用于大流行流感的疫苗.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102946900 A (43)申请公布日 2013.02.27 CN 102946900 A *CN102946900A* (21)申请号 201180023281.7 (22)申请日 2011.03.10 61/313,101 2010.03.11 US A61K 39/145(2006.01) A61K 39/39(2006.01) (71)申请人 免疫设计公司 地址 美国华盛顿州 (72)发明人 克里斯多福H克雷格 史提芬G里德 尼尔凡霍芬 (74)专利代理机构 北京银龙知识产权代理有限 公司 11243 代理人 钟晶 於毓桢 (54) 发明名称 用于大流行流

2、感的疫苗 (57) 摘要 药物和疫苗组合物包含来自大流行前或大流 行性流感病毒的重组血凝素和含有 GLA 的佐剂。 特别相关的大流行前流感病毒为 H5N1。还提供了 使用组合物的试剂盒和方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.11.09 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2011/027993 2011.03.10 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/112871 EN 2011.09.15 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 23 页 附图 12 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页

3、 说明书 23 页 附图 12 页 1/1 页 2 1. 一种药物组合物， 其包含 ： (a) 来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素 (rHA) 和 (b) 佐剂， 其中所述佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原 端和非还原端的二糖， 其中所述非还原端的 1 位上的碳通过醚 (-O-) 或氨基 (-NH-) 基团连 接于所述还原端的 6 位上的碳， 所述二糖通过非还原端的 4 碳键合于磷酸基团以及通过 酰胺 (-NH-C(O)-) 和 / 或酯 (-O-C(O)-) 键键合于多个脂质基团， 其中所述酯或酰胺键的羰 基 (-C(O)-) 基团直接连接于所述脂质基团， 并且

4、每一个脂质基团包含至少 8 个碳， 所述组合物用于通过单次注射药物组合物来免疫有此需要的受试者以抗大流行前或 大流行性流感病毒的方法。 2. 权利要求 1 所述的用于免疫群体以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物 组合物， 其中所述组合物的施用在单次注射后在至少 50% 的群体中实现血清转换。 3. 前述权利要求中任一项所述的其用于免疫群体以抗大流行前或大流行性流感病毒 的方法的药物组合物， 其中所述组合物不包含乳剂。 4. 前述权利要求中任一项所述的用于免疫群体以抗大流行前或大流行性流感病毒的 方法的药物组合物， 其中所述组合物不包含油。 5. 前述权利要求中任一项所述的用于免疫群体以抗

5、大流行前或大流行性流感病毒的 方法的药物组合物， 其中所述佐剂为 GLA。 6. 一种用于免疫有此需要的受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物 组合物， 所述组合物包含 ： (a) 来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素 (rHA) 和 (b) 佐剂， 其中所述佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原 端和非还原端的二糖， 其中所述非还原端的 1 位上的碳通过醚 (-O-) 或氨基 (-NH-) 基团 连接于所述还原端的 6 位上的碳， 二糖通过非还原端的 4 碳键合于磷酸基团以及通过 酰胺 (-NH-C(O)-) 和 / 或酯 (-O-C(O)-) 键键合于多个

6、脂质基团， 其中酯或酰胺键的羰基 (-C(O)-) 基团直接连接于所述脂质基团， 并且每一个脂质基团包含至少 8 个碳以及其中所 述组合物是节省剂量的。 7. 权利要求 6 所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药 物组合物， 其中所述 rHA 以节省剂量的量存在。 8. 权利要求 6 所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药 物组合物， 其中所诉 rHA 以在所述佐剂不存在的情况下不提供保护性免疫的浓度存在。 9.权利要求6至8中任一项所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒 的方法的药物组合物， 其中所述组合物包含单个重组蛋白。 10. 权

7、利要求 6 所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药 物组合物， 其中每剂量 rHA 的量在约 15g 至约 1g 的范围内。 11. 权利要求 6 所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药 物组合物， 其中所述佐剂为 GLA 并且 rH5 来自 H5N1 流感病毒的致病株。 权 利 要 求 书 CN 102946900 A 2 1/23 页 3 用于大流行流感的疫苗 0001 关于联邦资助的研究的声明 0002 本发明是在由国家过敏症和传染病研究所授予的 5R43AI081383-02 下利用政府 资助进行的。政府可具有本发明的某些权利。 技术领域 0

