降低5HT2BR含量和抑制其活性的物质在制备治疗和预防动脉粥样硬化产品中的应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610049371.8 (22)申请日 2016.01.25 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105561313 A (43)申请公布日 2016.05.11 (73)专利权人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号北 京大学 (72)发明人 汪南平 刘雅涵 王志鹏 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (51)Int.Cl. A61K 45/06(2006.01) A61P 9/10(200

2、6.01) (56)对比文件 CN 102573993 A,2012.07.11, CN 103467596 A,2013.12.25, 温绍君等.5-羟色胺2受体拮抗剂对血管系 统的作用研究进展. 中华内科杂志 .2004,第43 卷(第4期),第314-315页. Habib Abul Muntasir等.Identification of a Key Amino Acid of the Human 5-HT2B Serotonin Receptor Important for Sarpogrelate Binding. J Pharmcol Sci .2007,第274-277页. 审查

3、员 于莉 (54)发明名称 降低5-HT2BR含量和抑制其活性的物质在制 备治疗和预防动脉粥样硬化产品中的应用 (57)摘要 本发明公开了降低5-HT2BR含量和抑制其活 性的物质在制备治疗和预防动脉粥样硬化产品 中的应用。 实验证明， 降低5-HT2BR表达水平的5- HT2BR特异性拮抗剂可以抑制平滑肌细胞的迁 移， 可以降低动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的 含量， 可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成； 提高 5-HT2BR表达水平的5-HT2BR特异性激动剂可以 促进平滑肌细胞的迁移。 本发明的5-HT2BR及其 编码基因分别可以作为治疗和/或预防动脉粥样 硬化病变的靶标蛋白和靶标基因， 降低

4、5-HT2BR 表达水平或抑制其活性的物质可以用来治疗和 预防动脉粥样硬化所致疾病， 也可以用来制备治 疗和/或预防动脉粥样硬化所致疾病的药物。 权利要求书1页 说明书8页 序列表5页 附图8页 CN 105561313 B 2018.12.25 CN 105561313 B 1.降低动物机体中5-HT2BR含量的物质在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化产品或由 动脉粥样硬化所致疾病的产品中的应用； 所述降低动物机体中5-HT2BR含量的物质为5- HT2BR特异性拮抗剂； 所述5-HT2BR特异性拮抗剂为RS127445或LY272015。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述产品

5、为药物； 和/或， 所述动物机体为 动脉。 3.根据权利要求2所述应用， 其特征在于： 所述动脉为主动脉、 主动脉分支、 冠状动脉、 颈动脉、 脑动脉、 肾动脉、 肠系膜动脉、 肺动脉或四肢动脉。 4.根据权利要求1-3中任一所述的应用， 其特征在于： 所述由动脉粥样硬化所致疾病为 血管平滑肌细胞异常或总胆固醇或总甘油三酯含量的异常引发的疾病； 所述动脉粥样硬化 为血管平滑肌细胞异常或总胆固醇或总甘油三酯含量的异常引发的动脉粥样硬化。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述血管平滑肌细胞异常为所述血管平滑 肌细胞的迁移、 增殖和/或表型转换； 和/或， 所述总胆固醇或总甘油三酯含量

6、为血浆中总胆 固醇或总甘油三酯含量。 6.根据权利要求1-3中任一所述的应用， 其特征在于： 所述由动脉粥样硬化所致疾病为 冠心病。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105561313 B 2 降低5-HT2BR含量和抑制其活性的物质在制备治疗和预防动 脉粥样硬化产品中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医学领域中降低5-HT2BR含量和抑制其活性的物质在制备治疗和 预防动脉粥样硬化产品中的应用。 背景技术 0002 动脉粥样硬化是由于脂肪、 血栓、 结缔组织和碳酸钙在血管(主要是动脉)沉积所 造成的一种对人体有害的状态， 它是一种危害人类健康的高发病、 高死亡、 高致残的重大

7、疾 病， 这种疾病会引发患者心肌梗塞、 中风甚至死亡。 动脉粥样硬化是机制不明的多因素复杂 过程， 造成血管内膜增厚， 脂质富集并形成斑块。 目前一种有争议的理论是认为血管的重要 组成成分平滑肌细胞导致了斑块的生长， 平滑肌细胞在损伤因子刺激下发生表型转化， 并从血管中膜向内膜迁移、 增殖； 部分转化为泡沫细胞并产生细胞外基质， 从而导致斑块形 成和血管管腔的狭窄。 0003 五羟色胺(5-HT)是一种单胺类神经递质， 90的5-HT来源于肠嗜铬细胞， 调控肠 蠕动。 其余来自中枢系统的血清素能神经元， 调控情绪、 食欲和睡眠。 血小板是5-HT的储存 场所， 当血小板遇到凝块时， 5-HT被

