改进的细菌外膜囊泡.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102188700 A (43)申请公布日 2011.09.21 CN 102188700 A *CN102188700A* (21)申请号 201110112838.6 (22)申请日 2003.09.01 0220194.5 2002.08.30 GB 03823723.7 2003.09.01 A61K 39/02(2006.01) A61K 39/095(2006.01) A61K 39/104(2006.01) A61K 39/112(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (71)申请人 诺华疫苗和

2、诊断有限公司 地址 意大利锡耶纳 (72)发明人 M皮扎 D塞鲁托 R拉波利 (74)专利代理机构 上海专利商标事务所有限公 司 31100 代理人 余颖 (54) 发明名称 改进的细菌外膜囊泡 (57) 摘要 现有方法制备脑膜炎球菌 OMV 在破坏细菌膜 时需使用洗涤剂。根据本发明， 可以在基本上没 有洗涤剂存在下进行膜的破坏。所得 OMVs 保留 了重要的细菌免疫原性成分， 特别是 (i) 保护性 NspA 表面蛋白， (ii) 蛋白 NMB2132 和 (iii) 蛋白 NMB1870。典型的方法包括下列步骤 ： (a) 在基本 上没有洗涤剂存在下处理细胞 ； (b) 离心步骤 (a)

3、所得的组合物以将外膜囊泡与处理后细胞和细胞 碎片分开， 收集上清 ； (c) 高速离心步骤 (b) 所得 的上清并收集沉淀中的外膜囊泡 ； (d) 将步骤 (c) 所得的沉淀分散在缓冲液中 ； (e)根据步骤(c)进 行第二次高速离心， 收集沉淀中的外膜囊泡 ； (f) 将步骤 (e) 所得的沉淀分散在水性介质中。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 2 页 CN 102188700 A1/1 页 2 1. 从细菌生产外膜囊泡制剂的方法， 其中， 在基本上没有

4、脱氧胆酸盐类洗涤剂存在下 将细菌膜破坏， 所述细菌过量表达 TbpA。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其中， 在基本上没有任何洗涤剂存在下将细菌膜破坏。 3.如权利要求1或2所述的方法， 所述方法包括下列步骤 ： (a)在基本上没有洗涤剂存 在下处理细胞 ； (b) 离心步骤 (a) 所得的组合物以将外膜囊泡与处理后细胞和细胞碎片分 开， 收集上清 ； (c)高速离心步骤(b)所得的上清并收集沉淀中的外膜囊泡 ； (d)将步骤(c) 所得的沉淀分散在缓冲液中 ； (e) 根据步骤 (c) 进行第二次高速离心， 收集沉淀中的外膜囊 泡 ； (f) 将步骤 (e) 所得的沉淀分散在水介质中。

5、 4.如权利要求3所述的方法， 所述方法还包括 ： (g)通过至少2个孔径递减的滤器对步 骤 (f) 所得的再分散组合物进行除菌过滤 ； (h) 可选地将步骤 (g) 所得组合物加入药学上 可接受的载体和 / 或佐剂组合物中。 5. 如权利要求 3 或 4 所述的方法， 步骤 (b) 包括以约 5000-10000g 离心至多 1 小时， 步 骤 (c) 和 (e) 包括以约 35000-100000g 离心至多 2 小时。 6. 如上述权利要求中任一项所述的方法， 膜的破坏是通过超声处理、 均化、 微流化、 空 腔化、 渗透休克、 研磨、 弗氏压碎器、 混合或任何其它物理技术进行。 7. 如

6、上述权利要求中任一项所述的方法， 步骤 (d) 和 / 或步骤 (f) 所用缓冲液是 Tris 缓冲液、 磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。 8.如权利要求5至7中任一项所述的方法， 步骤(g)中最后一个滤器的孔径约0.2m。 9. 如上述权利要求中任一项所述的方法， 用来制备 OMVs 的细菌来自莫拉氏菌属、 志贺 氏菌属、 假单胞菌属、 密螺旋体菌属、 卟啉单胞菌属、 螺杆菌属或奈瑟氏球菌属。 10. 如权利要求 9 所述的方法， 所述细菌是脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌。 11. 如权利要求 10 所述的方法， 脑膜炎奈瑟氏球菌来自 B 血清群。 12. 如权利要求 11 所述的方法， 所述