8、003 本专利申请总体上涉及用作大流行前或大流行流感例如禽流感 ( 例如， H5N1)、 猪 流感 ( 例如， H1N1)、 H7N7 和 H9N2 的疫苗的组合物。组合物通常包含来自候选流感病毒的 重组血凝素和佐剂。 背景技术 0004 大流行是当新疾病出现时保留下来， 感染人 ( 从而引起严重疾病 ) 并且迅速地在 人之间传播的传染病的全球性大流行。当流感病毒的新株系或亚型从另一种动物物种 ( 例 如鸟类或猪 ) 传播至缺乏因先前暴露于相关病毒而产生的免疫的人群中时， 流感大流行可 发生。流感大流行早在 16 世纪后期已有记载并且自那以来定期发生， 最近的有 1957 的 “亚 洲型流感”

9、 (H2N2)、 1968 的 “香港流感” (H3N2) 和 2009 年的 “猪流感” (H1N1)。20 世纪 90 年代出现的 H5N1“亚洲型流感” 已感染了人但到目前为止因无效的人与人之间的传播而还 未引起大流行。随着全球旅游和城市化增加， 预计由新型病毒引起的流感流行的传播可极 快地变成大流行 (WHO，“大流行防备” )。 0005 禽流感由包含分段的 RNA 基因组的正粘病毒引起。感染通过病毒血凝素 (HA) 蛋 白与宿主细胞上的唾液酸连接的糖蛋白的结合起始。 可基于抗原性和序列特征将血凝素蛋 白分成16个亚型。 除了HA外， 流感病毒还包含另外的表面蛋白神经氨酸酶(NA)，

10、 其参与病 毒在感染后从细胞的释放。神经氨酸酶蛋白目前被分成 9 个亚型。16 个 HA 与 9 个 NA 亚型 的所有可能的组合据认为存在于自然界中， 其中野生禽类 ( 例如鸭 ) 用作无症状病毒贮主 (asymptomatic virus reservoir)。 偶尔地， 流感病毒从野生禽类传播至家禽中， 其中已描 述了疾病的两种形式。一种形式为常见但轻度的， 另一种形式为罕见但高度致命的。禽类 的高致病性禽流感病毒 (HPAI) 感染通常由 H5 和 H7 亚型引起。HPAI 病毒的 HA 蛋白与其它 不太致病的 H5 和 H7 亚型 HA 蛋白区别在于 HA 切割位点中的一组碱性氨基酸

11、。 0006 禽类被某些 HPAI 病毒的持续感染以及禽类与人的相对亲近度已导致 4 个禽流感 亚型(H5N1、 H7N3、 H7N7和H9N2)至人的传播。 H7或H9亚型病毒对人的感染通常导致轻度的 非致命性疾病。相反地， H5 亚型病毒对人的感染导致严重的通常致命的疾病 ( “Cumulative number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1)Reported to WHO,2010 年 2 月 17 日 ,www.who.int)。 0007 H5N1 病毒对人的持续感染加上病毒在野生禽类和家禽中的地理扩张已导致

12、H5N1 病毒的遗传进化， 现可将所述遗传进化在遗传上和抗原性分类至不同的进化枝和子分 枝 (subclade)( 世界卫生组织全球流感监测网络程序 (WHO Global Influenza Program Surveillance Network),Emerging Infectious Dis11:1515-1521,2005)。如果这类新型 说 明 书 CN 102946900 A 3 2/23 页 4 病毒的任一种获得迅速地在人之间传播的能力， 则 H5N1 流感大流行的可能性较高。鉴于与 H5N1 感染相关的高死亡率， 与这样的大流行相关的潜在全球性影响可以是相当严重的。因 此，

13、WHO 已起始了大流行警告的程序。 0008 抗击破流感大流行的疫苗的开发是 WHO 和许多政府进行流感大流行防备的基石。 需要大量安全有效剂量的大流行疫苗来满足美国和世界其它地方的潜在需要。抗当前循 环大流行前株的疫苗的贮存是目前大流性预防策略的关键组成部分。预期可能将与新出 现的大流行病毒不完全相同的这些疫苗可提供足够的保护， 同时正在产生更专一的株系匹 配的疫苗。迄今为止， 3 种 H5N1 疫苗 ( 两种裂解病毒体 (split-virion) 和一种全病毒体 (whole-virion) 已获得监管机构的批准并且几种其它疫苗正处于后期开发。 0009 许多国家现正在贮存这些疫苗， 近