8、释放， 引起血管收缩， 帮助血液凝集。 5-HT的功能是由5- HT受体介导的， 5-HT受体具有7个家族(5-HT1R-5-HT7R)， 14种亚型受体。 除5-HT3R是配体阳 离子通道外， 其余5-HT受体均为G-蛋白偶联受体(Gprotein-coupled receptor,GPCR)。 5- HT2受体(5-HT2R)包括5-HT2A受体(5-HT2AR)、 5-HT2B受体(五羟色胺2B受体， 5-HT2BR)和5- HT2C受体(5-HT2CR)三种亚型。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是如何治疗和/或预防动脉粥样硬化以及动脉粥样硬 化所致疾病。 0005 为解决

9、上述技术问题， 本发明首先提供了降低动物机体中5-HT2BR含量的物质或/ 和抑制动物机体中5-HT2BR活性的物质在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化产品或由动脉 粥样硬化所致疾病的产品中的应用。 0006 上述应用中， 所述降低动物机体中5-HT2BR含量的物质可为降低动物机体中5- HT2BR编码基因表达的物质， 如通过RNA干扰的方法或通过调控可调节5-HT2BR编码基因表 达的因子来降低动脉血管中5-HT2BR编码基因表达的物质。 0007 上述应用中， 所述降低动物机体中5-HT2BR含量的物质或所述抑制动物机体中5- HT2BR活性的物质可为5-HT2BR拮抗剂(如LY272015或

10、RS127445)。 LY272015具体可为Tocris Bioscience公司产品， 货号为3077； RS127445具体可为Tocris Bioscience公司产品， 货号 为2993。 0008 上述应用中， 所述产品可为治疗和/或预防动脉粥样硬化或由动脉粥样硬化所致 疾病的药物。 说 明 书 1/8 页 3 CN 105561313 B 3 0009 上述应用中， 所述动物机体可为所述动物的各种部位， 如动脉。 所述动脉可为主动 脉、 主动脉分支、 冠状动脉、 颈动脉、 脑动脉、 肾动脉、 肠系膜动脉、 肺动脉或四肢动脉。 0010 上述应用中， 所述动脉粥样硬化所致疾病可为血

11、管平滑肌细胞异常或总胆固醇或 总甘油三酯含量的异常引发的疾病； 所述动脉粥样硬化可为血管平滑肌细胞异常或总胆固 醇或总甘油三酯含量的异常引发的动脉粥样硬化。 所述血管平滑肌细胞异常可为所述血管 平滑肌细胞的迁移、 增殖和/或表型转换。 所述总胆固醇或总甘油三酯含量可为血浆中总胆 固醇或总甘油三酯含量。 所述总胆固醇或总甘油三酯含量的异常可为血浆中总胆固醇或总 甘油三酯含量升高。 0011 上述应用中， 所述动脉粥样硬化所致疾病可为冠心病。 0012 为解决上述技术问题， 本发明还提供了下述任一用途： 0013 H1)所述降低动物机体中5-HT2BR含量的物质或所述抑制动物机体中5-HT2BR活

12、性 的物质在治疗和/或预防动脉粥样硬化或由动脉粥样硬化所致疾病中的应用； 0014 H2)所述降低动物机体中5-HT2BR含量的物质或所述抑制动物机体中5-HT2BR活性 的物质在制备抑制平滑肌细胞迁移产品中的应用； 0015 H3)所述降低动物机体中5-HT2BR含量的物质或所述抑制动物机体中5-HT2BR活性 的物质在抑制平滑肌细胞迁移中的应用； 0016 H4)5-HT2BR作为靶标蛋白在治疗和/或预防动脉粥样硬化或由动脉粥样硬化所致 疾病中的应用； 0017 H5)5-HT2BR的编码基因作为靶标基因在治疗和/或预防动脉粥样硬化或由动脉粥 样硬化所致疾病中的应用； 0018 H6)5-

