一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗及其应用.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102247606 B (45)授权公告日 2014.07.09 CN 102247606 B (21)申请号 201110135690.8 (22)申请日 2011.05.25 A61K 48/00(2006.01) A61K 39/12(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (73)专利权人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 廖明 陈孝明 亓文宝 臧富玉 李红梅 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 (54)

2、 发明名称 一种基于 DNA 水平的高致病性猪蓝耳病病毒 JEV 复制子疫苗及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种基于 DNA 水平的高致病性 猪蓝耳病病毒 JEV 复制子疫苗及其应用。本发明 是通过引物扩增出高致病性猪蓝耳病病毒 XH 株 的 GP5 和 M 基因， 利用融合 PCR 的方法， 在两个 基因中间插入 FMDV-2A 的序列， 从而得到 G-2A-M 片段， 最后通过 SpeI 和 SalI 两个酶切位点克隆 到 JpJEV-REP ； 另外， 为了使 M 蛋白能够产生真实 的 N 末端， G-2A-M 片段的下游插入了 IRES 序列 （G-2A-M-IRES） ， 最后

3、利用SalI-HF和SpeI两个酶 切位点插入到 pJEV-REP 中， 最终构建基于 JEV 复 制子并且能够表达 GP5 和 M 蛋白的高致病性蓝耳 病疫苗。 (51)Int.Cl. 审查员 李美宣 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 9 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表9页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102247606 B CN 102247606 B 1/1 页 2 1. 一种基于 DNA 水平的高致病性猪蓝耳病病毒 JEV 复制子疫苗， 其特征在于将蓝耳病 的结构基因 GP5 与 M 蛋白插

4、入到基于 DNA 水平的 JEV 复制子 pJEV-REP， 所述 JEV 复制子包 括 CMV 启动子、 5 UTR、 C 蛋白 N 端的前 23 个氨基酸 C23、 E 蛋白 C 端的 NS1 蛋白的信号肽、 所有非结构蛋白编码区、 3 UTR、 核酶、 polyA 序列、 GP5 蛋白编码区、 FMDV-2A 的序列和 M 蛋 白编码区 ； 所述基于 DNA 水平的高致病性猪蓝耳病病毒 JEV 复制子疫苗的构建方法包括如 下步骤 ： 设计引物， 其序列如SEQ ID NO:1928所示， 扩增出高致病性猪蓝耳病病毒XH株的 GP5和M基因， 利用融合PCR的方法， 在两个基因中间插入FM

5、DV-2A的序列， 从而得到G-2A-M 片段， 最后通过 SpeI 和 SalI 两个酶切位点克隆到 JpJEV-REP ； 另外， 为了使 M 蛋白能够产 生真实的 N 末端， G-2A-M 片段的下游插入了 IRES 序列 G-2A-M-IRES， 最后利用 SalI-HF 和 SpeI两个酶切位点插入到pJEV-REP中， 最终构建基于JEV复制子并且能够表达GP5和M蛋 白的高致病性蓝耳病疫苗 ； 所述的IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示 ； 所述的G-2A-M 片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO:30 所示 ； 所述 FMDV-2A 的序列是以 HP PRRS

6、基因 RNA 的反 转录产物为模板， 引物 MF-FMDVF2A-F 与 MR- SalI 扩增出 2A 序列的后 45 个碱基及 M 基因 的完整编码区。 2.权利要求1所述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗在制备生物 制品中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102247606 B 2 1/5 页 3 一种基于 DNA 水平的高致病性猪蓝耳病病毒 JEV 复制子疫 苗及其应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术领域， 具体涉及一种基于 DNA 水平的高致病性猪蓝耳病 病毒 JEV 复制子疫苗及其应用。 背景技术 0002 目前临床应用的 PRRS 疫苗有灭活疫苗和

7、减毒活疫苗。由于灭活疫苗免疫效果不 理想， 而减毒活疫苗又存在毒力返强的可能性。 0003 当前 PRRS 己成为严重危害养猪业的重大传染病之一， 疫苗的免疫接种仍是预防 与控制 PRRS 最有效的措施。目前用于预防 PRRS 的商品化疫苗主要是弱毒苗和灭活疫苗， 但因存在安全隐患或免疫效果差的缺陷， 不能提供理想的免疫保护。 而被誉为 “第三次疫苗 革命” DNA 疫苗是将编码某种抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制之下， 构成重组表达 质粒 DNA， 将其直接导入动物体内， 通过宿主细胞表达加工合成抗原分子， 从而诱导宿主产 生对该抗原蛋白的免疫应答。虽然 DNA 疫苗具备许多优势， 但是