14、期美国目标是收集足够的疫苗来治疗 2000 万 人。 然而， 许多科学、 技术和经济挑战使得全球性流感大流行的防备变得复杂。 重要地， 通过 常规基于鸡蛋的方法进行的大流行前或大流行疫苗的制造是非常耗时的、 昂贵的， 并且需 要数十亿鸡蛋来制造足够的疫苗剂量以免疫全世界的高危个体。 产生减毒病毒的基于细胞 的替代策略正在开发中， 但这类再装配病毒通常包含相对低水平的疫苗抗原。该低抗原产 率在 H5N1 疫苗的背景中是值得特别关注的， 因为禽 H5 血凝素固有地在人中表现出比来自 其它亚型的 HA 更低的免疫原性。因此， 相对于季节性流感疫苗， 需要更大的抗原剂量来诱 导抗体反应。 此外， 鉴于

15、人对于H5血凝素具有特异性免疫力(immunologically naive)， 一 个剂量的免疫计划可能不具有保护作用。为了举例说明这些观点， 最早由 FDA 批准的基于 H5 进化枝 1 病毒 (A/Vietnam/1203/2004) 的疫苗仅在 54% 的研究参与者中诱导 “保护性” 中和滴度并且在 90g 的 HA 上需要两个剂量， 为季节性疫苗的 HA 含量的 12 倍 (Treanor 等人 New Engl J Med354:1343-1351,2006)。 0010 需要可显著提高疫苗生产能力同时增强 H5N1 免疫原性的其它技术。大流行前疫 苗的理想特征是其可被容易且便宜地

16、制造并且具有长贮存期限。重要地， 其应当使用最小 限量的抗原产生强劲的保护性免疫反应， 并且提供抗遗传上不同的病毒， 理想地来自不同 进化枝的病毒的交叉保护。此外， 疫苗还必须是安全的。 发明内容 0011 本发明涉及用作疫苗的组合物和利用所述疫苗免疫受试者的方法， 其中疫苗包含 来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素和佐剂。在一个实施方案中， 佐剂为被描 述为具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖的化合 物 (DSLP 化合物 )， 其中非还原端的 1 位上的碳通过醚 (-O-) 或氨基 (-NH-) 基团连接于还 原端的 6 位上的碳， 二糖通过非还原端的

17、4 碳键合于磷酸基团以及通过酰胺 (-NH-C(O)-) 和 / 或酯 (-O-C(O)-) 键键合于多个脂质基团， 其中酯或酰胺键的羰基 (-C(O)-) 基团直接 连接于脂质基团， 且每一个脂质基团包含至少 8 个碳。在具体的组合物和方法中， 佐剂为 GLA( 参见， 例如， 美国专利申请公布 2008/0131466)， 其在不同的实施方案中可以不含油， 被配制为水包油乳剂或利用其它佐剂例如明矾、 铝盐来进行配制。特别感兴趣的血凝素包 括来自高致病性 H5N1 病毒的 H5 和来自 H1N1(“猪流感” ) 大流行性流感病毒的 H1。组合 物可以是节省药量的 (dosage-sparin

18、g) 和 / 或重组血凝素可以以节省剂量的量存在。方 法可包括用组合物的单次注射即非多次注射来免疫受试者。例如， 组合物可通过下列的一 说 明 书 CN 102946900 A 4 3/23 页 5 项或多项 ( 即， 其任何组合 ) 来进行定义 ： rHA 以节省剂量的量存在 ； rHA 以在佐剂不存在 的情况下不提供保护性免疫的浓度存在 ； rHA 来自禽流感的致病株 ； rHA 来自 H5N1 流感的 致病株 ； rHA来自进化枝1或进化枝2 ； rHA来自大流行猪流感病毒株 ； rHA来自大流行H1N1 株 ； 组合物包含单种， 即不超过一种不同的重组蛋白 ； 每剂rHA的量在约15g

19、至约0.1g 的范围内 ； rHA 从昆虫或哺乳动物细胞表达以获得优选水平的糖基化 ； rHA 被表达为融合蛋 白 ； 佐剂仅为 GLA 或包括 GLA ； 佐剂仅为 3D-MPL 或包括 3D-MPL， 组合物不含油 ； 组合物包含 低于约 1%v/v 的油或低于约 0.1%v/v 的油 ； 佐剂在与抗原组合之前被配制为水溶液 ； 佐剂 在与抗原组合之前被配制为包含脂质体的组合物 ； 组合物还包含铝盐或皂苷。 0012 在一个实施方案中， 本发明提供了免疫有此需要的受试者抗大流行前或大流行性 流感病毒的方法， 包括施用单次注射的药物组合物， 所述药物组合物包含 (a) 来自大流行 前或大流行