13、HT2BR或5-HT2BR激动剂在制备动脉粥样硬化模型中的应用。 0019 上述用途中， 所述5-HT2BR激动剂可为5-HT2BR特异性激动剂BW723C86。 BW723C86 具体可为Tocris Bioscience公司产品， 货号为1059。 0020 上述用途中， 所述动物机体可为所述动物的各种部位， 如动脉。 所述动脉可为主动 脉、 主动脉分支、 冠状动脉、 颈动脉、 脑动脉、 肾动脉、 肠系膜动脉、 肺动脉或四肢动脉。 0021 上述用途中， 所述动脉粥样硬化所致疾病可为血管平滑肌细胞异常或总胆固醇或 总甘油三酯含量的异常引发的疾病； 所述动脉粥样硬化可为血管平滑肌细胞异常或总

14、胆固 醇或总甘油三酯含量的异常引发的动脉粥样硬化。 所述血管平滑肌细胞异常可为所述血管 平滑肌细胞的迁移、 增殖和/或表型转换。 所述总胆固醇或总甘油三酯含量可为血浆中总胆 固醇或总甘油三酯含量。 所述总胆固醇或总甘油三酯含量的异常可为血浆中总胆固醇或总 甘油三酯含量升高。 0022 上述用途中， 所述动脉粥样硬化所致疾病可为冠心病。 0023 为解决上述技术问题， 本发明还提供了下述X1)或X2)的产品： 0024 X1)治疗和/或预防所述动脉粥样硬化或所述动脉粥样硬化所致疾病的药物， 其活 性成分为所述降低动物机体中5-HT2BR含量的物质或所述抑制动物机体中5-HT2BR活性的 物质；

15、0025 X2)用于治疗和/或预防所述动脉粥样硬化或所述动脉粥样硬化所致疾病的物质 X， 所述物质X为所述降低动物机体中5-HT2BR含量的物质或所述抑制动物机体中5-HT2BR活 性的物质。 说 明 书 2/8 页 4 CN 105561313 B 4 0026 上述产品中， 所述动物机体可为所述动物的各种部位， 如动脉。 所述动脉可为主动 脉、 主动脉分支、 冠状动脉、 颈动脉、 脑动脉、 肾动脉、 肠系膜动脉、 肺动脉或四肢动脉。 0027 上述产品中， 所述动脉粥样硬化所致疾病可为血管平滑肌细胞异常或总胆固醇或 总甘油三酯含量的异常引发的疾病； 所述动脉粥样硬化可为血管平滑肌细胞异常或

16、总胆固 醇或总甘油三酯含量的异常引发的动脉粥样硬化。 0028 上述产品中， 所述血管平滑肌细胞异常可为所述血管平滑肌细胞的迁移、 增殖和/ 或表型转换。 所述总胆固醇或总甘油三酯含量可为血浆中总胆固醇或总甘油三酯含量。 所 述总胆固醇或总甘油三酯含量的异常可为血浆中总胆固醇或总甘油三酯含量升高。 0029 上述产品中， 所述动脉粥样硬化所致疾病可为冠心病。 0030 本发明中， 治疗和/或预防动脉粥样硬化、 治疗和/或预防动脉粥样硬化所致疾病 均可为： 与动脉粥样硬化所致疾病治疗或预防前相比， 动脉粥样硬化斑块数量减少和/或动 脉粥样硬化斑块减小和/或体重下降和/或血浆中总胆固醇和/或总甘油

17、三酯的含量下降。 0031 本发明中， 所述动物可为哺乳动物， 如人。 所述动脉粥样硬化和所述动脉粥样硬化 所致疾病分别可为哺乳动物动脉粥样硬化和动脉粥样硬化所致疾病， 如人的动脉粥样硬化 和动脉粥样硬化所致疾病。 0032 本发明中， 5-HT2BR为离体动物组织中的5-HT2BR， 如人、 小鼠或大鼠离体组织中的 5-HT2BR。 人的5-HT2BR的氨基酸序列为序列1； 小鼠的5-HT2BR的氨基酸序列为序列2； 大鼠 的5-HT2BR的氨基酸序列为序列3。 0033 本发明中的血管平滑肌细胞的表型转换是指血管平滑肌细胞在分化程度较高的 收缩型(分化型)血管平滑肌细胞和分化程度较低的分泌