8、却因接种剂量大和存在与 宿主基因组重组的安全隐患在发展受到很多限制。 因此， 研究更安全、 有效的新型疫苗载体 对预防和控制 PRRS 的发生与流行具有重要意义。 发明内容 0004 本发明的目的在于根据现有技术中存在的不足， 提供一种基于 DNA 水平的高致病 性猪蓝耳病病毒 JEV 复制子疫苗。 0005 本发明另一目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子 疫苗的构建方法。 0006 本发明还有一个目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复 制子疫苗的应用。 0007 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现 ： 0008 一种基于 DNA 水平的高

9、致病性猪蓝耳病病毒 JEV 复制子疫苗， 是建立在 JEV 复制 子(pJEV-REP)上的。 所述JEV复制子系统是以改造过的低拷贝质粒pOKM为骨架， 在缺失绝 大部分结构基因 （第 165-2402 核苷酸） 的情况下， 构建包括 CMV 启动子、 5 UTR、 C 蛋白 N 端 的前 23 个氨基酸 (C23)、 E 蛋白 C 端的 NS1 蛋白的信号肽 （E25） 、 所有非结构蛋白、 3 UTR、 核酶 （HDVr） 和 polyA 序列的基于 DNA 水平的 JEV 复制子载体系统。 0009 上述 JEV 复制子系统的构建方法， 包括如下步骤 ： 设计引物， 其序列如 SEQ

10、ID NO:118 所示， 从质粒 pWF-GFP 中扩增片段 A， 再从 JEV 的基因组 RNA 中扩增出片段 B、 C、 D 和片段， 再以片段 A 和 B 为模板， 通过融合 PCR 的方法扩增出片段； 以片段 C 和 D 为模 板， 融合PCR扩增出片段， 将片段 、 和定向克隆到低拷贝质粒中， 得到基于DNA水平 的乙型脑炎病毒复制子载体系统。 说 明 书 CN 102247606 B 3 2/5 页 4 0010 本发明所述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗是将蓝耳病的 结构基因GP5与M蛋白插入到基于DNA水平的JEV复制子(pJEV-REP)中， 包括CMV

11、启动子、 5 UTR、 C 蛋白 N 端的前 23 个氨基酸 (C23)、 E 蛋白 C 端的 NS1 蛋白的信号肽、 所有非结构蛋 白编码区、 3 UTR、 核酶、 polyA 序列、 GP5 蛋白编码区、 FMDV-2A 的序列和 M 蛋白编码区。 0011 上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗的构建方法包括如下 步骤 ： 设计引物， 其序列如 SEQ ID NO:1928 所示， 扩增出高致病性猪蓝耳病病毒 XH 株的 GP5和M基因， 利用融合PCR的方法， 在两个基因中间插入FMDV-2A的序列， 从而得到G-2A-M 片段， 最后通过 SpeI 和 SalI 两

12、个酶切位点克隆到 JpJEV-REP ； 另外， 为了使 M 蛋白能够产 生真实的 N 末端， G-2A-M 片段的下游插入了 IRES 序列 （G-2A-M-IRES） ， 最后利用 SalI-HF 和 SpeI 两个酶切位点插入到 pJEV-REP 中， 最终构建基于 JEV 复制子并且能够表达 GP5 和 M 蛋白的高致病性蓝耳病疫苗。 0012 IRES 的核苷酸序列如 SEQ ID NO:29 所示。 0013 G-2A-M 片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO:30 所示。 0014 本发明上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子能有效表达并能诱 发特异性抗体和细胞免

13、疫反应， 可作为预防高致病性猪蓝耳病的一种新型基因工程疫苗。 0015 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 0016 目前市场普遍存在的蓝耳病疫苗弱毒疫苗， 但减毒活疫苗最大的缺点是存在毒力 返强的可能性， 而传统的基因工程疫苗蛋白表达量低， 免疫原性较差等不足。 而本发明研发 的复制子疫苗不存在活病毒， 因此不存在病毒毒力返强的可能性， 另外， 本发明也证明了与 传统的 DNA 疫苗相比， 本发明的疫苗可以产生更高的抗体和更强的淋巴细胞增殖反应。 附图说明 0017 图 1 为基于 JEV 复制子载体的猪高致病性蓝耳病疫苗的构建图， 其中， A 为 JEV-REP-G-2A-M-I

