用于治疗癌症的治疗蛋白质和使用这种蛋白质的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201580023782.3 (22)申请日 2015.03.06 (30)优先权数据 61/949,345 2014.03.07 US (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2016.11.07 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2015/019095 2015.03.06 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2015/134833 EN 2015.09.11 (71)申请人 普罗达生物科技有限公司 地址 美国佐治亚州 申请人 刘志仁 (72)发明人 刘志仁 (7

2、4)专利代理机构 中国商标专利事务所有限公 司 11234 代理人 桑丽茹 (51)Int.Cl. A61K 38/00(2006.01) C07K 17/00(2006.01) G01N 33/574(2006.01) (54)发明名称 用于治疗癌症的治疗蛋白质和使用这种蛋 白质的方法 (57)摘要 描述了用于诱导细胞中细胞程序死亡的治 疗蛋白质和使用这种蛋白质的方法。 蛋白质， 例 如嵌合蛋白质具有宿主肽， 该宿主肽融合到更稳 定的BH3结构域肽。 宿主肽可以是钙结合蛋白 D9k、 钙调蛋白的N-末端或C-末端半结构域、 小清 蛋白( “Pa” )、 其氨基酸序列变体或其修饰变体。 BH3

3、结构域可以是Bim、 Bid、 Bad、 Bik、 Bmf、 Hrk、 Puma或Noxia。 而且， 各种缀合物可以附着到嵌合 蛋白质， 包括叶酸和聚乙二醇。 权利要求书1页 说明书13页 附图11页 CN 106456696 A 2017.02.22 CN 106456696 A 1.一种能够诱导细胞中细胞程序死亡的嵌合蛋白质， 其包含： 第一肽是宿主蛋白质； 和 第二肽是BH3-only蛋白质的BH3结构域， BH3结构域来自于BH3-only蛋白质的Bim、 Bid、 Bad、 Bik、 Bmf、 Hrk、 Puma或Noxia之一。 2.根据权利要求1所述的嵌合蛋白质， 其中嵌合蛋白

4、质具有选自下列群组的氨基酸序 列， 该群组包括SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。 3.根据权利要求1所述的嵌合蛋白质， 其中第一肽选自包括下列的群组： 钙结合蛋白 D9k， N-末端钙调蛋白、 C-末端钙调蛋白和小清蛋白。 4.根据权利要求1所述的嵌合蛋白质， 其还包含： 将嵌合蛋白质靶向细胞的通过缀合的 靶向部分。 5.根据权利要求4所述的嵌合蛋白质， 其中靶向部分是叶酸

5、。 6.根据权利要求5所述的嵌合蛋白质， 其中叶酸通过二硫键缀合嵌合蛋白质。 7.根据权利要求5所述的嵌合蛋白质， 其中叶酸通过马来酰亚胺键缀合嵌合蛋白质。 8.根据权利要求1所述的嵌合蛋白质， 还包含： 通过缀合的修饰基团， 其延长嵌合蛋白 质的半衰期。 9.根据权利要求8所述的嵌合蛋白质， 其中修饰基团是聚乙二醇。 10.一种用嵌合蛋白质治疗个体以诱导细胞的细胞程序死亡的方法， 该方法包括步骤： 向个体给药治疗有效量的嵌合蛋白质， 该嵌合蛋白质包含第一肽和第二肽， 该第一肽是稳 定的人类蛋白质的一部分， 该第二肽是BH3-only蛋白质的BH3结构域， 第一肽是钙结合蛋白 D9k， N-末

6、端钙调蛋白、 C-末端钙调蛋白或小清蛋白之一。 11.根据权利要求10所述的方法， 还包括： 共给药放射疗法、 化学疗法和生物疗法。 12.根据权利要求10所述的方法， 其中嵌合蛋白质具有选自下列群组的氨基酸序列， 该 群组包括SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。 13.根据权利要求10所述的方法， 其中给药步骤包括给药药物学上可接受的组合物， 该 组合物包含治疗有效量的嵌合

7、蛋白质。 14.根据权利要求13所述的方法， 其中药物学上可接受的组合物包含成像探针。 15.根据权利要求10所述的方法， 其中BH3结构域选自由BH3-only蛋白质的Bim、 Bid、 Bad、 Bik、 Bmf、 Hrk、 Puma和Noxia所组成的群组。 16.根据权利要求10所述的方法， 其中嵌合蛋白质包含与其缀合的叶酸， 叶酸是将嵌合 蛋白质靶向细胞的靶向部分。 17.根据权利要求16所述的方法， 其中叶酸通过二硫键或马来酰亚胺键之一缀合嵌合 蛋白质。 18.根据权利要求10所述的方法， 其中嵌合蛋白质包括与其缀合的聚乙二醇， 聚乙二醇 延长嵌合蛋白质的半衰期。 19.根据权利要

