 迟发型超敏反应、 以及它们的混合物。 本文简要 描述了这些方法， 但这是本领域的技术人员所熟知的。 0070 1. 淋巴细胞转化 ： 此检测分析法测量分离自测试和对照动物新鲜全血的淋巴细 胞对不同分裂素的体外增殖反应， 是对全体 T- 和 B- 细胞功能的测量方法。简而言之， 通 过本领域的技术人员已知的 Ficoll-Hypa

35、que 密度离心法从全血中分离外周血单核细胞 (PBMC)。 分离的PBMC在补充加入HEPES、 L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI1640细胞介 质中洗涤两次。 洗涤后的细胞被重悬浮在RPMI1640中， 计数， 将细胞密度进行适当调整。 三 等分试样的2105个细胞在被暴露于一定浓度范围(0.1g/mL至100g/mL)的不同分裂 素下， 一些实例包括美洲商陆分裂素 (Gibco)、 植物血凝素 (Gibco) 和伴刀豆素 A(Sigma)， 在 37下和 5的 CO2以及 10的胎牛血清 (Sigma) 中， 培养 72 小时。在 54 小时细胞用 1Ci H- 胸腺嘧啶核苷进行冲

36、击， 72 小时在 TopCount NXT 上读出细胞收获量。 0071 2. 自然杀伤细胞活性 ： 如美国专利 6,310,090 所述， 此检测分析法测量分离自测 试和对照动物新鲜全血的自然杀伤细胞的体外效应活性。 自然杀伤细胞是哺乳动物天然免 疫功能的组分。猫科动物甲状腺癌细胞在评估 NK 细胞毒性活性时被用作靶细胞。此细胞 系以前显示易于被猫科动物 NK 细胞杀伤。靶细胞在 T75 烧瓶中培养， 烧瓶中有 20niL 的 最小必需培养基 (MEM ； Sigma Chem.Co.， St.Louis， Mo.)， 其中补充有 10胎牛血清 (FCS)， 100U/mL 青霉素和 10

37、0g/mL 链霉素。当细胞铺满时， 靶细胞被胰蛋白酶处理， 洗涤 3 次， 以 5105个细胞 /mL 再悬浮于完全培养基 (RPMI-1640+10 FCS+100U/mL 的青霉素 +100 的 10g/mL 的链霉素 ) 中。将三等份靶细胞的 100L 等分试样吸到 96 孔 U 形底平板 (Costar， Cambridge， Mass.) 中并孵育 8 小时以使细胞附着。然后将通过 Ficoll-Hypaque 分离法分离淋巴细胞 ( 效应细胞 ； 100L)( 如上所述 ) 加入靶细胞以提供 10 1 的效应 / 靶细胞 (E T) 比率。在 37下孵育 10 小时后， 加入 20

38、L 包含 5.g 的 3-(4， 5- 二甲 基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基溴化四唑 (MTT) 的底物。将混合物在 37下孵育 4 小时， 然后 吸除未代谢的 MTT。加入 200L 的 95乙醇溶解甲复晶体。使用微板读数计在 570nm 测 量光密度。如下计算 NK 细胞特异性溶解百分比 ： 特异性细胞毒性 ( ) 1001-( 靶 细胞和效应细胞的 OD- 效应细胞的 OD)/( 靶细胞的 OD)。 0072 3. 疫苗抗体反应 ： 在至少 12 周的益生菌或对照物喂食后， 给予测试受试者一系 列 ( 至多 5) 疫苗。疫苗可以是新型疫苗和多余疫苗的混合物。可使用的疫苗组的非

39、限制 性实例包括 Fort Dodge Animal Health 制备的疫苗混合物。本文适用的疫苗的非限制性实 例包括猫热病疫苗、 腺病毒疫苗、 冠状病毒疫苗、 副流感病毒疫苗和细小病毒疫苗。受试者 的疫苗史将决定使用的疫苗。给定疫苗的特异性抗体在血液中测量 3 周， 比较对照组和益 生菌喂食组反应的长度和强度。4. 迟发型超敏反应 ： 体外评估免疫系统状态的非侵入性方 法。此测试包括皮内注射多克隆有丝分裂原植物血凝素 (PHA) 和绵羊红细胞多价疫苗、 组 胺 (100L 的 0.0275g/L 的磷酸组胺 ； Greer， Lenoir， NC) 或 PBS(100L 的磷酸盐缓冲液，

