薄荷醇的制药用途.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811301158.7 (22)申请日 2018.11.02 (71)申请人 北京中医药大学东直门医院 地址 100700 北京市东城区海运仓5号 (72)发明人 吴圣贤 杜雅薇 何芳 (74)专利代理机构 北京瑞恒信达知识产权代理 事务所(普通合伙) 11382 代理人 张伟 (51)Int.Cl. A61K 31/045(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (54)发明名称 薄荷醇的制药用途 (57)摘要 本发明

2、提供了如下式所示的薄荷醇的制药 用途， 特别是薄荷醇在制备用于治疗和/或预防 血脂异常和/或动脉粥样硬化相关疾病的药物中 的用途。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 109276562 A 2019.01.29 CN 109276562 A 1.薄荷醇在制备用于治疗和/或预防血脂异常和/或动脉粥样硬化相关疾病的药物中 的用途。 2.根据权利要求1所述的用途， 其特征在于， 所述动脉粥样硬化相关疾病为动脉粥样硬 化性心血管疾病。 3.根据权利要求1或2所述的用途， 其特征在于， 所述药物通过降低总胆固醇、 降低低密 度脂蛋白、 降低甘油三酯和/或降低动脉粥样硬化斑块面积来治疗和/或预防

3、血脂异常和/ 或动脉粥样硬化相关疾病。 4.薄荷醇在制备用于降血脂和/或抗动脉粥样硬化的药物中的用途。 5.根据权利要求4所述的用途， 其特征在于， 所述降血脂为降低总胆固醇、 降低低密度 脂蛋白和/或降低甘油三酯。 6.根据权利要求4或5所述的用途， 其特征在于， 所述抗动脉粥样硬化为降低动脉粥样 硬化斑块面积。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109276562 A 2 薄荷醇的制药用途 技术领域 0001 本发明涉及医药领域， 更具体而言， 本发明涉及薄荷醇的制药用途。 背景技术 0002 血脂是血清中的胆固醇、 甘油三酯和类脂(如磷脂)等的总称， 其中与临床密切相 关的血脂主

4、要是胆固醇和甘油三酯。 在人体内胆固醇主要以游离胆固醇及胆固醇酯的形式 存在， 必须与特殊的蛋白质即载脂蛋白结合形成脂蛋白才能溶于血液， 被运输至组织进行 代谢。 临床上血脂检测的基本项目为总胆固醇(Total Cholesterol， TC)、 甘油三酯 (Triglyceride， TG)、 低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol， LDL- C)等， 该几项亦为血脂异常(通常指血清中胆固醇和/或TG水平升高， 俗称高脂血症)的主要 参考指标。 0003 低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein， LDL)颗粒中含胆固

5、醇约50， 是血液 中胆固醇含量最多的脂蛋白， 故称为富含胆固醇的脂蛋白。 单纯性高胆固醇血症时， 胆固醇 浓度的升高与血清LDL-C水平呈平行关系。 故LDL-C浓度基本能反映血液LDL总量； 影响TC的 因素均可同样影响LDL-C水平。 另外， 研究表明， LDL由VLDL和IDL(属LDL前体， 部分经肝脏代 谢)转化而来(其中的TG经酯酶水解后形成LDL)， TG是甘油分子中的3个羟基被脂肪酸酯化 而形成， 其轻至中度升高常反映VLDL及其残粒(颗粒更小的VLDL)增多， 故TG水平间接反应 了体内LDL及TC的水平。 0004 另一方面， 早在2016版中国成人血脂异常防治指南中就指

6、出， 血脂异常的主要危 害是增加动脉粥样硬化性心血管疾病(Atherosclerotic Cardiovascular Disease， ASCVD)的发病危险。 LDL-C增高是动脉粥样硬化发生、 发展的主要危险因素。 LDL通过血管内 皮进入血管壁内， 在内皮下层滞留的LDL被修饰成氧化型LDL(oxidized low-density lipoprotein， Ox-LDL)， 促进炎性因子、 促炎因子、 黏附因子分泌， 引起炎性反应诱发血管内 皮损伤， 改变其通透性； 此外， 巨噬细胞吞噬Ox-LDL后形成泡沫细胞， 后者不断增多、 融合， 构成动脉粥样硬化斑块的脂质核心； 同时脂质比