7、细菌是 B 血清群的脑膜炎奈瑟氏球菌 H4476。 13. 如上述权利要求中任一项所述的方法， 所述方法还包括将免疫有效量的 OMVs 配制 成免疫原性组合物。 14.OMV 组合物， 所述组合物由述权利要中任一项所述的方法获得。 15. 脑膜炎奈瑟氏球菌囊泡组合物， 所述囊泡包括 (i)NspA 蛋白， (ii)287 蛋白和 (iii)741 蛋白。 16.如权利要求14或15所述的组合物， 所述组合物无菌且/或无热原且/或由缓冲液 调制在 pH6.0-7.0。 17. 如权利要求 14 至 16 中任一项所述的组合物， 所述组合物用作药物。 18. 权利要求 14 至 16 中任一项所述

8、外膜囊泡用于制造增强患者免疫反应的药物的用 途。 权 利 要 求 书 CN 102188700 A1/13 页 3 改进的细菌外膜囊泡 0001 此为 2003 年 9 月 1 日提交的专利申请 CN03823723.7(PCT/IB2003/004293)，“改 进的细菌外膜囊泡” 的分案申请。 技术领域 0002 本发明涉及用于免疫目的的囊泡制剂。 背景技术 0003 抗脑膜炎奈瑟氏球菌 (N.menigitidis) 感染免疫的多种方法之一是使用外膜囊 泡 (OMV)。挪威国立卫生院 (Norwegian National Institute of Public Health) 已生产

9、出一种有效抗 B 血清群的 OMV 疫苗 ( 例如文献 1)， 但尽管此疫苗安全且可预防 MenB 疾病， 其功效限于针对用于制造该疫苗的菌株。 0004 “RIVM” 疫苗以含 6 种不同 PorA 亚型的囊泡为基础， 已在 II 期临床试验中显示在 儿童中具免疫原性 2。 0005 文献 3 揭示了一种抗脑膜炎球菌 B 血清群不同病原血清型的疫苗， 该疫苗以保留 了一种 65-kDa 蛋白复合体的 OMV 为基础。文献 4 揭示了一种包含 OMV 的疫苗， 该 OMV 来自 基因修饰过的脑膜炎球菌株， 该 OMV 包含 ： 至少一种 1 型外膜蛋白 (OMP)， 但不包含 2/3 型 OM

10、P。文献 5 描述含表面环突变 OMP 的 OMV 和含脑膜炎球菌脂多糖 (LPS) 衍生物的 OMV。 0006 文献 6 描述了含 OMV 的组合物， 其中添加了运铁蛋白结合蛋白 ( 如 TbpA 和 TbpB) 和 / 或 Cu， Zn- 超氧化物岐化酶。文献 7 描述了含 OMV 并添加了多种蛋白的组合物。文献 8 揭示的膜囊泡制剂由含有经修饰 fur 基因的脑膜炎奈瑟氏球菌制得。 0007 除脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群之外， 还制备了其它细菌的囊泡。 文献9揭示了制备 针对脑膜炎球菌 A 血清群的基于 OMV 的疫苗的方法。文献 10 和 11 描述了淋病奈瑟氏球菌 (N.gonorr

11、hoeae)的囊泡。 文献12描述了由乳糖奈瑟氏球菌(N.lactamica)制备的囊泡制 剂。 还制备了粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)13， 14、 弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)15， 16、 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)15， 16、 牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis)17、 苍白密螺旋体 (Treponema pallidum)18、 流感嗜血 杆菌(Hacmophilus influenzae)19&20和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)21的

12、囊泡。 0008 细菌囊泡制剂的一个缺点是缺少重要的保护性抗原。 为在OMV制剂中保留如NspA 等抗原， 文献 20 提出必须上调 nspA 的表达， 同时敲除 porA 和 cps。本发明的一个目标是提 供改良囊泡制剂及其生产方法。具体地说， 发明旨在提供保留了脑膜炎奈瑟氏球菌的重要 细菌性免疫原性成分的囊泡。 发明内容 0009 现有技术制备脑膜炎球菌 OMV 的方法在破坏细菌膜时使用洗涤剂 参见例如文 献 22， 其中使用脱氧胆酸盐洗涤剂 。发明的基础是发现在基本上没有洗涤剂存在下破坏 说 明 书 CN 102188700 A2/13 页 4 膜产生的 OMV 保留了重要细菌免疫原性成

13、分， 尤其是 (i) 保护性 NspA 表面蛋白， (ii) 蛋白 287 和 (iii) 蛋白 741 。 0010 所以， 本发明提供从细菌生产外膜囊泡制剂的方法， 其中在基本上没有洗涤剂存 在下破坏细菌膜。本发明还提供可用发明方法获得的 OMV 制剂。 0011 就获得 NspA+ve囊泡而言， 发明方法比象文献 20 所述那样进行多步骤遗传操作简 单得多。 0012 发明方法通常包括下列基本步骤 ： (a) 在基本上没有洗涤剂存在下处理细菌细 胞 ； (b) 离心步骤 (a) 所得的组合物以将外膜囊泡与处理后细胞和细胞碎片分开， 收集上 清 ； (c) 高速离心步骤 (b) 所得的上清