20、性流感病毒的重组血凝素 (rHA) 和 (b) 佐剂， 其中佐剂包含具有各自独立地选 自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖， 其中非还原端的 1 位上的碳通 过醚 (-O-) 或氨基 (-NH-) 基团连接于还原端的 6 位上的碳， 二糖通过非还原端的 4 碳键 合于磷酸基团以及通过酰胺 (-NH-C(O)-) 和 / 或酯 (-O-C(O)-) 键键合于多个脂质基团， 其 中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于脂质基团， 且每一个脂质基团包含至少8个 碳， 其中在单次注射后施用实现血清转换(seroconversion)。 在各种实施方案中， 其可单独 地或以任何组合

21、进一步定义本发明 ： 组合物不包括乳剂 ； 佐剂为 GLA， 佐剂为 3D-MPL。 0013 例如， 本发明在一个实施方案中提供了用于通过单次注射药物组合物免疫有此需 要的受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物， 所述药物组合物包含 ： (a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和(b)佐剂， 其中佐剂包含具有 各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖， 其中非还原端的 1 位上的碳通过醚 (-O-) 或氨基 (-NH-) 基团连接于还原端的 6 位上的碳， 二糖通过非还原 端的 4 碳键合于磷酸基团以及通过酰胺 (-NH-C(O)-) 和

22、 / 或酯 (-O-C(O)-) 键键合于多个 脂质基团， 其中酯或酰胺键的羰基 (-C(O)-) 基团直接连接于脂质基团， 且每一个脂质基团 包含至少 8 个碳。药物组合物可用于免疫群体抗大流行前或大流行性流感病毒的方法， 其 中组合物的施用在单次注射后在至少50%、 或至少60%或更多的群体中实现血清转换。 在一 个方面， 药物组合物不包括任何油， 即不含油， 或包含不影响组合物的血清转换效率的最少 量的油， 并且不包括任何含油乳剂。 与这些实施方案的任何实施方案组合， 本发明的一个方 面是将 GLA 用作佐剂。在另一个方面， 3D-MPL 可用作佐剂。 0014 作为另一个实例， 本发明

23、提供了用于免疫有此需要的受试者抗大流行前或大流行 性流感病毒的方法的药物组合物， 其中组合物包含 ： (a) 来自大流行前或大流行性流感病 毒的重组血凝素 (rHA) 和 (b) 佐剂， 其中佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代 的葡糖基的还原端和非还原端的二糖， 其中非还原端的 1 位上的碳通过醚 (-O-) 或氨基 (-NH-) 基团连接于还原端的 6 位上的碳， 二糖通过非还原端的 4 碳键合于磷酸基团以及 通过酰胺 (-NH-C(O)-) 和 / 或酯 (-O-C(O)-) 键键合于多个脂质基团， 其中酯或酰胺键的羰 基 (-C(O)-) 基团直接连接于脂质基团， 且每一个脂质基

24、团包含至少 8 个碳， 并且其中组合 物是节省药量的。用于免疫受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物， 其中 rHA 以节省剂量的量存在。在不同的实施方案中， 其可单独地或以任何组合进一步定 义本发明 ： rHA 以在佐剂不存在的情况下不提供保护性免疫的浓度存在 ； 组合物包含单种、 说 明 书 CN 102946900 A 5 4/23 页 6 即不超过一种重组蛋白 ； 每剂量 rHA 的量在约 15g 至约 1g 的范围内 ； 并且佐剂为 GLA， rH5 来自 H5N1 流感病毒的致病株。 0015 当参考下列详细描述和附图后， 这些和其它方面将变得显然。 附图说明 001

25、6 图 1A-C。rH5/GLA-SE 疫苗的单次注射保护小鼠免受 H5N1 感染。(A) 用在 2% v/ v SE 乳剂或 GLA-SE 佐剂 (20g GLA) 中配制的 50、 150、 450、 900 或 2700 ng rH5(VN) 免 疫小鼠 (5 只 / 组 ) 一次， 随后在第 14 天用 H5N1 病毒 (1000x LD50) 进行攻击。在两周的时 期中测定每一组的每组体重减轻最大百分比的平均值。测定每一个 rH5 的剂量的曲线下面 积 ( 随时间过去的体重减轻百分比 )。(B) 在病毒攻击后在连续天数时的小鼠的体重减轻 百分比。用利用单独的 SE 配制的或利用 GL