8、求10所述的方法， 其中BH3结构域具有与其缀合的标记。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106456696 A 2 用于治疗癌症的治疗蛋白质和使用这种蛋白质的方法 0001 相关的申请数据 0002 本申请要求2014年3月7日提交的美国临时专利申请序列号61/949,345的优先权， 其此处并入为参考文献。 技术领域 0003 本公开通常地涉及治疗蛋白质， 并且更特别地涉及具有增加的稳定性的蛋白质， 例如， 嵌合蛋白质， 并且涉及在癌症和其它疾病的治疗中治疗剂的使用方法。 背景技术 0004 癌症和其它疾病影响人类的日常生活。 癌症特别地是由于细胞程序死亡引起的遍 布宿主身体扩散

9、的持续性疾病， 直到宿主最终死于该疾病为止。 0005 目前使用各种形式的治疗法， 范围从侵入性到极微侵入性的治疗法来治疗这些疾 病。 这些治疗法包括外科手术， 化学疗法、 放射疗法， 靶向治疗等。 然而， 这些治疗法常常导 致患者在治疗期间感觉生病， 并且， 经常不足以完全地从人类除去疾病。 发明内容 0006 本公开提供了一种蛋白质， 例如， 嵌合蛋白质， 作为给药的治疗剂， 具有延长的半 衰期和延长的有效性。 本公开的一方面涉及一种嵌合蛋白质， 其能够诱导细胞中细胞程序 死亡。 嵌合蛋白质包含第一肽和第二肽， 该第一肽是稳定的人类蛋白质的一部分， 该第二肽 是人类BH3-only蛋白质的

10、BH3结构域， 其赋予第一肽稳定性， 因此导致整体嵌合蛋白质的增 加的稳定性。 BH3-only蛋白质的BH3结构域是Bim、 Bid、 Bad、 Bik、 Bmf、 Hrk、 Puma或Noxia中任 一个。 0007 嵌合蛋白质可以具有与这里所公开的SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9或SEQ ID No.10相同的氨基酸序列。 第一肽可以是钙结合蛋白D9k的一部分， N-末端钙调蛋白、 C- 末端

11、钙调蛋白或小清蛋白。 而且， 嵌合蛋白质可以包含靶向部分， 其将嵌合蛋白质靶向细 胞。 靶向部分可以通过二硫键或马来酰亚胺键缀合嵌合蛋白质的叶酸。 此外， 嵌合蛋白质可 以包含修饰基团， 诸如聚乙二醇， 其延长嵌合蛋白质的半衰期。 0008 本公开的另一个方面涉及用嵌合蛋白质治疗个体以诱导细胞的细胞程序死亡的 方法。 该方法包括向个体给药治疗有效量的嵌合蛋白质。 嵌合蛋白质包含第一肽和第二肽， 该第一肽是稳定的人类蛋白质的一部分， 该第二肽是人类BH3-only蛋白质的BH3结构域。 第 一肽是钙结合蛋白D9k， N-末端钙调蛋白、 C-末端钙调蛋白或小清蛋白。 嵌合蛋白质可以具 有靶向序列。

12、 0009 该方法还可以包括除了给药嵌合蛋白质外还将治疗靶暴露于放射。 而且， 奥沙利 铂(oxaliplatin)可以与嵌合蛋白质一起给药。 嵌合蛋白质也可以具有与这里所公开的SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID 说 明 书 1/13 页 3 CN 106456696 A 3 No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9或SEQ ID No.10相同的氨基酸序列。 可以在药物学上可以 接受的组合物内给药嵌合蛋白质， 并且药物学上可接受的组合物可以

13、包含成像探针。 BH3结 构域可以来自于BH3-only蛋白质的Bim、 Bid、 Bad、 Bik、 Bmf、 Hrk、 Puma或Noxia之一。 而且， 嵌 合蛋白质可以包含与其缀合的叶酸， 该叶酸是将嵌合蛋白质靶向细胞的靶向部分。 此外， 叶 酸可以通过二硫键或马来酰亚胺键缀合嵌合蛋白质。 嵌合蛋白质还可以包含与其缀合的聚 乙二醇， 该聚乙二醇延长嵌合蛋白质的半衰期。 BH3结构域还可以具有与其缀合的标记。 0010 定义 0011 术语 “氨基酸” 指天然存在的和非天然的氨基酸， 以及以与天然存在的氨基酸相似 的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。 天然编码的氨基酸是20种常规氨