14、并收集沉淀中的外膜囊泡 ； (d) 将步骤 (c) 所得的沉 淀重新分散在缓冲液中 ； (e) 根据步骤 (c) 进行第二次高速离心， 收集沉淀中的外膜囊泡 ； (f) 将步骤 (e) 所得的沉淀重新分散在水介质中。 0013 本发明方法还可以包括下列步骤 ： (g)将步骤(f)所得的再分散组合物通过至少2 个孔径递减的滤器进行除菌过滤 ； (h) 可选地将步骤 (g) 所得组合物加入药学上可接受载 体中和 / 或佐剂组合物中。 0014 步骤 (a) 产生细菌外膜囊泡， 这些囊泡一般包含基本呈现各自天然形式的外膜成 分。这一步骤方法的优点在于保留了膜成分 NspA、287 和 741 。 0

15、015 步骤 (b) 通常采用约 5000-10000g， 至多 1 小时的离心。 0016 步骤 (c) 和 (e) 一般采用约 35000-100000g， 至多 2 小时的离心。离心步骤优选在 2-8进行。 0017 任何适当缓冲液能用于步骤 (d)， 例如 Tris 缓冲液、 磷酸缓冲液、 组氨酸缓冲液 等。步骤 (f) 也可使用缓冲液， 该缓冲液可与步骤 (d) 所用相同， 或者只用水 ( 例如注射用 水 )。 0018 步骤 (g) 中最后一滤器的孔径优选约 0.2m。 0019 发明还提供脑膜炎奈瑟氏球菌囊泡制剂， 其特征是， 所述囊泡包含 (i)NspA 蛋白， (ii)287

16、 蛋白和 (iii)741 蛋白。 0020 细菌 0021 制备 OMV 的细菌可以是革兰氏阳性的， 但优选革兰氏阴性的。细菌可以来自莫拉 氏菌属 (Moraxella)、 志贺氏菌属 (Shigella)、 假单胞菌属 (Pseudomonas)、 密螺旋体菌属 (Treponema)、 卟啉单胞菌属(Porphyromonas)或螺旋杆菌属(Helicobacter)(优选种参见 前文)， 但优选奈瑟氏球菌(Neisseria)属。 优选的奈瑟氏球菌种是脑膜炎奈瑟氏球菌和淋 病奈瑟氏球菌。在脑膜炎奈瑟氏球菌中， 可使用任何 A、 C、 W135 和 Y 血清群的菌种， 优选 B 血清群的

17、菌种来制备囊泡。B 血清群中的优选菌株是 MC58、 2996、 H4476 和 394/98。 0022 为减少热原活性， 细菌应具有低内毒素 (LPS) 水平。已知有合适的突变细菌， 例如 突变奈瑟氏球菌 23 和突变螺旋杆菌 24。文献 25 描述了从革兰氏阴性菌制备无 LPS 外 膜的方法参见。 0023 细菌可以是野生型细菌也可以是重组细菌。优选的重组细菌过量表达 ( 相对于对 应的野生型菌株而言 ) 免疫原如 NspA、 287、 741、 TbpA、 TbpB， 超氧化物岐化酶 6 等。细菌 可表达一种以上的PorA I型外膜蛋白， 例如表达2、 3、 4、 5或6种PorA亚型

18、 ： P1.7， 16 ； P1.5， 2 ； P1.19， 15 ； P1.5c， 10 ； P1.12， 13 和 P1.7h， 4 例如文献 26， 27。 说 明 书 CN 102188700 A3/13 页 5 0024 本发明方法通常包括最初的细菌培养步骤， 其后可以跟一步浓缩所培养细胞的步 骤。 0025 膜的破坏 0026 用于形成囊泡的膜破坏在基本上没有洗涤剂存在下进行。 0027 具体地说， 膜破坏基本上在没有脱氧胆酸盐洗涤剂存在下进行， 其它洗涤剂可以 存在。 0028 膜破坏可在基本上没有离子洗涤剂存在下进行， 非离子洗涤剂可以存在。 或者， 膜 破坏可在基本上没有非离