18、型(未分化型或去分化型)血管平 滑肌细胞间的转换。 0034 实验证明， 本发明的5-HT2BR及其编码基因分别可以作为治疗和/或预防动脉粥样 硬化所致疾病的靶标蛋白和靶标基因。 在RNA和蛋白质水平上， 5-HT2BR在动脉粥样硬化动 物主动脉中的表达水平均显著高于非动脉粥样硬化动物。 降低5-HT2BR表达水平的5-HT2BR 特异性拮抗剂可以抑制平滑肌细胞的迁移， 提高5-HT2BR表达水平的5-HT2BR特异性激动剂 可以促进平滑肌细胞的迁移： 1)在处理24小时， 5-HT2BR特异性激动剂处理后的平滑肌细胞 的迁移距离为221.412.8 m， 分别为未处理和5-HT处理的1.62

19、1倍和0.922倍； 5-HT2BR特 异性拮抗剂处理后的平滑肌细胞的迁移距离为133.710.9 m， 分别为未处理、 5-HT和5- HT2BR特异性激动剂处理的0.979倍、 0.557倍和0.604倍。 2)在处理24小时， 5-HT2BR特异性 激动剂处理后的平滑肌细胞的迁移活性为96.8020.63， 分别为未处理和5-HT处理的 2.151倍和0.896倍； 5-HT2BR特异性拮抗剂处理后的平滑肌细胞的迁移活性为52.60 7.467， 分别为未处理、 5-HT和5-HT2BR特异性激动剂处理的1.169倍、 0.487倍和0.543倍。 降 低5-HT2BR表达水平的5-HT

20、2BR特异性拮抗剂可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成： 5-HT2BR 特异性拮抗剂RS127445处理的实验组动物的动脉粥样硬化斑块面积2.7580.456mm2， 显 著小于对照组动物； 5-HT2BR特异性拮抗剂RS127445处理的实验组动物的主动脉瓣斑块面 积为0.1380.022mm2， 显著小于对照组动物。 降低5-HT2BR表达水平的5-HT2BR特异性拮抗 剂可以降低动物的体重以及动物血浆中总胆固醇含量和总甘油三酯含量。 降低5-HT2BR表 达水平的5-HT2BR特异性拮抗剂还可以降低动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的含量： 5- HT2BR特异性拮抗剂处理的实验组动物主动脉瓣斑块

21、中平滑肌细胞占斑块面积的百分比为 说 明 书 3/8 页 5 CN 105561313 B 5 0.1060.023， 为对照动物的0.435倍， 显著低于对照组动物。 5-HT2BR特异性拮抗剂可以 降低动物血浆中总胆固醇含量与总甘油三酯含量： 在处理第12周， 实验组动物血浆中总胆 固醇含量为对照组动物的0.78倍， 实验组动物血浆中总甘油三酯含量为对照组动物的0.61 倍。 0035 实验证明， 本发明的5-HT2BR及其编码基因分别可以作为治疗和/或预防动脉粥样 硬化所致疾病的靶标蛋白和靶标基因。 降低5-HT2BR表达水平的物质可以用来治疗和/或预 防动脉粥样硬化所致疾病， 也可以用

22、来制备治疗和/或预防动脉粥样硬化所致疾病的药物。 附图说明 0036 图1为ApoE-/-小鼠与C57BL/6J小鼠喂养不同食物后主动脉的油红O染色结果。 其 中， A-F图表示ApoE-/-小鼠西方饮食(western diet， WD)喂养12周后斑块油红O染色(说明 动脉粥样硬化动物模型建立成功)。 0037 图2为各组小鼠主动脉中的5-HT2BR的表达情况。 其中， A为在RNA水平上各组小鼠 主动脉中的5-HT2BR的表达情况， B为在蛋白质水平各组小鼠主动脉中的5-HT2BR的表达情 况；“” 表示差异达到显著水平。 0038 图3为各组小鼠主动脉用5-HT2BR抗体进行免疫组化染

23、色的结果。 其中， A为ApoE WD(western diet， 西方饮食)组小鼠主动脉(带有斑块部位)的免疫组化染色结果， A中左下 图为染色结果的局部放大图； B为ApoE WD(western diet， 西方饮食)组小鼠主动脉(不带有 斑块部位)的免疫组化染色结果， B中左下图为染色结果的局部放大图； C为C57小鼠主动脉 免疫组化染色结果， C中左下图为染色结果的局部放大图； D为阴性对照。 0039 图4为小鼠主动脉的免疫荧光染色结果。 其中， 5-HT2BR表示ApoE WD组小鼠主动脉 5-HT2BR抗体的免疫荧光染色结果； SMA表示ApoE WD组小鼠主动脉 -SMA抗体