14、基酸(丙 氨酸、 精氨酸、 天冬酰胺、 天冬氨酸、 半胱氨酸、 谷氨酰胺、 谷氨酸、 甘氨酸、 组氨酸、 异亮氨 酸、 亮氨酸、 赖氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 脯氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸、 色氨酸、 酪氨酸和缬氨 酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。 氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基 本化学结构的化合物， 仅仅举例说明， 结合氢的 -碳、 羧基、 氨基和R基。 这种类似物可以具 有修饰的R基(例如， 正亮氨酸)或可以具有修饰的肽骨架， 而同时保持与天然存在的氨基酸 相同的基本化学结构。 氨基酸类似物的非限制性例子包括高丝氨酸、 正亮氨酸、 甲硫氨酸亚 砜和甲硫氨酸甲基锍。 001

15、2 术语 “保守性修饰的变体” 适用于天然和非天然的氨基酸以及天然和非天然氨基 酸序列和它们的组合。 对于特别的氨基酸序列，“保守性修饰的变体” 指编码相同或基本上 相同的天然和非天然氨基酸序列的那些天然和非天然氨基酸， 或者其中天然和非天然氨基 酸不编码天然和非天然氨基酸序列为基本上相同的序列。 例如， 因为遗传密码的简并性， 大 量功能相同的氨基酸编码任何给定的蛋白质。 例如， 密码子GCA、 GCC、 GCG和GCU所有都编码 氨基酸丙氨酸。 因此， 在每个位置密码子指定丙氨酸， 但是可以改变密码子到所述相应密码 子中的任何一个， 而不改变编码的多肽。 这种氨基酸变异是 “沉默变异” ，

16、 这是保守性修饰的 变异中的一种。 因此， 例如， 编码天然或非天然氨基酸多肽的这里的每个天然或非天然氨基 酸序列也描述了天然或非天然氨基酸的每种可能的沉默变异。 本领域技术人员承认可以修 饰天然或非天然氨基酸中每个密码子(除了AUG， 其通常是甲硫氨酸唯一的密码子， 以及除 了TGG， 其通常是色氨酸唯一的密码子)， 以产生功能相同的分子。 相应地， 编码天然或非天 然多肽的天然和非天然氨基酸的每个沉默变异在每个描述的序列中都是隐含的。 0013 这里所用的术语 “有效量” 指被给药的足够量的药剂或化合物， 它们将在一定程度 上缓解疾病的一种或多种症状或被治疗的状况。 结果可以是疾病的迹象、

17、 症状或病因的减 少和/或减轻， 或者生物学系统的任何其它期望的改变。 例如， 被给药的药剂或化合物包括 但不限于天然氨基酸多肽、 非天然氨基酸多肽、 修饰的天然氨基酸多肽或修饰的非氨基酸 多肽。 可以给药包含这种天然氨基酸多肽、 非天然氨基酸多肽、 修饰的天然氨基酸多肽或修 饰的非天然氨基酸多肽的组合物， 用于预防、 增强和/或治疗性治疗。 使用技术， 诸如剂量逐 步升级研究可以确定任何个体病例中适合的 “有效” 量。 0014 这里所用的术语 “细胞或细胞种群” 指从组织切除的分离的细胞或多个细胞， 或者 通过组织培养技术体外生长的分离的细胞或多个细胞。 最特别地， 细胞种群指动物或人类

18、组织中体内的细胞。 0015 这里所用的术语 “接触细胞或细胞种群” 指向分离的或培养的细胞或细胞种群递 说 明 书 2/13 页 4 CN 106456696 A 4 送根据本公开的肽或探针， 或者向人类或动物的靶组织给药在适合的药物学上可接受载体 中的探针。 给药可以是， 但不限于静脉内递送、 腹膜内递送、 肌肉内地、 皮下地或通过本领域 已知的任何其它方法。 一种有利的方法是直接地递送到立即地通向靶器官或组织， 诸如胰 腺的血管中， 因此降低总循环系统中探针的稀释。 0016 这里所用的术语 “药物学上可接受的载体” 指与本公开的异二聚体探针一起给药 的稀释剂、 佐剂、 赋形剂或载体，

19、并且被联邦或州政府的管理机构批准或者在美国药典或其 它通常认可的用于动物， 并且更特别地人类的药典中被列出。 这种药物学上载体可以是液 体， 诸如水或油， 包括石油、 动物、 植物或合成来源的那些， 诸如花生油、 大豆油、 矿物油、 芝 麻油等等。 药物学上可接受的载体可以是盐、 阿拉伯树胶、 明胶、 淀粉糊、 滑石、 角蛋白、 胶态 氧化硅、 尿素等等。 当向患者给药时， 异二聚体探针和药物学上可接受的载体可以是经过灭 菌的。 当静脉内给药异二聚体探针时， 水是有用的载体。 盐溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也 可以用作液体载体， 特别地用于注射溶液。 适合的药物学上可接受的载体还包括赋形剂诸 如