19、子洗涤剂存在下进行， 离子洗涤剂可以存在。 在一些实施方案中， 离子或非离子洗涤剂都不存在。 0029 膜破坏和囊泡形成后的步骤中可以使用洗涤剂。因此， 如果某方法中膜破坏在没 有洗涤剂存在下进行， 但后来向制得的囊泡中加入洗涤剂， 则该方法也在本发明范围之内。 0030 术语 “基本上没有”指进行膜破坏时， 相关洗涤剂的浓度不超过 0.05 ( 例如 0.025、 0.015、 0.010、 0.005、 0.002、 0.001或甚至 0 )。因 此， 囊泡制备过程中存在痕量洗涤剂的方法也在本发明范围内。 0031 无洗涤剂存在下， 可采用物理技术， 例如超声处理、 均化、 微流化、 空腔

20、化、 渗透休 克、 研磨、 弗氏压碎器、 混合等对完整细菌进行膜的破坏。 0032 囊泡 0033 发明方法用来生成外膜囊泡。OMV 是从培养细菌的外膜制备的。它们可获得自培 养于发酵液或培养于固体培养基上的细菌， 优选的获得方法是 ： 从培养基中分离出细菌细 胞(例如通过过滤或通过低速离心沉淀细胞)， 裂解细胞(不用洗涤剂)和从细胞质分子中 分离出外膜组分 ( 例如通过过滤， 通过示差沉淀或聚集外膜和 / 或 OMV， 通过使用特异识别 外膜分子的配体的亲和分离方法， 或通过沉淀外膜和 / 或 OMV 的高速离心 )。 0034 OMVs 是能与微泡 (MVs28) 和 天然 OMVs (N

21、OMVs 66) 区分开来的， 微泡和 天然 OMVs 是天然就有的膜泡， 在细菌生长期间自发形成并释放到培养基中。可以如下获 得 MVs ： 在肉汤培养基中培养奈瑟氏球菌， 从肉汤培养基中分离全细胞 ( 例如通过过滤或通 过低速离心只沉淀细胞而不沉淀更小的水泡 )， 随后收集除去了细胞的培养基中的 MVs( 例 如通过过滤， 通过示差沉淀或聚集 MVs， 通过高速离心沉淀 MVs)。一般根据培养物产生的 MVs 量来选择用于生产 MVs 的菌株。文献 29 和 30 描述了 MV 高产奈瑟氏球菌。 0035 保留的细菌免疫原性成分 0036 本发明方法基本上没有洗涤剂存在使得囊泡制剂保留了细

22、菌表面的免疫原性成 分， 如果采用基于洗涤剂的现有技术方法， 这些成分将会流失或减少。 就脑膜炎奈瑟氏球菌 而言， 用本发明方法保留的 3 种免疫原包括但不限于 ： (1)NspA ； (2) 蛋白 287 和 (3) 蛋白 741 。 0037 NspA( 奈 瑟 氏 球 菌 表 面 蛋 白 A) 可 见 于 文 献 31-37，即 文 献 38 的 SEQ IDs4008-4033。它是预防脑膜炎球菌疾病的候选疫苗。它在菌株间高度保守。然而并非如 最初所愿， 现在认为NspA本身尚不足以作为保护抗原而需要与其它抗原联用例如文献36 和文献 38 的实施例 11。已发现， 基于洗涤剂的现有技

23、术制备方法去除了 NspA。然而， 根 据本发明， NspA 能保留在囊泡中。这种 NspA+ve囊泡具有优势， 因为一次制备制得了两种已 知有效免疫原的组合 ( 即囊泡 +NspA)， 这两种免疫原相互提高彼此的功效。 说 明 书 CN 102188700 A4/13 页 6 0038 蛋白 741 在文献 39 中被描述为 NMB 1870 (GenBank ： AAF42204， GI ： 7227128)。 它还可见于文献 40 和 41。它引发强效杀菌抗体。已发现， 用基于洗涤剂的现有方法制得 的囊泡中蛋白 741 被部分去除。然而， 本发明方法可将 741 保留在囊泡中。这种 74

24、1+ve 囊泡具有优势， 因为一次制备制得了两种已知有效免疫原的组合 ( 即囊泡 +741)， 这两种免 疫原相互提高彼此的功效。 0039 蛋白 287 在文献 39 中被描述为 NMB2132 (GenBank ： AAF42440， GI ： 7227388)。 它还可见于文献 40 和 42。它引发强效杀菌抗体。已发现， 用基于洗涤剂的现有方法制得的 囊泡中通常没有蛋白 287 ， 为了弥补， 此前曾提出在 OMV 制剂中补加 28743。然而， 本发 明能将 287 保留在囊泡中。这种 287+ve囊泡具有优势， 因为一次制备制得了两种已知有 效免疫原的组合 ( 即囊泡 +287)，