7、如胆固醇及胆固醇脂沉着在受损血管壁内 膜及内膜下， 形成黄色如粥糜状的斑块， 进一步加重AS病变。 动脉粥样硬化病理虽表现为慢 性炎症性反应特征， 但LDL很可能是这种慢性炎症始动和维持的基本要素。 因此， 以低密度 脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C)或TC升高为特点的血脂异 常是动脉粥样硬化相关性疾病重要的危险因素， 一般情况下采用LDL-C作为动脉粥样硬化 相关性疾病危险性的评估指标： 降低LDL-C水平， 可显著减少该类疾病的发病。 另有多数研 究提示， TG升高很可能是通过影响LDL的结构而具有致动脉粥样硬化作用。 00

8、05 药物性降脂疗法是目前治疗血脂异常的最有效措施， 其中有效药物主要为他汀 类。 但是， 长期服用他汀类药物对肝脏和肌肉存在明显毒性作用， 同时导致转氨酶增高， 少 数服用者出现横纹肌溶解症和急性肾衰竭。 尽管他汀类药物经过了几代的药物结构修饰， 但仍未解决其毒副作用问题。 0006 中医药降脂作用的研究越来越多。 薄荷作为中医临床常用药物， 在我国已有上千 说 明 书 1/6 页 3 CN 109276562 A 3 年应用历史， 传统医学认为薄荷具有疏风消热、 化痰散结等作用， 多用于治疗风热感冒、 头 痛、 目赤、 痈肿等， 但其在化痰、 利胆、 降脂等方面作用也为当代研究所记载。 研

9、究表明， 薄荷 提取物中的薄荷醇能减少呼吸道的泡沫痰， 使有效通气腔道增加， 并通过促进分泌， 使黏液 稀释易于排除而表现祛痰作用。 但是， 对于薄荷或其提取物中的特定成分， 如薄荷醇， 在减 肥、 降脂、 改善动脉粥样硬化发生或发展中的确切作用暂无定论。 发明内容 0007 为了解决上述技术问题， 本发明提供天然植物薄荷的主要提取物薄荷醇在治疗血 脂异常所致疾病和/或病症中的作用； 特别是， 本发明提供薄荷醇在降低血脂、 抗动脉粥样 硬化方面的作用。 0008 本发明的技术方案如下。 0009 本发明提供薄荷醇在制备用于治疗和/或预防血脂异常和/或动脉粥样硬化相关 疾病的药物中的用途。 00

10、10 本发明的薄荷醇的结构如下所示： 0011 0012 CAS号2216-51-5， 经验分子式(希尔表示法)C10H20O， 分子量156.27。 0013 本发明所用的术语 “治疗” 是指， 抑制疾病或病症， 例如， 阻止疾病或病症的进展； 缓解疾病或病症， 例如， 引起疾病或病症的消退； 或者缓解由疾病或病症引起的状况， 例如， 缓解、 预防或治疗疾病或病症的症状。 0014 本发明所用的术语 “预防” 是指， 如果尚未存在， 预防疾病进展或疾病发作， 预防疾 病或病症在可能易患该病症或疾病、 但是尚未诊断为具有病症或疾病的对象中出现， 和/或 如果已经存在， 预防疾病/病症的进一步进

11、展。 0015 其中， 所述动脉粥样硬化相关疾病为动脉粥样硬化性心血管疾病。 0016 优选地， 所述药物通过降低总胆固醇、 降低低密度脂蛋白、 降低甘油三酯和/或降 低动脉粥样硬化斑块面积来治疗和/或预防血脂异常和/或动脉粥样硬化相关疾病。 0017 或者， 本发明提供薄荷醇在制备用于降血脂和/或抗动脉粥样硬化的药物中的用 途。 0018 其中， 所述降血脂为降低总胆固醇、 降低低密度脂蛋白和/或降低甘油三酯； 所述 抗动脉粥样硬化为降低动脉粥样硬化斑块面积。 0019 本领域目前仍存在对新降脂药物的需求， 尤其是对公认副作用相对较小的中医药 及其提取物在降脂应用方面存在明显需求。 0020

12、 本发明的发明人通过大量实验证明了薄荷醇刺激能够降低血脂水平， 并且能够减 轻AS斑块程度。 简言之， 根据实验不同要求， 本发明的发明人将ApoE-/-小鼠随机分组， 分别 于30及30+M(薄荷醇)环境饲养， 完成相应刺激条件后， 收集待检测样本： 将血清分离后 备存于1.5ml离心管， 保存在-80； 根据后续需要进行病理染色方法检测， 将取材组织备存 于4多聚甲醛溶液中进行固定。 采用生化法检测血脂水平； 通过免疫组化法， 对各部位脂 说 明 书 2/6 页 4 CN 109276562 A 4 肪组织及主动脉根部血管石蜡切片使用不同一抗， 进行相应指标表达情况检测； 通过HE染 色法