26、A-SE 佐剂配制的 50ng rH5 或在蛋白质不存在 的情况下用 GLA-SE 或 SE 接种小鼠。每一个数据点代表每组平均体重减轻 +/-s.e.m。(C) c57Bl/6 小鼠中佐剂介导的 rH5 保护作用。用单独的 GLA-SE 或 50ng 的用 2% v/v 的单独 的 SE 配制的 rH5(VN)、 单独的 5g GLA 或 5g GLA-SE 接种动物 (5 只 / 组 ) 一次。在第 14 天用 H5N1 Viet Nam 1203 病毒 (1000xLD50) 攻击 (IN) 小鼠， 监控其存活率和体重减轻。 每一个数据点代表每组平均体重减轻 +/-s.e.m。 0017

27、 图2。 GLA-SE佐剂在用异源H5N1病毒攻击后提高已接种的小鼠的存活率。 用50ng 利用 GLA-SE 佐剂配制的同源 (VN)rH5、 50ng 或 200ng 于 GLA-SE 佐剂中配制的异源 (Indo) rH5 或 200ng 单独的异源 rH5 或利用 SE 乳剂配制的 rH5 接种动物 (5 只 / 组 )。在第 14 天 用 H5N1 Viet Nam 1203 病毒 (1000xLD50) 攻击 (IN) 小鼠， 监控其存活率和体重减轻。每一 个数据点代表每组平均体重减轻 +/-s.e.m。 0018 图 3A-C。GLA-SE 加速抗原特异性免疫的诱导和疾病的恢复。

28、(A) 作为攻击之前 接种的天数的函数的存活率百分比。用 50 ng 单独的 rH5 和利用 SE 或 GLA-SE 配制的 rH5 或单独的 GLA-SE 免疫小鼠， 在用 H5N1 Viet Nam 1203 病毒 (1000xLD50) 接种后第 0、 2、 4、 6、 8、 10 或 12 天进行攻击。(B) 在病毒攻击后第 6 或 14 天用 50ng 单独的 rH5 或利用 SE 或 GLA-SE 配制的 rH5 接种的小鼠随时间变化的体重减轻百分比。(C) 基于观察的评分系统的 来自(B)的小鼠的一般健康的变化 ； 0=正常 ； 1=尚未确定的疾病 ； 2=轻度但确定的疾病 ；

29、3= 中度疾病 ； 4= 严重的， 垂死的。 0019 图 4A-C。基于 GLA 的 rH5 疫苗在同源和异源病毒攻击后在小鼠中提供了持久的 保护性免疫。(A) 用 50ng 单独的或如所指示配制的同源 (VN)rH5 接种小鼠 (5 只 / 组 ) 和 46 天后用 H5N1 Viet Nam 1203 病毒 (1000xLD50进行攻击。在攻击后每天监控小鼠的体重 变化， 进行 2 周。每一个数据点代表每组平均体重减轻 +/-s.e.m。(B) 用 50ng 的单独的或 如所指示配制的异源 (Indo)rH5 接种小鼠 (5 只 / 组 )， 46 天后用 H5N1 Viet Nam 1

30、203 病 毒 (1000xLD50) 进行攻击。在攻击后每天监控小鼠的体重变化， 进行 2 周。每一个数据点代 表每组平均体重减轻 +/-s.e.m。(C) 在攻击后第 3 天或第 6 天测定用指定的制剂中的同源 (VN) 或异源 (Indo)rH5 接种的动物的病毒载量。 0020 图 5A-B。利用基于 GLA 的 rH5 疫苗的单次注射保护鼬免受 H5N1 感染。用 0.5g 的单独的 rH5 抗原或指定的制剂中的 rH5 注射动物 (4 只 / 组 ) 一次 (IM)， 随后在第 28 天 通过 H5N1VN1203(0.75x106pfu) 的鼻内输注进行攻击。(A) 体重的百分比

31、变化。每一个数 说 明 书 CN 102946900 A 6 5/23 页 7 据点代表 4 只动物的平均值 +/-s.e.m.， 除提供分别来自 1 和 2 个存活者的结果的 GLA-SE 和 rH5 组外。(B) 基于观察的评分系统的一般健康的变化 ； 0= 正常 ； 1= 尚未确定的疾病 ； 2= 轻度但确定的疾病 ； 3= 中度疾病 ； 4= 严重的， 垂死的。 具体实施方式 0021 本公开提供了用作疫苗的组合物和利用所述疫苗免疫受试者的方法， 其中疫苗包 含来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素和佐剂。 疫苗提供了抗流行前或大流行 性流感病毒的保护作用， 并且其通常引发体液和细