25、 这两种免疫原相互提高彼此的功效。 0040 优选的 NspA(a) 与氨基酸序列 GI ： 1518522 有至少 a的序列一致性， 且 / 或 (b) 包含氨基酸序列 GI ： 1518522 中至少 x 个氨基酸的片段。优选的 741 (a) 与氨基酸序列 GI ： 7227128有至少b的序列一致性， 且/或(b)包含氨基酸序列GI ： 7227128者至少x个 氨基酸的片段。优选的 287 (a) 与氨基酸序列 GI ： 7227388 有至少 c的序列一致性， 且 / 或 (b) 包含氨基酸序列 GI ： 7227388 者至少 x 个氨基酸的片段。a、 b 和 c 值彼此独立，

26、但各 自至少是 70( 例如 75、 80、 85、 90、 95、 96、 97、 98、 99、 99.5 或 100)。x、 y 和 z 值彼此独立， 但 各自至少是 8( 例如 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 25、 30、 35、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 150、 200、 250 等 )。所述片段以包含抗原表位的为佳。 0041 优选的 NspA、 287 和 741 蛋白基本不利了野生型蛋白 ( 如在完好细菌中那样 ) 在 患者体内引发杀菌抗体的能力。 0042 免疫原性药物组合物 0

27、043 本发明方法提供囊泡制剂。 为了给予患者， 最好将囊泡配制成免疫原性组合物， 更 好的是配制成适合用作人用 ( 例如儿童或成人用 ) 疫苗的组合物。本发明疫苗可以是预防 型的 ( 即用于预防感染 ) 也可是治疗型的 ( 即用于治疗感染后的疾病 )， 但通常是预防型 的。 0044 本发明组合物优选无菌。 0045 本发明组合物优选无热原。 0046 发明组合物的pH一般为6.0-7.0， 优选6.3-6.9， 例如6.60.2。 组合物宜用缓冲 液维持在此 pH。 0047 其它适适合给予人的成分参见文献 44。 0048 本发明组合物一般包括佐剂。提高组合物效力的优选佐剂包括但不限于

28、： (A) MF59(5鲨烯、 0.5土温80和0.5Span 80， 用微流化器制成超微颗粒)参见文献45的 第 10 章， 和文献 46 ； (B) 可生物降解且无毒材料形成的微粒 ( 即直径约 100nm-150m 的 颗粒， 优选约 200nm 到 30m， 最优选约 500nm 到 10m)， 所述材料例如例如聚 (- 羟 基酸 )、 聚羟基丁酸、 聚原酸酯、 聚酐、 聚己酸内酯等， 优选 ( 交酯 - 乙醇酸交酯 ) 共聚物， 颗 粒可以表面带电 ( 例如通过加入阳离子、 阴离子、 非离子洗涤剂如 SDS( 阴性 ) 或 CTAB( 阳 性 ) 如文献 47&48) ； (C) 脂

29、质体 参见文献 45 的第 13 和 14 章 ； (D)ISCOMs 参见文 献 45 的第 23 章 ， 它可以不含其它洗涤剂 49 ； (E)SAF， 含 10鲨烯、 0.4土温 80 和 5 Pluronic- 嵌段聚合物 L121 和 thr-MDP， 微流化成亚微米乳剂或旋涡搅拌成较大颗粒 说 明 书 CN 102188700 A5/13 页 7 的乳剂 参见文献 45 的第 12 章 ； (F)RibiTM佐剂系统 (RAS)(Ribi Immuochem)， 含 2鲨 烯、 0.2土温 80 和一种或多种细菌细胞壁成分， 所述成分选自单磷脂 A(MPL)、 双分枝菌 酸藻糖 (

30、TDM) 和细胞壁骨架 (CWS)， 优选 MPL+CWS(DetoxTM) ； (G) 皂角苷佐剂， 如 QuilA 或 QS21 参见文献 45 的第 22 章 ， 也称为 StimulonTM； (H) 壳聚糖 例如 50 ； (I) 完全弗氏佐 剂 (CFA) 和不完全弗氏佐剂 (IFA) ； (J) 细胞因子如白介素 ( 例如 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-12等)、 干扰素(例如干扰素-)、 巨噬细胞集落刺激因子、 肿瘤坏死因子等 参见文献 45 的第 27&28 章 ； (K) 皂角苷 ( 例如 QS21)+3dMPL+IL-12(