13、观察各部位脂肪细胞形态、 着色等变化以明确脂肪组织棕色化及棕色脂肪组织活化情 况， 同时观察主动脉根部斑块形成情况； 最后对数据进行统计分析。 0021 结果发现， 与30对照组ApoE-/-小鼠相比， 4周薄荷醇刺激对TC、 LDL-C水平无显 著影响， 但可显著降低TG水平， 使TG下降41(*)， 如图1所示； 8周薄荷醇刺激可使TC、 LDL-C、 TG水平均降低： TC水平下降16(*)， LDL-C水平下降16(*)， TG水平降低26(*)， 如图2所示。 并且， 与30对照组ApoE-/-小鼠相比， 8周薄荷醇刺激可显著降低AS斑块面积： 降低约49(*)， 如图3所示。 00

14、22 因此， 本发明通过证明4周薄荷醇刺激显著降低TG水平及8周薄荷醇刺激显著降低 TC、 LDL-C、 TG水平， 证明了薄荷醇可减低血脂水平从而改善高脂血症的结论。 同时， 通过薄 荷醇同时降低血脂与改善AS斑块大小的结果看出， 薄荷醇对血脂及AS斑块的作用两者之间 存在相关性。 因此， 本发明发现了薄荷醇的新作用， 由此提出了薄荷醇的新的制药用途， 即 预防和/或治疗血脂异常和动脉粥样硬化相关疾病， 例如动脉粥样硬化性心血管疾病。 目前 无薄荷醇致人体危害的相关报道， 其对肝肾功能无明显损害， 因此可以克服或弥补他汀类 降脂药物具有较强毒副作用的缺陷。 附图说明 0023 以下， 结合附

15、图来详细说明本发明的实施方案， 其中： 0024 图1显示了4周薄荷醇刺激(30+M组)相对于对照(30组)的小鼠血脂TC、 LDL-C 和TG水平， 其中图1A为TC结果， 图1B为LDL-C结果， 图1C为TG结果。 0025 图2显示了8周薄荷醇刺激(30+M组)相对于对照(30组)的小鼠血脂TC、 LDL-C 和TG水平， 其中图2A为TC结果， 图2B为LDL-C结果， 图2C为TG结果。 0026 图3显示了8周薄荷醇刺激(30+M组)相对于对照(30组)的小鼠AS斑块面积情 况， 其中图3A为主动脉根部HE染色结果， 图3B为斑块面积。 具体实施方式 0027 以下参照具体的实施

16、例来说明本发明。 本领域技术人员能够理解， 这些实施例仅 用于说明本发明， 其不以任何方式限制本发明的范围。 0028 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的药 材原料、 试剂材料等， 如无特殊说明， 均为市售购买产品。 其中， 本发明采用的薄荷醇购买自 美国Sigma公司， 为白色晶体， CAS号2216-51-5， 经验分子式(希尔表示法)C10H20O， 分子量 156.27。 0029 实施例1薄荷醇在降血脂及减轻AS斑块程度方面的效果 0030 (一)实验材料与方法： 0031 1.材料 0032 1.1实验动物 0033 7-8周龄雄性ApoE

17、-/-小鼠90只， 购自北京维通利华公司， 基因背景为C57BL/6J。 0034 1.2实验试剂耗材： 0035 (1)常规手术器械： 组织剪(弯、 直)、 弯镊、 直镊、 手术钳等； 说 明 书 3/6 页 5 CN 109276562 A 5 0036 (2)4多聚甲醛溶液(4PFA)； 0037 (3)粘附载玻片， 购自CITOGLAS世泰公司； 0038 (4)PBS缓冲液粉末(pH 7.3)， 货号： ZLI-9062， 购自中杉金桥公司； 0039 (5)中性快干胶， 货号： ZLI-9516， 购自中杉金桥公司； 0040 (6)盖玻片， 购自CITOGLAS世泰公司； 004