32、胞免疫， 从而导致记忆免疫细胞。 0022 本文中描述的疫苗和药物组合物包含来自大流行前或大流行性流感病毒的血凝 素(HA)和DSLP佐剂， 例如根据式(1)的佐剂(其可以为GLA)， 并且在大流行前和大流行期 间用于保护人免受该病毒的侵害。此外， 组合物提供了以更少的接种 ( 节省剂量 ) 和 / 或 比在佐剂不存在的情况下所需的更低的剂量的HA(节省药量或抗原)增强抗相关病毒的免 疫反应和引发抗相关病毒的交叉反应性的益处。 0023 A. 血凝素的制备 0024 1.HA 的来源 0025 至少 4 种不同的甲型流感病毒目前具有大流行前或大流行顾虑 ： H5N1、 H1N1、 H7N7 和

33、 H9N2。 0026 甲型流感病毒 H5N1 亚型是可引起人和许多其它动物物种的疾病的甲型流感病毒 的亚型。H5N1 的高致病性株 (HPAI H5N1) 是 “禽流感” 或 “鸟流感” 的原因。其目前是禽病， 虽然其可感染人， 其大部分或全部与已感染的鸟类具有广泛的身体接触。H5N1 被分类为大 流行前病毒， 因为并非所有大流行的条件都已得到满足， 最值得注意地病毒在人之间不能 容易且持续性地传播。 0027 H5N1 型的禽流感 ( 在本文中称为 “H5N1” ) 首先出现在亚洲并且已全球传播。 H5N1 病毒不断进化， 现可基于它们的 HA 分子的抗原性和序列特征被分类为不同的进化枝

34、和子分枝。 “进化枝” 是指从共同祖先传下的相关生物。由于人的 H5N1 感染在 2003 年重 现， 因此已从超过 300 例人疾病病例分离了几个不同的进化枝。WHO( 世界卫生组织 ) 已 着手统一高致病性 H5N1 禽流感病毒的命名系统 (Brown 等人 ,Influenza Other Respi Viruses 3:59-62,2009 ； Donis等人,Emerg Infect Dis.14:e1,2008 ； 也参见www.who.int 上的 “Continuing progress towards a unified nomenclature system for the

35、 highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses” )。截至 2009 年 3 月， 已鉴定了 10 个不同的 病毒进化枝 ( 编号为 0-9)。 0028 进化枝 1 和进化枝 2 病毒 ( 主要在 SE 亚洲和亚洲中分离的 ) 最常见地为疫苗开 发的主体。最早由 FDA 批准的 H5N1 疫苗为基于 H5 进化枝 1 病毒的常规疫苗， 但仅在约半 数研究参与者中诱导保护水平的中和滴度， 此外， 还需要两个剂量的大量HA。 测试中的重组 疫苗给出相似的结果 (Treanor 等人 ,Vaccine19:1732-1737)。除了保护更多个体外，

36、能够 抵抗大流行的疫苗还需要节省剂量和节省药量的改善。 0029 在 NCBI 的 “流感病毒来源” ( 于 2010 年 1 月 14 日存入的 ) 中存在约 1335 个特 有的全长 H5 序列。可使用这些 H5 序列的任何序列。HA 序列可来自任何进化枝或子分枝。 最常见地， HA 可来自进化枝 1 或 2。WHO 的参照 H5 HA 抗原主要在进化枝 2 中， 但也包括进 说 明 书 CN 102946900 A 7 6/23 页 8 化枝 1、 4 和 7 中的 HA( “Antigenic and genetic characteristics of H5N1 viruses an

37、d candidate vaccine viruses developed for potential use in human vaccines” ， 2009 年 2 月 , 存于 www.who.int 上 )。参照抗原包括下表中显示的抗原。 0030 0031 0032 * 将全部 GenBank 登录号和参照的序列整体并入本文。 0033 具有大流行顾虑的另一种亚型为 H1N1 大流行病毒 (“猪流感” 病毒 )， 该类型负 责 2009 年的流感大流行和 1918 年的西班牙流感。引起 2009 年大流行的株称为大流行 H1N1 2009 病毒。截至 2010 年 2 月 18 日

38、， 超过 900 个 HA 的非冗余蛋白质序列可在 NCBI 和流感研究数据 (Influenza Research Database)(fludb.org) 上获得。对于美国， A/ California/4/2009( 登录号 ACP41105， 将其整体并入 ) 和 A/California/7/2009( 登录号 ACQ55359， 将其整体并入 ) 为用于制造疫苗的株。来自其它株的 HA 也是合适的。 0034 其它潜在的大流行性流感病毒包括来自荷兰的 H7N7 和来自中国的 H9N2。自 2003 年以来， 荷兰已报导另一种高致病性甲型禽流感病毒 (H7N7) 在禽类中的爆发。约