31、 任选 + 固醇 )51 ； (L) 单磷脂 A(MPL) 或 3-O- 脱酰 MPL(3dMPL) 例如文献 45 的第 21 章 ； (M)3dMPL 与例如 QS21 和 / 或水包油乳剂的组合 52 ； (N) 包含 CpG 基序的寡核苷酸 53， 即含至少一个 CG 二核苷酸， 可用5-甲基胞苷取代胞嘧啶 ； (O)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯54 ； (P)与辛苯聚 醇组合的聚氧乙烯山梨糖酯表面活性剂 55， 或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少 一种其它非离子表面活性剂如八木糖醇的组合 56 ； (Q) 免疫刺激性寡核苷酸 ( 例如 CpG 寡核苷酸 ) 和皂角苷 57 ； (R)

32、免疫刺激剂和金属盐颗粒 58 ； (S) 皂角苷和水包油乳剂 59 ； (T) 大肠杆菌 (E.coli) 热不稳定肠毒素 (“LT” ) 或其去毒突变体， 如 K63 或 R72 突 变体 例如文献 60 的第 5 章 ； (U) 霍乱毒素 (“CT” ) 或其去毒突变体 例如文献 60 的 第 5 章 ； (V) 双链 RNA ； (W) 铝盐， 如氢氧化铝 ( 包括羟基氧化物 )、 磷酸铝 ( 包括羟基磷酸 盐 )、 硫酸铝等 文献 61 的第 8&9 章 ； (X) 单磷脂 A 模拟物， 如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸 盐衍生物例如 RC-52962 ； (Y) 聚磷腈 (PCPP) ； 或

33、 (Z) 生物粘合剂 63 如酯化透明质酸微 球 64 或粘膜粘着剂 (mucoadhesive)， 选自聚 ( 丙烯酸 )、 聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、 多 糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。 也可使用可作为免疫刺激剂增强本发明组合物效果的其 它物质 例如参见文献 45 的第 7 章 。铝盐 ( 特别是磷酸铝和 / 或氢氧化铝 ) 是肠胃外免 疫的优选佐剂。突变毒素是优选的粘膜佐剂。 0049 本发明组合物中囊泡的含量是 “免疫有效量” ， 即将该量作为一次性剂量或多次给 药的一部分给予个体后能够有效治疗或预防疾病。 该量取决于待治疗个体的健康和身体状 况、 年龄、 待治疗个体的分类 ( 如非

34、人的灵长类动物、 灵长类动物等 )、 个体免疫系统合成抗 体的能力、 所需保护程度、 疫苗制剂、 治疗医生对医疗情况的评估和其它相关因素。 预计， 该 量的范围很宽， 通过常规试验即可确定。药物治疗可以是一次给药也可以是多次给药 ( 例 如包括加强剂量 )。所述疫苗可与其它免疫调节剂联用。 0050 通常， 发明组合物制备成注射剂。本发明组合物的直接传递一般是肠胃外途径 ( 例如通过注射， 皮下、 腹膜内、 静脉内或肌肉内注射， 或者传递到组织间质间隙 ) 或粘膜途 径 ( 例如口或鼻内 65、 66)。组合物还可以创伤给药。 0051 本发明组合物可在制成后直接给予个体。 待治疗的个体可以是

35、动物， 特别是人。 本 发明疫苗特别适合给儿童和青少年接种。 0052 本发明组合物可包含脑膜炎奈瑟氏球菌一种以上血清亚型的囊泡 28。类似的， 本发明组合物可包含一种以上囊泡， 如 MV 和 OMV。 0053 除囊泡之外， 本发明组合物还可包含抗原。 例如， 本发明组合物可包含一种或多种 下列抗原 ： 0054 - 来自幽门螺旋杆菌的抗原， 如 CagA67 到 70、 VacA71， 72、 NAP73， 74， 75、 HopX 例如 76、 HopY 例如 76 和 / 或脲酶。 说 明 书 CN 102188700 A6/13 页 8 0055 - 来自膜炎奈瑟氏球菌 A、 C、

36、W135 和 / 或 Y 血清群的多糖抗原， 如文献 77 所述来 自 C 血清群的寡糖 文献 78 或文献 79 的寡糖。 0056 - 来自肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae) 的多糖抗原 例如 80、 81、 82。 0057 - 来自甲肝病毒的抗原， 如灭活病毒 例如 83、 84。 0058 - 来自乙肝病毒的抗原， 如表面和 / 或核心抗原 例如 84、 85。 0059 - 来自百日咳博德特氏菌 (Bordetella pertussis) 的抗原， 如来自百日咳博德特 氏菌的百日咳全毒素 (PT) 和丝状血凝素 (FHA)， 可以与粘附素 (pert