18、1 (7)无水乙醇， 购自北京化工厂； 0042 (8)封闭用山羊血清(工作液)， 货号： ZLI-9022， 购自中杉金桥公司； 0043 (9)30过氧化氢， 货号： ZLI-9312， 购自中杉金桥公司； 0044 (10)柠檬酸盐修复液(pH 6.0)， 货号： ZLI-9065， 购自中杉金桥公司； 0045 (11)薄荷醇(Menthol)， 购自Sigma公司； 0046 (12)塑料离心管(规格1.5ml、 4ml、 15ml)； 0047 1.3实验仪器设备： 0048 (1)动物饲养恒温箱， 购自北京福意联公司； 0049 (2)低温离心机， 型号： 5424/5424R(

19、FA-45-24-11)， 购自Eppendorf公司； 0050 (3)光学显微镜， 型号： Olympus BX60， 购自Olympus公司； 0051 2.方法 0052 2.1动物模型建立及分组 0053 2.1.1动物模型建立 0054 将ApoE-/-小鼠置于具有通风设备的30恒温箱中饲养， 其中30+M(薄荷醇)组 小鼠饲料中根据实验要求酌情加入Menthol(薄荷醇)。 0055 2.1.2动物分组 0056 所有动物饲养条件和动物实验操作均严格遵循北京中医药大学东直门医院重点 实验室动物实验伦理委员会的制度规定。 0057 实验分为以下两部分： 0058 a)Part ：

20、为了研究短期薄荷醇刺激对血脂水平以及AS病变有何种影响， 本研究选 择ApoE-/-雄性小鼠作为AS造模经典模型。 将6-8周龄雄性ApoE-/-小鼠(n40)随机平均分 为2组： 30组(n20)和30+薄荷醇(Menthol)组(后文包括附图中均将 “30+薄荷醇组” 简称为 “30+M组” )(n20)。 接受高脂饲料喂养(15脂肪+0.25胆固醇)4周后， 将30 组以及30+M组小鼠持续置于30环境， 二者均继续高脂饲料喂养4周， 并对30+M组小鼠 给予薄荷醇药物刺激(剂量及给药方式为200mg/kg i.p.， qd， 8am； 由于薄荷醇常温条件下 不溶于水， 首先将其按剂量要

21、求溶解在5乙醇中， 接着按比例加入95的双蒸水)。 0059 b)Part： 通过第一部分实验初步证实， 薄荷醇刺激可降低血脂水平。 但4周高脂 饲料喂养+4周高脂饲料喂养模式可能由于饲料含脂量不够或造模时间太短， 导致小鼠主动 脉根部斑块形成并不明显， 无法判断4周薄荷醇刺激对AS斑块所起作用， 故在第二部分研究 内容中， 调整薄荷醇用药剂量为20mg/kg i.p.， qd， 8am， 并将高脂饲料配方调整为 “21脂 肪+0.15胆固醇” ， 同时在薄荷醇刺激组的高脂饲料中加入0.5薄荷醇， 即99.5高脂饲 料+0.5薄荷醇， 高脂喂养时间延长至19周； 同时为了对比短期薄荷醇刺激作用

22、， 在第二部 分实验中将薄荷醇刺激时间调整至8周， 着重研究长期薄荷醇刺激对ApoE-/-小鼠AS模型血 脂水平、 AS斑块的影响。 说 明 书 4/6 页 6 CN 109276562 A 6 0060 第二部分动物实验步骤为： 6-8周龄雄性ApoE-/-小鼠(n20)以普通饲料于小鼠 适宜温度30环境适应性喂养1周后， 全程接受高脂饲料喂养(21脂肪+0.15胆固醇)19 周， 接着随机分为30组(n10)和30+薄荷醇(Menthol)组(后文包括附图中均简称为30 +M组)(n10)， 两组小鼠持续置于30环境以高脂饲料喂养8周， 并对30+M组小鼠给予 薄荷醇药物刺激(剂量及给药方

23、式为20mg/kg i.p.， qd， 8am； 由于薄荷醇不溶于水， 首先将 其按剂量要求溶解在5乙醇中， 接着按比例加入95的双蒸水)； 同时， 在薄荷醇刺激组的 小鼠高脂饲料中添加0.5的薄荷醇。 0061 2.2组织取材步骤 0062 小鼠处死前保持空腹6-8小时。 需要保留的样本有： 血清， 大体动脉血管组织。 0063 a)取材前一天测量小鼠体重； 0064 b)剪去小鼠嘴边须毛， 左手捏住颈后及背部皮肤， 保持头低脚高位， 右手持弯镊快 速夹除一侧眼球， 固定小鼠头部， 眼球对准1.5ml离心管采血， 右手轻轻按摩小鼠心脏， 保证 尽可能多取血样； 0065 c)静置30分钟后，