20、葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 单硬脂酸甘油酯、 氯化钠、 甘油、 丙烯、 乙二醇、 水、 乙醇等等。 本组合 物如果期望还可以包含微量的湿润或乳化剂或者pH缓冲剂。 本组合物有利地可以采用溶 液、 乳液、 持续释放的制剂或者适于使用的任何其它形式。 0017 这里所用的术语 “蛋白质” 指由一个或多个氨基酸链按照特定顺序组成的大分子。 顺序由编码蛋白质的基因中核苷酸的碱基顺序决定。 需要蛋白质用于身体细胞、 组织和器 官的结构、 功能和调节。 每种蛋白质具有唯一的功能。 0018 这里可交换地使用术语 “多肽” 、“肽” 和 “蛋白质” 以指氨基酸残基的聚合物。 术语 适于其中一种或多个氨基酸残基

21、是相应天然地存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸 聚合物， 以及适于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。 0019 术语 “变体” 指不同于参考肽或多核苷酸的肽或多核苷酸， 但是保留了基本特性。 典型的肽变体在氨基酸序列上不同于另一种参考肽。 通常地， 限制不同以致于参考肽和变 体的序列总体上接近地相似， 并且在许多区域相同。 变体和参考肽通过一个或多个修饰， 在 氨基酸序列上可以不同(例如， 取代、 添加和/或删除)。 肽变体包括保守性修饰的变体(例 如， 原序列的约75、 约80、 约85、 约90、 约95、 约98和约99的保守性变体)。 取代 或插入的氨基酸残基可以是由

22、遗传密码编码的氨基酸残基或者也可以不是。 肽变体可以是 天然地存在的， 诸如等位基因变体， 或者它可以是不知道其天然地存在的变体。 0020 这里所用的术语 “靶” 指期望检测的肽、 细胞、 组织、 肿瘤等。 靶向肽可以在细胞表 面上， 与动物宿主分离的细胞、 培养细胞， 或者动物组织中的细胞或细胞种群。 0021 本公开包括来源于天然存在的肽序列的肽。 如果通过片段化天然地存在的序列可 以获得肽， 或者如果基于天然存在的氨基酸序列或编码该序列的遗传材料(DNA或RNA)的序 列知识可以合成肽， 那么肽就称为 “来源于天然地存在的氨基酸序列” 。 包括在本公开的范 围内是被称为肽的 “衍生物”

23、 的那些分子。 这种 “衍生物” 或 “变体” 与肽或肽的相似大小的片 段分享实质相似性， 并且能够与肽起到具有相同生物学活性的作用。 0022 如果衍生物的氨基酸序列是肽或具有与衍生物相同数量氨基酸残基的肽片段中 任一个氨基酸序列的至少80、 至少90、 至少95或与其相同， 那么肽的衍生物称为与肽 分享 “实质相似性” 。 0023 本公开的衍生物包括片段， 该片段除了包含与天然存在的肽的序列实质相似的序 说 明 书 3/13 页 5 CN 106456696 A 5 列外， 还可以在它们的氨基末端和/或羧基末端包含一个或多个附加的氨基酸。 相似地， 本 公开包括肽片段， 该肽片段尽管包含

24、与天然存在的肽的序列实质相似的序列， 但是可以在 它们的氨基末端和/或羧基末端缺少在肽上天然发现的一个或多个附加的氨基酸。 0024 这里所用的术语 “预防地有效量” 指预防地向患者施用的包含至少一种非天然氨 基酸多肽或至少一种修饰的非天然氨基酸多肽的组合物的量， 这将一定程度上缓解正在治 疗的疾病的一种或多种症状、 状况或障碍。 在这种预防应用中， 这种量可以取决于患者的健 康状态、 体重等等。 本领域技术人员通过常规实验法， 包括但不限于剂量逐步升级临床试验 可以很好地考虑， 确定这种预防地有效量。 0025 在两个核酸或多肽的上下文中， 短语 “实质相似” 指当进行最大对应的比较和对齐

25、时， 如使用序列比较算法诸如， 下述的算法所测量的， 例如或者通过可视检查所测量的具有 至少75， 优选地至少85， 更优选地至少90、 95或更高， 或者在其之间的任何整数值 的核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或多个序列或亚序列。 0026 优选地， 实质同一性存在于是至少约10个， 优选地约20个， 更优选地约40-60个残 基长度或其间任何整数值的残基长度的序列区域上， 优选地比60-80个残基更长， 更优选地 至少约90-100个残基的区域上， 并且最优选地序列实质上与被比较的序列的全长诸如， 例 如核苷酸序列的编码区相同。 0027 这里所用的术语 “协同” 指预防或治疗有效药剂的联合