37、actin) 和 / 或凝集原 2 和 3 例如文献 86&87 组合。 0060 - 白喉抗原， 如白喉类毒素 例如文献 88 的第 3 章 ， 如 CRM197突变体 例如 89。 0061 - 破伤风抗原， 如破伤风类毒素 例如文献 108 的第 4 章 。 0062 - 来自流感嗜血杆菌的多糖抗原 例如 78。 0063 - 来自丙肝病毒的抗原 例如 90。 0064 - 来自淋病奈瑟氏球菌的抗原 例如 91、 92、 93、 94。 0065 - 来自肺炎衣原体 (Chlamydia pneumoniae) 的抗原 例如文献 95 到 101。 0066 - 来自沙眼衣原体 (Chl

38、amydia trachomatis) 的抗原 例如 102。 0067 - 来自牙龈卟啉单胞菌的抗原 例如 103。 0068 - 脊髓灰质炎抗原 例如 104、 105， 如 OPV 或优选 IPV。 0069 - 狂犬病抗原 例如 106， 如冻干的灭活病毒 例如 107， RabAvertTM。 0070 - 麻疹、 腮腺炎和 / 或风疹抗原 例如文献 108 的第 9、 10&11 章 。 0071 - 流感抗原 例如文献 108 的第 19 章 ， 如血凝素和 / 或神经氨酸酶表面蛋白。 0072 - 来自粘膜炎莫拉氏菌的抗原 例如 109。 0073 -来自无乳链球菌(Strep

39、tococcus agalactiae)(B组链球菌)的蛋白抗原例如 110、 111。 0074 - 来自无乳链球菌 (B 组链球菌 ) 的多糖抗原。 0075 - 来自脓链球菌 (Streptococcus pyrogenes)(A 组链球菌 ) 的抗原 例如 111、 112、 113。 0076 - 来自金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 的抗原 例如 114。 0077 - 来自炭疽杆菌 (Bacillus anthracis) 例如 115、 116、 117 的抗原。 0078 - 来自黄病毒家族 ( 黄病毒属 ) 病毒的抗原， 如来自黄热病病毒、 日

40、本脑炎病毒、 4 种登革热病毒亚型、 蝉传脑炎病毒、 西尼罗河病毒。 0079 - 瘟疫病毒抗原， 如来自经典猪热病毒、 牛病毒性腹泻病毒和 / 或羊边界病毒 (border disease virus)。 0080 - 微小病毒抗原， 例如来自微小病毒 B19。 0081 - 朊病毒 ( 例如 CJD 朊蛋白 ) 0082 - 淀粉样蛋白， 如 肽 118 0083 - 癌症抗原， 如文献 119 表 1 或文献 120 表 3&4 所列。 0084 组合物可包含一种或多种其它抗原。 0085 必要时可将有毒蛋白抗原去毒(例如通过化学和/或遗传方法将百日咳毒素去毒 87)。 说 明 书 CN

41、 102188700 A7/13 页 9 0086 当组合物包含白喉抗原时， 最好同时包含破伤风抗原和百日咳抗原。 类似的， 当组 合物包含破伤风抗原时， 最好同时包含白喉和百日咳抗原。 类似的， 当组合物包含百日咳抗 原时， 最好同时包含白喉和破伤风抗原。因此优选 DTP 组合。 0087 多糖抗原以缀合物形式的为佳。 用于缀合物的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外 膜蛋白121、 合成肽122、 123、 热激蛋白124、 125、 百日咳蛋白126、 127、 流感嗜血杆 菌蛋白D128、 细胞因子129、 淋巴因子129、 激素129、 生长因子129、 C.difficile 毒素 A

42、或 B130、 铁吸收蛋白 131 等， 优选 CRM197 白喉类毒素 132。 0088 脑膜炎奈瑟氏球菌 B 血清群也可加入 OMV 组合物， 例如加入文献 133 到 139 所述 的蛋白抗原。 0089 组合物中的各抗原的浓度通常至少1g/ml。 一般， 任一抗原浓度都足以引发针对 该抗原的免疫反应。 0090 本发明组合物中也不用蛋白质抗原而代之以编码该抗原的核酸。因此， 发明组合 物中的蛋白成分可由编码蛋白的核酸 ( 优选 DNA， 例如质粒形式的 DNA) 取代。 0091 治疗患者的方法 0092 本发明提供本发明囊泡用作药物。 0093 本发明还提供引发患者免疫反应的方法，