40、8.5g/L ； Sigma)。 对抗原的免疫反应被记录为皮肤褶厚度， 使用测径器在注射后0、 24、 48和 72 小时进行测量。皮肤褶厚度的增加指示更强的超敏反应， 它使用本发明的细菌进行治疗 后将会降低。 说 明 书 CN 103037875 B 8 7/25 页 9 0073 测定本发明双歧杆菌效应的其他方法在US6,133,323和US6,310,090中进行了描 述。 0074 此外， 衰老改善功效可以使用双X-线吸收仪或CT扫描进行测定， 这些仪器用于测 量机体组合物， 包括机体脂肪量、 非脂肪量和骨矿物含量。同样的， 此方法可用于测量解剖 学改变如受试者感染后的体重丧失或骨密度

41、下降。 0075 本发明的双歧杆菌也可用于减轻伴侣动物压力水平的方法。血液压力激素包括 肾上腺素、 去甲肾上腺素、 多巴胺、 皮质醇、 C- 反应蛋白和其他急性时相蛋白， 可测量这些激 素以测定压力水平和其减轻或保持。这些激素被认为是压力的生物标记， 使用本领域的技 术人员已知的技术可以被容易的测量。此外， 可通过 CT 成像直接测量肾上腺大小作为下丘 脑 - 垂体 - 肾上腺轴活性的体内标记。 0076 此外， 对伴侣动物皮肤和 / 或毛皮系统健康状态的保持或改善包括治疗皮肤特应 性疾病， 这可通过由两个经过培训的人员进行的皮肤和毛皮评估进行测量。在此类评估期 间的检查标准实例包括 ： a)

42、 脱落指数 ： 通过收集每个测试受试者在标准梳理期间产生的毛 发给予其脱落指数。保留毛发并称重， 并且比较对照受试者和测试受试者。b) 皮肤 / 毛皮 主观评估 ： 由经培训的专门小组成员主观评估皮肤和毛皮情况， 这通过评估脱落、 皮屑、 光 亮性、 均匀度、 柔软性和密度来进行。c) 皮肤功能评估 ： 可通过用丙酮浸泡过的纱布擦拭皮 肤表面来评估皮肤的屏障功能。 此技术通过移除单细胞层和相连的角质层类脂部分有效地 破坏了皮肤屏障。使用本领域的技术人员已知的方法， 通过测量经表皮失水 (TEWL) 的增加 情况和侵害位点的变红程度， 可对屏障破坏进行量化。使用前述照相机和照明系统获得变 红 (

43、 红斑 ) 计分。在皮肤破坏前和破坏后立即获取 TEWL 读数和变红计分， 并且在五小时和 24- 小时的端点时也获取这些数据以评估皮肤的保护性能和愈合性能。 0077 此外， 伴侣动物的胃肠道感染治疗可包括改善伴侣动物的微生物生态。改善伴侣 动物的微生物生态优选地包括降低伴侣动物粪便中的病原菌水平。 伴侣动物粪便中存在的 病原菌含量可使用本领域的技术人员已知的标准平板计数法进行计数。更优选地， 病原菌 选自由下列组成的组 ： 梭状芽孢杆菌、 大肠杆菌、 沙门氏菌、 拟杆菌以及它们的混合物。 合适 的病原菌菌株的非限制性实例包括产气荚膜梭菌、 难辨梭状芽孢杆菌、 大肠杆菌、 鼠伤寒沙 门氏菌以

44、及它们的混合物。 0078 本发明的细菌的使用方法也可包括治疗， 或预防或治疗哺乳动物 ( 优选伴侣动 物 ) 的尿道。尿道治疗的非限制性实例包括治疗或预防尿道感染、 治疗或预防肾病包括尿 道结石、 治疗或预防膀胱感染等。 不受理论的约束， 据信本发明的双歧杆菌用于预防这些疾 病是因为它们能够降解草酸， 这点在体外得到展示。 草酸是尿代谢的副产物， 它能够形成不 溶解的沉淀， 导致肾、 膀胱和其他尿道感染。通过降解草酸， 并因此潜在的预防其沉淀和在 尿道中累积， 本发明的细菌可治疗并预防尿道感染和其它疾病。草酸降解可在体外使用草 酸测试试剂盒 cat#755699 进行测量， 所述试剂盒可从