26、， 该联合比任何两种或多种 单个药剂的添加效果更有效。 预防或治疗药剂的联合的协同效果可以允许使用更低剂量的 一种或多种药剂和/或向具有特定疾病或状况的受试者更少频率地给药药剂。 在一些情况 下， 可以利用预防或治疗药剂的联合的协同效果以避免或减少与任何单个治疗使用相关的 不利或不想要的副作用。 0028 这里所用的术语 “治疗有效量” 指向已经遭受疾病、 状况或障碍的患者给药包含至 少一种非天然氨基酸多肽和/或至少一种修饰的非天然氨基酸多肽的组合物的量， 该量足 以治愈或至少部分地阻碍或一定程度上缓解正在治疗的疾病的一种或多种症状、 障碍或状 况。 这种组合物的有效性取决于情况， 包括但是不

27、限于疾病、 障碍或状况的严重性和病程、 之前的治疗、 患者的健康状态和对药物的反应以及治疗内科医生的判断。 只是举例， 可以通 过常规实验法， 包括但不限于剂量逐步升级临床试验确定治疗有效量。 0029 除非另外表明， 特定的核酸序列也隐含地包括其保守性修饰的变体(例如， 简并密 码子取代)和互补序列， 以及明确地表明的序列。 特别地， 通过产生序列可以获得简并密码 子取代， 该序列中用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个选定(或所有)密码子的 第三位置。 术语核酸与基因、 cDNA、 mRNA、 寡核苷酸和多核苷酸可以互换地使用。 0030 本公开也包括上述片段的明显或普通的变体， 这些

28、变体具有无意义的氨基酸取代 (由此具有与天然序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列)， 只要这种变体具有与上述衍生物 的活性实质相同的活性。 明显或普通取代的例子包括一个碱基残基取代为另一个(即， Arg 取代为Lys)， 一个疏水性残基取代为另一个(即， Leu取代为Ile)， 或者一个芳香族残基取代 为另一个(即， Phe取代为Tyr)等等。 附图说明 0031 参考附图阐述详细的说明。 在图中， 附图标记最左侧的数字表示附图标记首先出 说 明 书 4/13 页 6 CN 106456696 A 6 现的图。 不同图中相同附图标记的使用表明相似或相同的项或特征。 0032 图1是根据本公开的嵌合

29、蛋白质的透视图。 0033 图2是图示， 示例了根据本公开细胞中不同嵌合蛋白质的表达效果。 0034 图3是图示， 示例了根据本公开具有不同宿主肽和Bid的BH3结构域的嵌合蛋白质 对SW620细胞的细胞程序死亡的效果。 0035 图4是图示， 示例了根据本公开具有钙结合蛋白D9k宿主肽和来自于不同BH3-only 蛋白质的BH3结构域的嵌合蛋白质对SW620细胞的细胞程序死亡的效果。 0036 图5示例了根据本公开嵌合蛋白质与叶酸缀合的效果。 0037 图6是图示， 示例了根据本公开癌症中叶酸受体的表达。 0038 图7是图示， 示例了根据本公开具有钙结合蛋白D9k宿主肽、 来自于Bid或B

30、im的BH3 结构域和缀合叶酸的嵌合蛋白质对SW620细胞的效果。 0039 图8是图示， 示例了根据本公开用不同浓度的嵌合蛋白质D-Bid处理SW620细胞， 该 嵌合蛋白质具有二硫键合(S-S)叶酸缀合物。 0040 图9是图示， 示例了根据本公开具有钙结合蛋白D9k宿主肽、 来自于不同BH3-only 蛋白质的BH3结构域和缀合叶酸的嵌合蛋白质对A549、 SW620和KB细胞的效果。 0041 图10A示例了根据本公开具有/不具有叶酸缀合， 或者具有二硫键(SS)或马来酰亚 胺(Mal)缀合的嵌合蛋白质(D-Bid)对SW620细胞的异种移植肿瘤的效果(终点肿瘤大小)。 0042 图1

31、0B是图示， 示例了根据本公开具有/不具有叶酸缀合， 或者具有二硫键(SS)或 马来酰亚胺(Mal)缀合的嵌合蛋白质(D-Bid)对SW620细胞的异种移植肿瘤的效果(肿瘤生 长曲线)。 0043 图10C是图表， 示例了根据本公开具有/不具有叶酸缀合， 或者具有二硫键(SS)或 马来酰亚胺(Mal)缀合的嵌合蛋白质(D-Bid)对SW620细胞的异种移植肿瘤的效果(终点肿 瘤重量)。 0044 图11A示例了根据本公开多臂PEG化试剂缀合嵌合蛋白质。 0045 图11B是图示， 示例了根据本公开通过多臂PEG化试剂缀合不同数量的嵌合蛋白质 D-Nox的单叶酸的效果(肿瘤生长曲线)。 0046