24、的免疫荧光染 色结果； DAPI表示ApoE WD组小鼠主动脉细胞核染色结果； Merge表示5-HT2BR、 SMA和DAPI的 叠加； NC表示negtive control(阴性对照)。 0040 图5为不同处理平滑肌细胞迁移的细胞划痕实验结果。 其中， A为不同处理平滑肌 细胞迁移情况， B为不同处理平滑肌细胞的迁移距离；“” 表示差异达到显著水平。 0041 图6为不同处理平滑肌细胞迁移的trans-well实验结果。 其中， A为不同处理平滑 肌细胞迁移情况， B为不同处理平滑肌细胞的迁移活性；“” 表示差异达到显著水平。 0042 图7为RS127445对动脉粥样硬化模型小鼠动脉

25、粥样硬化斑块的影响。 其中， A为 RS127445处理后小鼠的主动脉粥样硬化斑块； B为RS127445处理后小鼠的主动脉粥样硬化 斑块的具体测量值； C为RS127445处理后小鼠的主动脉瓣动脉粥样硬化斑块； D为RS127445 处理后小鼠的主动脉瓣动脉粥样硬化斑块的具体测量值。 RS127445表示实验组， velhicle 表示对照组。“” 表示差异达到显著水平。 0043 图8为RS127445对动脉粥样硬化模型小鼠体重以及血浆中总胆固醇含量和总甘油 三酯含量的影响。 其中， A为RS127445对体重的影响， B为RS127445对血浆中总胆固醇含量的 影响， C为RS12744

26、5对血浆中总甘油三酯含量的影响。 RS127445表示实验组， velhicle表示 对照组。“” 表示差异达到显著水平。 0044 图9为RS127445对动脉粥样硬化模型小鼠平滑肌细胞的影响。 其中， A为免疫荧光 染色结果， lumen表示主动脉血管腔， RS127445表示实验组， velhicle表示对照组； B为平滑 说 明 书 4/8 页 6 CN 105561313 B 6 肌细胞占斑块面积的百分比， RS表示实验组， V表示对照组，“” 表示差异达到显著水平。 SMA表示 -SMA抗体的免疫荧光染色结果； DAPI表示细胞核染色结果； Merge表示SMA和DAPI 的叠加；

27、 NC表示negtive control(阴性对照)。 0045 图10为RS127445对动脉粥样硬化模型小鼠中5-HT2BR表达水平的影响。 其中， A为 在RNA水平上主动脉中的5-HT2BR的表达情况； B为利用western-blot对5-HT2BR表达情况的 检测结果； C为利用免疫组化染色对5-HT2BR表达情况的检测结果， C1为Velhicle图的局部 放大图， C2为RS127445图的局部放大图。 RS127445表示实验组， Velhicle表示对照组，“” 表示差异达到显著水平。 具体实施方式 0046 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例

28、仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 0047 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0048 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0049 下述实施例中的ApoE-/-小鼠是Jackson Lab公司产品， 货号为002052； 下述实施 例中的C57BL/6J小鼠是Jackson Lab公司产品， 货号为000664。 0050 实施例1、 5-HT2BR在动脉粥样硬化小鼠主动脉中高表达 0051 1、 动脉粥样硬化模型的建立 0052 将20只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠随机分为两组， 分别为ApoE CD(cho

29、w diet， 正常 饮食)组和ApoE WD(western diet， 西方饮食)组， 每组10只； 将20只8周龄的雄性C57BL/6J 小鼠随机分为两组， 分别为C57CD组和C57WD组， 每组10只。 分别对ApoE CD组和C57CD组中的 每只小鼠进行正常喂养； 分别对ApoE WD组和C57WD组中的每只小鼠进行高脂喂养， 喂养食 物为western diet(西方饮食， Research Diet公司， D12079B)。 0053 喂养12周后分别取各组小鼠的主动脉分别进行油红O染色， 结果显示， ApoE WD组 小鼠动脉血管中形成斑块(图1)， 表明成功建立了动脉粥样

30、硬化模型。 0054 2、 动脉粥样硬化模型中5-HT2BR的表达情况检测 0055 在步骤1的四组小鼠用不同食物喂养12周后， 在RNA水平上检测主动脉中的5- HT2BR的表达情况(图2中A)， 引物为GGAGAAAAGGCTGCAGTACG和ATAACCAGGCAGGACACAGG， 内参 为 -actin， 内参的引物为ATCGTGGGCCGCCCTAGGCACC和CTCTTTAATGTCACGCACGATTTC。 结果显 示， 在RNA水平上， C57CD组和C57WD组小鼠主动脉中的5-HT2BR表达基本无差异， ApoE CD组 和ApoE WD组小鼠主动脉中的5-HT2BR均高