24、 离心， 3000rpm， 15分钟， 取上层血清， 分装备存于-80冰箱； 0066 d)70酒精充分消毒小鼠后， 将小鼠置于仰卧位， 大头钉固定小鼠四肢于鼠板， 剪 开小鼠腹部皮肤， 并向两侧呈书页状剪开皮肤， 组织剪剪开腹膜， 并向两侧掀开呈书页状； 0067 e)向上剪开小鼠胸廓， 充分暴露心脏， 组织剪剪开心尖约0.5mm口子， 用小号手术 钳固定心脏， 将20ml注射器中抽满0.9生理盐水(事先将20ml注射器针头剪成钝口)， 轻轻 沿剪破的心尖小口缓慢刺入， 刺入方向平行于心脏纵轴， 注意不要刺入太深， 以免刺穿心脏 或刺入肺动脉， 无法进行体循环灌流； 0068 f)夹闭手术钳

25、， 固定20ml注射器针头， 将0.9生理盐水注入血液循环， 冲掉多余 的血细胞； 0069 g)摘除胸腹腔内多余脏器组织， 仅留贴于脊柱的大体血管及心脏， 小心用弯镊配 合剥离血管周围多余组织， 向上沿颈动脉分叉处剪下血管组织， 向下沿双侧髂动脉分叉处 剪下血管组织， 连着心脏一并取下小鼠大体血管组织， 保存固定于4多聚甲醛； 0070 h)取100 l血清， 生化法检测甘油三脂(TG)、 低密度脂蛋白(LDL-C)、 高密度脂蛋白 (HDL-C)及总胆固醇(TC)。 0071 2.3病理学检查 0072 2.3.1血管石蜡切片的制备 0073 a)将分离下来的心脏及大体动脉血管保存于4多聚

26、甲醛过夜后， 用蒸馏水冲洗 固定的心脏和血管组织， 将主动脉沿主动脉根切下约5mm长度与心脏组织分离备用； 0074 b)将分离下来的主动脉根部组织垂直于桌面方向置于石蜡组织包埋盒中， 并在血 管上下各放置一小块纱布， 以防血管组织从包埋盒空隙处漏出， 同时在包埋盒外用铅笔记 录样本编号等信息； 0075 c)将包埋盒置于自动脱水石蜡组织制备仪中， 进行脱水过夜； 0076 d)使组织切面朝下， 放置于石蜡托盒中， 室温条件放置备用； 0077 e)用石蜡切片机将蜡块组织平均每隔1mm切一张厚度为5 m的切片， 放置于40温 水台中使切片舒展， 轻轻以防脱片载玻片承起组织， 控水后， 于70烤

27、机上进行烤片2h， 直 至石蜡切片严密贴合在载玻片上， 常温干燥环境保存备用； 说 明 书 5/6 页 7 CN 109276562 A 7 0078 f)选取相邻石蜡切片， 做苏木素-伊红(HE)染色。 0079 2.3.2组织病理学测量 0080 根据每个样本石蜡切片的病理染色结果， 选择血管斑块面积最大的切片及其前后 连续几张切片、 脂肪组织切片及其前后连续几张切片进行结果处理分析。 使用高倍显微镜 下拍照采图， 并用图像分析软件(Image Pro Plus 6.0)测量分析采集的图片， 每个切片在 镜下观察多个片区后取最接近平均水平的片区进行采图、 测量， 所有采图、 测量条件均在统

28、 一参数下进行。 计算斑块面积： 分析主动脉根部血管HE染色， 计算血管斑块面积占血管内壁 总面积的百分比， 评估斑块面积大小。 0081 (二)实验及结果 0082 4周薄荷醇刺激对TC、 LDL-C水平无显著影响(ns， p0.05)， 但可显著降低TG水平， 使TG下降41(*， p0.001)， 如图1所示(n19)。 8周薄荷醇刺激可使TC、 LDL-C、 TG水平均 降低： 其中TC水平下降16(*)， LDL-C水平下降16(*)， TG水平降低26(*)， 如图2所示 (n9)。 与30对照组ApoE-/-小鼠相比， 8周薄荷醇刺激可显著降低AS斑块面积： 降低约 49(*)， 如图3所示(n8)。 0083 以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明， 本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形， 只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明所附权利要求的范 围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 109276562 A 8 图1 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 109276562 A 9 图2 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 109276562 A 10 图3 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 109276562 A 11