32、 图12是图示， 示例了根据本公开通过多臂PEG化试剂缀合不同数量的嵌合蛋白质 D-Nox的单叶酸的效果(终端肿瘤重量)。 0047 图13是图示， 示例了根据本公开通过多臂PEG化试剂缀合不同数量的嵌合蛋白质 D-Nox的单叶酸的效果。 0048 图14是图示， 示例了根据本公开放射治疗与嵌合蛋白质对SW620细胞的协同效果， 该嵌合蛋白质包含钙结合蛋白D9k宿主肽和不同BH3-only蛋白质的BH3结构域。 0049 图15是图示， 示例了根据本公开奥沙利铂与嵌合蛋白质对SW620细胞的协同效果， 该嵌合蛋白质包含钙结合蛋白D9k宿主肽和不同BH3-only蛋白质的BH3结构域。 0050

33、 图16是图示， 示例了根据本公开用嵌合蛋白质处理Raw264.7细胞， 即， 巨噬细胞， 该嵌合蛋白质包含钙结合蛋白D9k宿主肽和不同BH3-only蛋白质的BH3结构域。 具体实施方式 0051 在更详细地描述本公开之前， 要理解本公开不限于所描述的特定实施方式， 并且 说 明 书 5/13 页 7 CN 106456696 A 7 正因为如此当然可以变化。 也要理解这里所用的术语目的仅仅是描述特定的实施方式， 并 且不意欲是限制性的， 因为本公开的范围将仅受所附权利要求的限制。 0052 如一旦阅读该公开将对本领域技术人员而言显而易见， 这里所描述和示例的单独 实施方式中每个都有可以容易

34、地从其它几个实施方式中任何实施方式中的特征分离或者 与其组合的分立的构成和特征， 而不背离本公开的范围或精神。 按照所述事件的顺序或者 按照逻辑地可能的任何其它顺序， 可以实施任何所述的方法。 0053 除非另外说明， 本公开的实施方式将利用药物学、 有机化学、 生物化学、 分子生物 学、 药理学等等的技术， 这些技术在本领域技术内。 在文献中充分地解释了这些技术。 0054 可以对本公开的肽的结构进行修改和改变， 并且仍旧获得与肽具有相似特征的分 子(例如， 保守性氨基酸取代)。 例如， 序列中一些氨基酸可以被取代为其它氨基酸， 而不会 有明显的活性损失。 因为肽的相互作用能力和性质限定了肽

35、的生物学功能活性， 所以可以 在肽序列中进行一些氨基酸序列取代， 并且仍然获得具有相似特性的肽。 0055 在进行这种改变中， 可以考虑氨基酸的亲水性指数。 本领域通常理解在给予相互 作用生物功能中亲水性氨基酸指数对肽的重要性。 已知一些氨基酸可以被取代为具有相似 亲水性指数或记分的其它氨基酸， 并且仍旧产生具有相似生物学活性的肽。 每种氨基酸基 于它的疏水性和电荷特性， 都已经被分配了亲水性指数。 这些指数是： 异亮氨酸(+4.5)、 缬 氨酸(+4.2)、 亮氨酸(+3.8)、 苯丙氨酸(+2.8)、 半胱氨酸(+2.5)、 甲硫氨酸(+1.9)、 丙氨酸(+ 1.8)、 甘氨酸(-0.4

36、)、 苏氨酸(-0.7)、 丝氨酸(-0.8)、 色氨酸(-0.9)、 酪氨酸(-1.3)、 脯氨酸 (-1.6)、 组氨酸(-3.2)、 谷氨酸(-3.5)、 谷氨酰胺(-3.5)、 天冬氨酸(-3.5)、 天冬酰胺(- 3.5)、 赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。 0056 认为氨基酸的相对亲水特性决定所得到肽的二级结构， 这接着限定肽与其它分 子， 诸如酶、 底物、 受体、 抗体、 抗原等等的相互作用。 本领域已知氨基酸可以被具有相似亲 水性指数的另一种氨基酸所取代， 并且仍旧获得功能等同的肽。 在这种变化中， 优选其亲水 指数在2内的氨基酸取代， 特别地优选在1内的氨基酸取代，

37、 以及甚至更特别地优选在 0.5内的氨基酸取代. 0057 基于亲水性也可以进行相似氨基酸的取代， 特别地， 其中由此产生的生物学功能 等同的肽意欲用在免疫学实施方式中。 下列亲水性数值已经被分配给氨基酸残基： 精氨酸 (+3.0)、 赖氨酸(+3.0)、 天冬氨酸(+3.01)、 谷氨酸(+3.01)、 丝氨酸(+0.3)、 天冬酰胺(+ 0.2)、 谷氨酰胺(+0.2)、 甘氨酸(0)、 脯氨酸(-0.51)、 苏氨酸(-0.4)、 丙氨酸(-0.5)、 组氨 酸(-0.5)、 半胱氨酸(-1.0)、 甲硫氨酸(-1.3)、 缬氨酸(-1.5)、 亮氨酸(-1.8)、 异亮氨酸(- 1.8