31、表达， 均分别显著高于C57CD组小鼠主动脉中的 5-HT2BR表达水平。 0056 在步骤1的四组小鼠用不同食物喂养12周后， 利用western-blot在蛋白质水平上 检测主动脉中的5-HT2BR的表达情况(图2中B)， 一抗为5-HT2BR抗体(BDPharmingen， 556334， 5-HT2BR抗体可以识别序列2所示的5-HT2BR)， 内参为 -actin， 内参的抗体为 (Santa Cruz， sc-47778)。 结果显示， 在蛋白质水平上， C57CD组和C57WD组小鼠主动脉中的 5-HT2BR表达水平较低， 而ApoE CD组和ApoE WD组小鼠主动脉中的5-H

32、T2BR均高表达。 0057 在步骤1的四组小鼠用不同食物喂养12周后， 取主动脉进行血管横切面冰冻切片， 用5-HT2BR抗体进行免疫组化染色(图3)。 ApoE-/-小鼠高脂喂养12周后形成动脉粥样硬化 说 明 书 5/8 页 7 CN 105561313 B 7 模型(AS)， 与正常饮食的C57BL/6J小鼠相比， 5-HT2BR在血管中膜和斑块位置表达增加。 0058 在步骤1的四组小鼠用不同食物喂养12周后， 利用小鼠主动脉流出道斑块冰冻切 片进行免疫荧光染色， 使用5-HT2BR抗体(BD Pharmingen， 556334)(5-HT2BR抗体被Alexa Fluor 555

33、dye标记)对5-HT2BR进行定位， 使用 -SMA抗体(abcam， ab5649)( -SMA抗体被 Alexa Fluor 488dye标记)对平滑肌细胞进行定位( -SMA基因为平滑肌细胞的标志基因)， 并用DAPI染剂对细胞核进行定位。 结果(图4)显示， 5-HT2BR定位于斑块平滑肌细胞。 0059 实施例2、 5-HT2BR拮抗剂可以抑制平滑肌细胞的迁移及动脉粥样硬化斑块的形成 0060 1、 5-HT2BR及其拮抗剂对于平滑肌细胞迁移功能的影响 0061 利用细胞划痕和trans-well实验检测5-HT2BR对于平滑肌细胞迁移功能的影响， 实验重复三次。 0062 细胞划

34、痕实验过程如下： 大鼠主动脉平滑肌细胞在含有无血清DMEM中培养24小时 后， 用无菌加样器吸头刮擦细胞表面， 形成0.5mm宽损伤无细胞区域， 在无血清培养条件下 加入5-HT、 5-HT2BR特异性激动剂BW723C86或5-HT2BR特异性拮抗剂LY272015+5-HT处理细 胞， 在处理0、 3、 6、 12和24小时， 应用相差显微镜照相， 并测量损伤区域两边细胞间距， 以愈 合的速度来表示细胞迁移能力的改变。 其中BW723C86和LY272015为Tocris Bioscience公 司产品， 货号分别为1059和30772； 5-HT为Sigma-Aldrich公司产品， 货

35、号为H9523； 大鼠主动 脉平滑肌细胞为SD大鼠原代培养细胞。 0063 结果如图5所示， 结果显示， 5-HT和5-HT2BR特异性激动剂BW723C86可以促进平滑 肌细胞的迁移， 而5-HT2BR特异性拮抗剂LY272015抑制5-HT引起的细胞迁移： 在处理24小 时， 对照组(ctrl)中平滑肌细胞的迁移距离为136.67.8 m； 5-HT处理后的平滑肌细胞的 迁移距离为240.221.3 m； BW723C86处理后的平滑肌细胞的迁移距离为221.412.8 m， 分别为对照组和5-HT处理的1.621倍和0.922倍； LY272015处理后的平滑肌细胞的迁移距离 为133.