39、90 个 人的确认的感染已在禽工作者和家庭之间发生 ； 针对该病毒的抗体被广泛地发现于未与 感染的家禽接触但与感染的个体密切家庭接触的人中， 这表明高水平的人与人之间的传 播。H9N2 为被发现在中国已引起人的疾病的另一种禽流感病毒。国家过敏症和传染病研 究所已将 H9N2 鉴定为潜在的大流行病毒。一些适当的株包括 A/HK/1073/99(H9N2) 和 A/ NL/209/07(H7N7)。 说 明 书 CN 102946900 A 8 7/23 页 9 0035 用于药物组合物和用于疫苗的血凝素蛋白可以是全长的， 但也可以是前体蛋白、 片段、 融合蛋白的部分或肽。 全长蛋白是指成熟蛋白

40、； 例如， 在血凝素蛋白的情况下， 成熟蛋 白是在病毒体中发现的形式 ( 例如， 缺乏前导肽， 并且可被从 HA0 切割成 HA1 和 HA2)。前体 蛋白 ( 前蛋白 ) 是在任何加工发生之前新生的翻译的蛋白质或部分加工的蛋白质。作为融 合蛋白的部分， HA 蛋白可以以前体或全长蛋白质或蛋白质片段或肽的形式存在。蛋白质的 片段或肽必需是具有免疫原性， 包含一个或多个引发免疫反应的表位。 0036 肽被选择来与 MHC 分子复合以结合 T 细胞受体并且通常达到约 30 个氨基酸长， 或 达到约 25 个氨基酸， 或达到约 20 个氨基酸长， 或达到约 1 5 个氨基酸长， 达到约 12 个氨基

41、 酸长， 达到约 9 个氨基酸长， 达到约 8 个氨基酸长。一般而言， 更短的肽结合 MHC I 类分子 或与其缔合， 更长的肽结合 MHC II 类分子或与其缔合。可使用许多生物信息学程序的任何 程序预测适当的肽， 以及使用公知的方法进行测试。 0037 如本文中所公开的， 适当的蛋白质包括前体蛋白、 成熟蛋白、 片段、 融合蛋白和肽。 组合物中可存在超过一种 HA。如果使用多种 HA 蛋白， 则 HA 蛋白可来自相同病毒或来自不 同病毒。此外， 多种蛋白质可以相同形式存在或以这些形式的混合物存在。例如， HA 蛋白 可以以成熟蛋白质的形式和以片段的形式存在。 0038 通常， 药物或疫苗组

42、合物中的 HA 与前体蛋白不同， 因为具有前导序列的糖蛋白在 真核生物中的表达通常导致成熟蛋白， 缺乏前导序列 ( 也称为信号肽 )。HA 的疏水性前导 序列的长度在分离株之间可发生些许变化， 但通常为约 18 个氨基酸长。然而， 对于重组表 达， 信号肽可以为前体蛋白的部分。信号肽包括 HA 天然序列或本领域已知的序列。 0039 蛋白质片段应当具有免疫原性。 在一些情况下， 片段包含免疫显性肽。 免疫原性肽 序列为被 B 或 T 细胞 ( 例如， CD4 或 CD8 T 细胞 ) 识别的序列。肽序列可通过筛选来源于全 序列的肽来鉴定 ； 通常使用一系列重叠肽。可使用多种测定法来确定 B 或

43、 T 细胞是否识别 肽和对其起反应。 例如， 铬释放细胞毒性测定(Kim等人,J Immunol 181:6604-6615,2008， 在测定方案方面被并入 )、 ELISPOT 测定、 细胞内细胞因子染色测定和 MHC 多聚体染色 (Novak等人J Clin Invest 104:R63-R67,1999 ； Altman等人,Science 274:94-96,1996)、 ELISA 测定、 在用偶联至载体的肽免疫小鼠后其它类型的抗体的测量属于适当的测定。免 疫源性肽还可利用生物信息学软件 (Molecular Biology 第 409 卷 ,2007 中的 “免疫信 息学 (Im