38、)、 酪氨酸(-2.3)、 苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。 理解氨基酸可以被取代为具有相似 亲水性数值的另一种氨基酸， 并且仍旧获得生物学等同的， 并且特别地免疫等同的肽。 在这 种变化中， 优选其亲水性数值在2内的氨基酸取代， 特别地优选在1内的氨基酸取代， 并 且甚至更特别地优选0.5内的氨基酸取代. 0058 如上所概述的， 氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性， 例如， 它们 的疏水性、 亲水性、 电荷、 大小等等。 本领域技术人员公知考虑各种前述特征的示例性取代， 并且该示例性取代包括(原始残基： 示例性取代)： (Ala:Gly,Ser)、 (Arg:Lys)

39、、 (Asn:Gln, His)、 (Asp:Glu,Cys,Ser)、 (Gln:Asn)、 (Glu:Asp)、 (Gly:Ala)、 (His:Asn,Gln)、 (Ile:Leu, Val)、 (Leu:Ile,Val)、 (Lys:Arg)、 (Met:Leu,Tyr)、 (Ser:Thr)、 (Thr:Ser)、 (Trp:Tyr)、 说 明 书 6/13 页 8 CN 106456696 A 8 (Thr:Trp,Phe)和(Val:Ile,Leu)。 0059 这里互换地使用术语 “受试者” 、“个体” 、“患者” 和 “宿主” ， 并且指任何脊椎动物、 特别地任何哺乳动物，

40、并且最特别地包括人类受试者、 农场动物和哺乳动物的宠物。 受试者 可以是， 但是不必一定是在健康护理专业人员， 诸如医生或兽医护理下， 并且可以需要本公 开的组合物的治疗性处理。 0060 如这里所用的术语 “稳定性” 指一旦储存和暴露于将要失活条件， 包括但不限于氧 化、 热变性、 肽切割等等， 肽基本上保留其物理和化学稳定性和完整性， 并且与肽还没有受 到这种条件时相比较， 这些条件将明显地减小或排除肽的生物学活性或结构完整性。 0061 如这里所用的术语 “载体” 意指用作载体的DNA分子， 其能够稳定地携带外源基因 到宿主细胞中。 对于有用的应用， 载体应该是可复制的， 具有用于将其本

41、身引入到宿主细胞 中的系统， 并且具有可筛选标记。 0062 本公开通常地提供一种蛋白质， 特别地在体内环境中的蛋白质， 当给药为治疗药 剂时具有延长的半衰期和延长的有效性。 每个蛋白质包括连接另一个更稳定第二肽的第一 肽， 因此形成融合肽， 该融合肽的第二肽的稳定性给予了第一肽。 例如， 第一肽可以取代第 二肽的结构域， 诸如 -螺旋结构域， 而还保持其生物学活性。 0063 图1示例了嵌合蛋白质， 其具有连接第二肽的第一/宿主肽， 因此形成融合蛋白质， 该融合蛋白质的第二肽的稳定性给予了第一肽。 蛋白质可以是诱导细胞程序死亡的药剂， 癌症治疗药剂和/或用于抑制癌症转移的药剂。 0064 第

42、一/宿主肽可以是钙结合蛋白D9k( “D” )、 钙调蛋白( “Ca” )的N-末端或C-末端半 结构域、 小清蛋白( “Pa” )， 它们的氨基酸序列变体或者是它们的修饰变体。 而且， 宿主肽可 以是人类来源。 第二肽是不同BH3-only蛋白 质的BH3结构域肽， 诸如， 例如， Bim (DMRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYAR)、 Bid(EDIIRNIARHLAQVGDSMDRSIPP)、 Bad (NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKK)、 Bik(CMEGSDALALRLACIADQFHRLHT) ,Bmf (LQHRAEVQIARKLQCIADQFHRLH

43、T) ,Hrk(LRSSAAQLTAARLKALGDELHQRTM)、 Puma (EEQWAREIGAQLRRMADDLNAQYER)和Noxia(PAELEVECATQLRRFGDKLNFRQKLL)。 所得到的接枝或 嵌合蛋白质保留了没有与其连接的BH3结构域的原始蛋白质的生物物理/生物化学特性， 并 且可以诱导癌细胞或其它细胞的细胞程序性死亡。 而且， 蛋白质可以包含这里所明确公开 的肽的保守性变体。 0065 在一些情况下， 嵌合蛋白质的第二肽可以具有BH3结构域的氨基酸序列， 并且第 一/宿主肽可以具有是人类蛋白质一部分的氨基酸序列(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10