36、710.9 m， 分别为对照组、 5-HT和BW723C86处理的0.979倍、 0.557倍和0.604倍。 0064 trans-well实验过程如下： 大鼠主动脉平滑肌细胞经胰蛋白酶消化， 用含胰蛋白 酶抑制剂(1mg/ml)的DMEM收集， 培养于纤维粘连素包被的Boyden小室中(4104个细胞/ 孔)， 同步化后， 下室中加入含有PDGF-BB(10ng/ml)和不同处理(5-HT、 5-HT2BR特异性激动 剂BW723C86或5-HT2BR特异性拮抗剂LY272015+5-HT)的无血清DMEM， (PDGF-BB为平滑肌细 胞迁移的趋化剂)， 37孵育24小时。 用棉签擦除上

37、层小室内面细胞， 底层细胞用4多聚甲 醛固定20分钟， 经苏木素染色， 倒置显微镜下(200)随机取6个视野观察， 计数细胞数。 另 用0.1的结晶紫染色， 观察细胞迁移数量， 即迁移活性。 0065 结果如图6所示， 结果显示， 5-HT和5-HT2BR特异性激动剂BW723C86可以促进平滑 肌细胞的迁移， 而5-HT2BR特异性拮抗剂LY272015抑制5-HT引起的细胞迁移： 在处理24小 时， 对照组(ctrl)中平滑肌细胞的迁移活性为45.007.918； 5-HT处理后的平滑肌细胞的 迁移活性为108.017.87； BW723C86处理后的平滑肌细胞的迁移活性为96.8020.

38、63， 分 别为对照组和5-HT处理的2.151倍和0.896倍； LY272015处理后的平滑肌细胞的迁移活性为 52.607.467， 分别为对照组、 5-HT和BW723C86处理的1.169倍、 0.487倍和0.543倍。 0066 表明， 5-HT2BR介导了5-HT引起的平滑肌细胞迁移， 并且5-HT2BR拮抗剂可以抑制 平滑肌细胞的迁移。 0067 2、 5-HT2BR拮抗剂可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成 说 明 书 6/8 页 8 CN 105561313 B 8 0068 取10只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠， 随机分为两组， 分别为实验组和对照组， 每组5 只。 对实验

39、组和对照组进行以下处理， 实验重复三次。 0069 对对照组小鼠按照以下方法进行处理： 分别对对照组中的每只小鼠进行高脂喂 养， 喂养食物为western diet(西方饮食， Research Diet公司， D12079B)， 在高脂喂养的第 一天开始连续84天每天每只小鼠腹腔注射velhicle(乙醇:丙二醇:水体积比为10:50: 40)50 l/10g体重， 将第一次注射当周记为处理第1周。 在进行高脂喂养和注射velhicle前 测量体重。 0070 对实验组小鼠按照以下方法进行处理： 分别对对照组中的每只小鼠进行高脂喂 养， 喂养食物为western diet(西方饮食， Res

40、earch Diet公司， D12079B)， 在高脂喂养的第 一天开始连续84天每天每只小鼠腹腔注射拮抗剂溶液(拮抗剂溶液由5-HT2BR特异性拮抗 剂RS127445(Tocris Bioscience 2993)与velhicle组成， RS127445的浓度为1mg/5ml)50 l/10g体重， 将第一次注射当周记为处理第1周。 0071 1)对照组和实验组小鼠分别经相应的处理后， 在处理第12周分别取其主动脉进行 油红O染色(图7中A)， 并测量动脉粥样硬化斑块的总面积(图7中B)。 结果显示， 注射 RS127445的实验组小鼠的斑块面积小于注射velhicle的对照组小鼠， 注

41、射velhicle的对照 组小鼠的斑块面积为8.0800.735mm2， 注射RS127445的实验组小鼠的斑块面积为2.758 0.456mm2， 显著小于注射velhicle的对照组小鼠。 表明， 5-HT2BR拮抗剂可以抑制动脉粥样 硬化斑块的形成。 0072 2)对照组和实验组小鼠分别经相应的处理后， 在处理第12周分别取其主动脉瓣斑 块进行冰冻切片并进行油红O染色(图7中C)， 并测量主动脉瓣斑块的总面积(图7中D)。 结果 显示， 注射RS127445的实验组小鼠的主动脉瓣斑块面积小于注射velhicle的对照组小鼠， 注射velhicle的对照组小鼠的主动脉瓣斑块面积为0.269

42、0.034mm2， 注射RS127445的实 验组小鼠的主动脉瓣斑块面积为0.1380.022mm2， 显著小于注射velhicle的对照组小鼠。 表明， 5-HT2BR拮抗剂可以抑制主动脉瓣动脉粥样硬化斑块的形成。 0073 3)在对照组和实验组小鼠经相应处理后， 每周测量体重一次(图8中A)。 在 velhicle处理对照组小鼠的第0-7周， 对照组小鼠体重与RS127445处理相应时间的实验组 小鼠体重基本无差异， 在velhicle处理对照组小鼠的第8、 9、 11和12周， 对照组小鼠体重显 著高于RS127445处理相应时间的实验组小鼠体重： velhicle处理第8、 9、 11