45、Boehringer Mannheirn/R-Biopharm 商购获得。 0079 本发明的双歧杆菌可用于改善或保持伴侣动物健康状态的方法， 包括改善纤维消 化。 改善纤维消化是值得期待的， 因为它促进所述益生菌以及有益内源菌群的生长， 这有助 于抑制一些潜在的病原菌。此外， 文献已经证明了人体内由结肠发酵产生的毒性代谢物和 有害酶的量的减少 (6)。可使用 Vickers 等人描述的方法测定纤维消化 (7)， 不同的是使用 说 明 书 CN 103037875 B 9 8/25 页 10 稀释的排泄物样品而不是接种， 每次实验使用受关注的细菌菌株的纯培养物。 0080 通过减少粪便和尿液中

46、引起气味的化合物的产量， 本发明的猫科动物益生菌可用 于减少粪便和尿液的气味并且附带地减少猫砂盆中的气味。 产生气味的化合物的非限制性 实例包括氨、 吲哚、 酚、 胺、 支链脂肪酸和挥发性的含硫化合物。不受理论的束缚， 据信降低 伴侣动物粪便和尿液中的这些化合物的水平减少了与粪便和尿液相关联的气味。此外， 就 使用猫砂盆的伴侣动物而言， 同时减少了猫砂盆的气味。 0081 本发明的乳酸菌的使用方法典型地涉及动物口服。口服可作为正常饮食摄取的 一部分， 或作为它的补充。口服典型地至少一月一次， 优选至少每周一次， 更优选至少每天 一次。可提供治疗有效量的本发明乳酸菌给伴侣动物以保持或改善动物，

47、优选伴侣动物的 健康状态。如本文所用术语关于乳酸菌的 “治疗有效量” 是指足以向需 30 次治疗的宿主动 物提供所需功效或有益效果的细菌的量， 但所述量又足够低， 以避免不利影响如毒性、 发炎 或变应性反应， 相当于以本发明的方法使用时提供合理的效 / 险比。具体的 “治疗有效量” 将根据例如治疗的具体症状、 使用者的身体状况、 治疗持续时间、 协同治疗的性能 ( 如果存 在 )、 欲使用的具体剂型、 使用的载体、 剂型的溶解度和具体的剂量疗程这些因素的不同而 异。 0082 优选地， 提供给伴侣动物的乳酸菌剂量为每天 1.0E+04 至 1.0E+14 的 CFU， 更优 选每天 1.0E+

48、06 至 1.0E+12 的 CFU。所述组合物优选地可包含至少 0.001的 1.0E+04 至 1.0E+12 的 CFU/g 的双歧杆菌属乳酸菌， 所述乳酸菌可通过从切除并洗涤的猫科动物胃肠 道中分离得到。 乳酸菌提供给动物的形式可以是活体形式， 或者灭活细胞的形式， 或者馏出 液的形式， 或本发明乳酸菌的发酵产物的分离物或其它片段的形式， 或它们的任何混合物。 0083 优选地， 乳酸菌或其纯化或分离部分用于制备旨在保持或改善动物健康状态的组 合物。如上文所述， 所述组合物可作为正常饮食摄取的部分， 或作为补充。在所述组合物包 含部分正常膳食摄取的情况下， 该组合物可为以下形式 ： 干

49、动物食物如饼干或粗磨食物、 加 工谷物饲料、 湿动物食物、 酸奶、 肉汁、 咀嚼物、 犒赏食物等。 0084 这些组合物可包含更多的组分。 其它组分对本文使用的组合物中的内含物是有益 的， 但是对于本发明而言是任选的。例如， 食物组合物优选地是营养平衡的。在一个实施方 案中， 所述组分基于干燥物质可包含按所述食物组合物重量计约 20至约 50的粗蛋白， 优选约 22至约 40的粗蛋白。粗蛋白物质可包括任何具有按重量计至少约 15蛋白含 量的物质， 其非限制性实例包括植物蛋白如大豆、 棉籽和花生， 动物蛋白如酪蛋白、 白蛋白 和肉类组织。 可用于本发明的肉类组织的非限制性实例包括新鲜肉类以及干的或精炼肉类 例如鱼粉、 禽肉粉、 肉粉、 骨粉等。 其它适用的粗蛋白源包括小麦面筋或玉米面筋， 以及提取 自微生物来源如酵母的蛋白质。 00