44、)， 说 明如下： 0066 D-Bim(Sequence Id No.1) 0067 说 明 书 7/13 页 9 CN 106456696 A 9 0068 D-Bid(Sequence Id No.2) 0069 0070 Ca-Bim(Sequence Id No.3) 0071 0072 Ca-Bid(Sequence Id No.4) 0073 0074 D-Bim1(Sequence Id No.5) 0075 0076 D-Bad(Sequence Id No.6) 0077 0078 D-Puma(Sequence Id No.7) 说 明 书 8/13 页 10 CN 10

45、6456696 A 10 0079 0080 D-Nox(Sequence Id No.8) 0081 0082 PaN-Bid(Sequence Id No.9) 0083 0084 PaC-Bid(Sequence Id No.10) 0085 0086 鉴定宿主蛋白质中 -螺旋区段， 其具有与选定的BH3结构域的长度相似的长度， 即 残基数， 并且置换位点位于邻近选定的 -螺旋区段的环中。 BH3结构域序列置换一部分选定 的环， 即， 环的几个氨基酸被BH3结构域的末端序列置换。 所得到的嵌合蛋白质构造可以通 过基于网络的蛋白质结构建模/预测程序被计算机模拟， 以基于例如， BH3结构域

46、的稳定性 和表面暴露发现最好的分析。 0087 基于遗传工程和蛋白质工程技术， 嵌合蛋白质或嵌合纳米颗粒通过结合BH3结构 域变体和宿主蛋白质， 包括具有各种功能性的蛋白质。 例如， BH3结构域肽可以接枝到稳定 的人类宿主蛋白质， 例如钙结合蛋白D9K、 钙调蛋白半结构域或者人类小清蛋白， 基于接枝 BH3结构域肽到稳定的宿主蛋白质将稳定肽和整个蛋白质的二级结构。 在另一个实施例中， 钙结合蛋白D9K宿主蛋白质或其部分包含BH3肽。 通过置换C-末端螺旋， BH3肽接枝到钙结合 说 明 书 9/13 页 11 CN 106456696 A 11 蛋白D9K宿主蛋白质中。 因此， 根据本公开的

47、蛋白质药剂可以用于治疗癌症和靶向到特定的 癌细胞。 例如， 具有BH3肽的嵌合蛋白质可以诱导靶细胞， 例如癌细胞的细胞程序死亡。 0088 图2示例了细胞中不同嵌合蛋白质的表达效果。 实验的所有的BH3结构域在细胞中 表达时， 在诱导细胞的细胞程序死亡中是有效的。 在标明的细胞中表达标明的蛋白质。 通过 使用抗单独宿主蛋白质的抗体的免疫印迹确认了表达水平。 通过所标明蛋白质的外源表达 后48小时细胞计数， 测量细胞生存力。 载体( “Vec” )表达细胞用作参考(100细胞生存力)。 误差直方图表示5次重复实验之间的标准偏差。 0089 图3示例了具有不同宿主肽和Bid的BH3结构域的嵌合蛋白

48、质对SW620细胞的细胞 程序死亡的效果。 如所示， 在诱导细胞程序死亡中， 钙结合蛋白D9k是最有效的宿主肽。 用5 M标明的蛋白质处理SW620细胞。 蛋白质通过二硫键经由5kDaPEG缀合到叶酸。 通过用标明的 蛋白质处理后48小时细胞计数， 测量细胞生存力。 缓冲液处理的细胞用作参考(100细胞 生存力)。 误差直方图表示5次重复实验之间的标准偏差。 0090 图4示例了具有钙结合蛋白D9k宿主肽和不同BH3结构域的嵌合蛋白质对SW620细 胞的细胞程序死亡的效果。 如所示， 在诱导细胞程序死亡中， 包含Noxia( “Nox” )的BH3结构 域的嵌合蛋白质是最有效的。 用5 M标明的蛋白质处理SW620细胞。 蛋白质通过二硫键经由 5kDa PEG缀合到叶酸。 通过用标明的蛋白质处理后48小时细胞计数， 测量细胞生存力。 缓冲 液处理的细胞用作参考(100细胞生存力)。 误差直方图表示5次重复实验之间的标准偏 差。 0091 嵌合蛋白质可以包含靶向部分， 诸如， 例如叶酸。 在靶向嵌合蛋白质到具有一个或 多个叶酸受体的细胞中或表达过量叶酸受体的细胞中， 叶酸的用途是有益的。 叶酸可以通 过S-S键、 二硫桥或另一种类型的共价键， 经由例如Cys残基附着到蛋白质。 用二硫键， 总的 连接性是R-S-S-R。 二硫桥的使用改善了