43、 包括将本发明组合物给予患者。免疫反 应优选性抗脑膜炎球菌疾病的保护性免疫反应， 可以包括体液免疫反应和 / 或细胞免疫反 应。患者优选是儿童。 0094 本发明方法能在已接受过抗抗脑膜炎奈瑟氏球菌初次免疫的患者体内引发加强 免疫反应。OMV 的皮下和鼻内初次免疫 / 加强免疫方案可见于文献 65。 0095 本发明还提供发明囊泡用于制造增强患者免疫反应的药物的用途。 所述药物优选 免疫原性组合物 ( 例如疫苗 )。所述药物以用于预防和 / 或治疗奈瑟氏球菌所致疾病 ( 例 如脑膜炎、 败血病、 淋病等 ) 的为佳。 0096 本发明的方法和用途可将脑膜炎奈瑟氏球菌一种以上血清亚型的囊泡 例如

44、文 献 28 给予受主。 0097 OMV 制剂 0098 本发明提供的组合物包含脑膜炎球菌外膜囊泡、 氢氧化铝佐剂、 组氨酸缓冲液和 氯化钠， 其中 ： (a) 氯化钠浓度大于 7.5mg/ml ； 且 / 或 (b)OMVs 浓度小于 100g/ml。 0099 氯化钠浓度优选大于 8mg/ml， 更优选约 9mg/ml。 0100 OMVs 浓度优选小于 75mg/ml， 例如约 50mg/ml。 0101 组氨酸缓冲液的 pH 优选 pH6.3 至 pH6.7， 例如 pH6.5。 0102 佐剂的浓度可以是约 3.3mg/ml 使用 ( 以 Al3+浓度计 )。 0103 定义 01

45、04 两氨基酸序列间的一致性百分比是指 ： 将两序列排列对齐时， 两序列间相同氨 基酸的百分比。所述排列对齐和同源性或序列一致性百分比可用本领域已知的软件来测 定， 例如文献 140 的 7.7.18 节所述。优选排列方式之一是用 Smith-Waterman 同源性搜索 算法确定的， 该算法采用仿射缺口搜索， 开放型缺口的罚分为 12， 延伸型缺口的罚分为 2， BLOSUM 矩阵为 62。Smith-Waterman 同源搜索算法是本领域熟知的， 可见于文献 141。 0105 术语 “包含” 具有 “包括” 和 “由 . 组成” 的意思， 例如组合物 “包含” X 可以是仅 说 明 书

46、CN 102188700 A8/13 页 10 由 X 组成， 也可以还包含其它物质， 例如 X+Y。 0106 数值 x 前的 “约” 指例如 x10。 0107 “基本上” 包括 “完全” 的情形， 例如 “基本上没有” Y 的组合物可以是完全不含 Y。 必要时， 本发明定义中的 “基本上” 可忽略。 0108 附图概述 0109 图 1 和 2 显示细菌 (TOT ) 和外膜囊泡 (OMV ) 中 (1) 蛋白 287 和 (2) 蛋 白 741 的有无， 外膜囊泡由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株 MC58、 H4476 和 394/98 制得。箭头显 示图 1 中的 287 的位置和图 2 中

47、741 的位置。 0110 图 3 显 示 2002 年 8 月 29 日 GenBank 登 录 号 GI ： 7227128、 GI ： 7227388 和 GI ： 1518522 的氨基酸序列。 0111 本发明实施方式 0112 OMV 制剂 0113 用现有技术 Norwegian 方法 ( 菌株 H4476 和 394/98) 或以下方法 ( 菌株 MC58) 制备 OMV ： 0114 -收集2-5个平板上的细菌， 加至10ml 10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中， 在56 加热 45 分钟将其灭活。然后在冰上对样品进行超声处理 (10 分钟工作循环 50 次，

48、端头在 6/7 处 ) 以破坏膜。 0115 -5000g/4 / 离心 30 分钟或 10000g/ 离心 10 分钟去除细胞碎片。 0116 - 上清以 50000g/4再离心 75 分钟。 0117 -将沉淀重悬于7ml以10mM Tris-HCl(pH8.0)配制的2N-月桂酰肌氨酸盐(肌 氨酰 ) 溶液中， 放置 20 分钟使得细胞质膜溶解。 0118 - 样品以 10000g 离心 10 分钟以去除颗粒， 上清以 75000g/4离心 75 分钟。样品 在 10mM Tris-HCl(pH8.0) 中洗涤， 并 75000g 离心 75 分钟。 0119 - 将沉淀重悬于 10mM Tris-HCl(pH8.0) 或蒸馏水中。 0120