44、munoinformatics) ： 在芯片中预测免疫原性”法 ) 来预测。一些示例性程序和 数据库包括 FRED(Feldhahn 等人 Bioinformatics 15:2758-9,2009)、 SVMHC(和 Kohlbacher,Nucleic Acids Res 34:W1940197,2006)、 AntigenDB(Ansari 等人 ,Nucleic Acids Res 38:D847-853,2010)、 TEPITOPE(Bian and Hammer Methods 34:468-475,2004)。 0040 还可以以融合蛋白的部分包含HA。 其它融合伴侣可以是另一

45、种HA蛋白或非HA蛋 白， 例如流感病毒神经氨酸酶。使用融合蛋白的一些常见原因是提高所得蛋白质的表达或 帮助其纯化。例如， 可将被定制用于表达系统的宿主细胞的信号肽序列连接于 HA 蛋白或可 连接用于蛋白质纯化的标签序列， 如果还包含了切割序列， 随后可进行切割。 可融合来自一 种或多种蛋白质的多个肽表位， 或可融合来自一种或多种蛋白质的片段。多个肽表位可以 以任何顺序存在。 0041 组合物中的 HA 的其它适当来源包括包含 HA(U.S.2005009008， 以其整体并入 的 )、 编码 HA 的核酸 (U.S.2003045492 ； U.S.7537768 ； WO 09092038

46、 ； Smith 等人 Vaccine 说 明 书 CN 102946900 A 9 8/23 页 10 Jan 29,2010， 将所有上述文献整体并入本文 ) 的病毒样颗粒 (VLP) 以及减毒和灭活病毒 (U.S.6022726 ； U.S.7316813 ； U.S.2009010962 ； WO 99/57284,U.S.2008254060 ； 将所有上 述文献整体并入本文 )。 0042 2. 重组系统 载体构建 0043 可在培养的细胞中产生或化学合成 HA 蛋白， 包括前体蛋白、 片段、 融合蛋白和肽。 (“HA 蛋白” 据此在本文中用于包括所有这些形式 )。具体地， 可以使

47、用机器 ( 许多是商购 可得的 ) 或手工方便地化学合成肽。或者， 多种适当的表达系统 ( 原核和真核系统 ) 是公 知的， 并且可使用所述表达系统。常用的并且适合蛋白质的生产的宿主细胞包括大肠杆菌 (E.coli)、 酵母、 昆虫和哺乳动物。表达载体和宿主细胞是商购可得的 ( 例如， Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)或可被构建。 示例性载体包括启动子和用于编码目标蛋白质的序 列的克隆位点， 以便启动子与序列有效连接。其它元件也可存在， 例如分泌信号序列 ( 有时 称为前导序列 )、 标签序列 ( 例如， 六 -His)、 转录终止信号、 复制起点 ( 特别地

48、当染色体外 复制载体时 ) 和编码可选择的产物的序列。根据它们的目的将任选元件排列在载体中。转 染宿主细胞的方法和步骤也是公知的。 0044 因为 HA 为糖基化蛋白， 最常见地选择的表达系统为糖基化蛋白质的真核系统， 例 如酵母 ( 例如， U.S.5856123 ； U.S.RE35749 ； U.S.4925791 ； 也为商业系统例如 PichiaPinkTM Invitrogen,CA USA,K.lactis 蛋白表达试剂盒 ,NEB,MA,USA)、 哺乳动物细胞和杆状病毒 (U.S.4745051 ； U.S.5762939 ； U.S.5858368 ； U.S.610352

49、6 ； 其中将本文中的所有美国专利 参考文献通过引用整体并入本文 )。 0045 其中包含 HA 的编码序列的杆状病毒感染昆虫细胞 ( 其随后表达 HA) 的昆虫表达 系统是特别适当的表达系统。昆虫细胞中的表达通常产生高浓度和量的蛋白质， 产生具有 真核生物翻译后修饰 ( 例如， 糖基化 ) 的蛋白质并且可按比例放大至产生足够用于大流行 前疫苗的蛋白质的生产水平。 表达系统和方法在本领域是公知的 ； 例如， 存在许多商购可得 的系统和服务提供商 ( 例如， Invitrogen,Carlsbad CA ； Protein Sciences Meriden,CT ； Clontech,Mountain View， CA ； 也参见 上的提供商和服务提供商的列 表 )。 0046 在示例性昆虫表达系统中， 初级基因产物未被加工， 例如全长血凝素， 并且不被分 泌但保持与感染的细胞的外周膜缔合 (U.S.5762939)。感染后数天， 可从外周膜提取重组 HA(rHA)(U.S.5858368， 在 rHA 的提取和纯化方面通过引用并入本文