43、和12周， 对照组 小鼠的体重分别为29.70.4g、 29.90.4g、 29.80.5g和30.20.5g； RS127445处理第8、 9、 11和12周， 实验组小鼠的体重分别为28.00.4g、 28.20.5g、 27.90.5g和28.1 0.5g。 表明， RS127445可以降低小鼠体重。 0074 4)在对照组和实验组小鼠经相应处理后， 每三周分别测量小鼠血浆中总胆固醇含 量和总甘油三酯含量(图8中B和C、 表1)。 0075 表1、 不同处理的小鼠血浆中的总胆固醇含量和总甘油三酯含量(mg/dL) 说 明 书 7/8 页 9 CN 105561313 B 9 0076 0

44、077 结果显示， 在处理第3-12周， 实验组小鼠血浆中总胆固醇含量分别显著低于相应 处理时间的对照组小鼠， 在处理第12周， 实验组小鼠血浆中总胆固醇含量为对照组小鼠的 0.78倍； 在处理第6-12周， 实验组小鼠血浆中总甘油三酯含量分别显著低于相应处理时间 的对照组小鼠， 在处理第12周， 实验组小鼠血浆中总甘油三酯含量为对照组小鼠的0.61倍。 表明， RS127445可以降低小鼠血浆中总胆固醇和总甘油三酯含量。 0078 5)对照组和实验组小鼠分别经相应的处理后， 分别取其主动脉瓣斑块进行冰冻切 片进行免疫荧光染色， 使用实施例1中的 -SMA抗体对平滑肌细胞进行染色， 并用DAP

45、I染剂 对细胞核进行定位。 0079 实验组小鼠主动脉瓣斑块的平滑肌细胞含量减少(图9)， 对照组小鼠主动脉瓣斑 块中平滑肌细胞占斑块面积的百分比为0.24410.0224， 实验组小鼠主动脉瓣斑块中平 滑肌细胞占斑块面积的百分比为0.10610.0227， 为对照小鼠的0.44倍， 显著低于对照 组小鼠。 表明RS127445在动脉粥样硬化斑块形成过程中， 影响了平滑肌迁移功能。 0080 6)对照组和实验组小鼠分别经相应的处理后， 分别取其主动脉检测5-HT2BR的表 达情况。 0081 按照实施例1中的方法， 在RNA水平上检测主动脉中的5-HT2BR的表达情况(图10中 A)。 结果显

46、示， 在RNA水平上， 对照组小鼠主动脉中的5-HT2BR表达显著高于实验组。 0082 按照实施例1中的方法， 利用western-blot在蛋白质水平上检测5-HT2BR的表达情 况(图10中B)。 结果显示， 在蛋白质水平上， 对照组小鼠主动脉中的5-HT2BR表达高于实验 组。 0083 按照实施例1中的方法， 用5-HT2BR抗体对小鼠主动脉进行免疫组化染色(图10中 C)。 结果显示， 在蛋白质水平上， 对照组小鼠主动脉中的5-HT2BR表达高于实验组。 0084 以上结果表明， RS127445可以抑制5-HT2BR的表达。 说 明 书 8/8 页 10 CN 105561313

47、 B 10 0001 序 列 表 1/5 页 11 CN 105561313 B 11 0002 序 列 表 2/5 页 12 CN 105561313 B 12 0003 序 列 表 3/5 页 13 CN 105561313 B 13 0004 序 列 表 4/5 页 14 CN 105561313 B 14 0005 序 列 表 5/5 页 15 CN 105561313 B 15 图1 图2 说 明 书 附 图 1/8 页 16 CN 105561313 B 16 图3 图4 说 明 书 附 图 2/8 页 17 CN 105561313 B 17 图5 说 明 书 附 图 3/8 页 18 CN 105561313 B 18 图6 说 明 书 附 图 4/8 页 19 CN 105561313 B 19 图7 说 明 书 附 图 5/8 页 20 CN 105561313 B 20 图8 说 明 书 附 图 6/8 页 21 CN 105561313 B 21 图9 说 明 书 附 图 7/8 页 22 CN 105561313 B 22 图10 说 明 书 附 图 8/8 页 23 CN 105561313 B 23