14、RES ； B 为 pJEV-REP-G-2A-M ； 0018 图2为GP5基因、 M基因及其融合PCR的扩增产物 ； 其中， 1为DNA Marker DL2,000 ； 2 为 GP5 基因 PCR 片段 ； 3 为 M 基因 PCR 片段 ； 4 为 G-2A-M 片段 ； 5 为 G-2A-MR 片段 ； 6 为 IRES 序列 PCR 片段 ； 7 为 G-2A-M-IRES 片段 ； 0019 图 3 为各重组质粒的酶切鉴定 ； 其中， 1 为 -EcoT14 I digest Marker ； 2 为 DNA Marker DL2,000 ； 3 为 pJEV-REP-G-2A

15、-M-IRES（SalI/SpeI） ； 4 为 pJEV-REP-G-2A-M（SalI/ SpeI） ； 5 为 pJEV-REP-GFP（SalI/SpeI） ； 6 为 pJEV-REP-IRES（SalI/SpeI） ； 7 为 pCAGGS-GM （EcoRI 和 XhoI） ； 0020 图 4 为表达 GP5/M 蛋白的三组重组质粒的 Western blot 检测结果 ； 其中， 1 为 pageRuler Prestained Protein Ladder ； 2 为 pJEV-REP-G-2A-M-IRES ； 3 为 pJEV-REP-G-2A-M ； 4 为 pCAG

16、GS-GM ； 5 为 293T 细胞 ； 0021 图 5 为三组 pJEV-REP 重组质粒转染 293T 细胞 48h 的 IFA 结果 (400) ； 其中， A 为 pJEV-REP-G-2A-M-IRES 转 染 293T 细 胞 ； B 为 pJEV-REP-IRES 转 染 293T 细 胞 ； C 为 pJEV-REP-G-2A-M 转染 293T 细胞 ； D 为 293T 细胞 ； 0022 图 6 为免疫小鼠血清抗体的生长曲线 ； 0023 图 7 为不同疫苗免疫小鼠的脾脏淋巴细胞特异性增殖反应。 说 明 书 CN 102247606 B 4 3/5 页 5 具体实施方

17、式 0024 以下结合实施例来进一步解释本发明， 但实施例并不对本发明做任何形式的限 定。 0025 材料 ： PRRSV-XH 株由农业部动物疫病防控重点开放实验室张桂红教授惠赠 ； Mac145细胞由农业部动物疫病防控重点开放实验室提供 ； 8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠 购自广东省实验动物中心。 0026 实施例 1 构建猪高致病性蓝耳病复制子疫苗 0027 1. 构建猪高致病性蓝耳病复制子疫苗的设计 （结构图如图 1） 0028 通过自行设计的引物 （如 SEQ ID NO:1929 所示） ， 以 HP PRRS 基因 RNA 的反转录 产物为模板， 引物 GP5F 与 GP5

18、R-FMDV2A-R 可扩增出 GP5 基因的完整编码区及 2A 序列的前 45 个碱基， 结果扩增出大小为 648bp 特异性片段 ； 引物 MF-FMDVF2A-F 与 MR- SalI 则可以 扩增出 2A 序列的后 45 个碱基及 M 基因的完整编码区， 扩增出 570bp。另外， 引物 GP5F 和 MR-SalI 通过融合 PCR 的方法扩增出约 1,200bp 的 G-2A-M 片段。同时以 G-2A-M 片段为模 板， 以 GP5F 和 MR 为引物扩增出约 1,200bp 的 G-2A-MR 片段， 再以 IRES1F 和 IRES-588R 为 引物， 以 pIRES1-n

19、eo 为模板扩增出 588bp 的 IRES 序列。接着利用 G-2A-MR 片段和 IRES 为 模板， 以 GP5F 和 IRES-588R 为引物融合扩增出约 1,800bp 的 G-2A-M-IRES 特异性片段， 最 后利用 SalI-HF 和 SpeI 两个酶切位点插入到 pJEV-REP 中， 最终构建基于 JEV 复制子并且 能够表达 GP5 和 M 蛋白的高致病性蓝耳病疫苗 （如图 2） 。 0029 2. 真核表达质粒的构建 0030 以GP5-EcoRI和MR-XhoI为引物， 以质粒pJEV-REP-G-2A-M为模板通过PCR的方法 扩增出G-2A-M-EX片段。 然

20、后将G-2A-M-EX片段和真核表达载体pCAGGS分别用限制性内切 酶 EcoRI 和 XhoI 进行消化连接产物直接用于转化以及重组质粒的获得， 命名为 pCAGGS-GM （如图 2） 。 0031 3. 各重组质粒的酶切鉴定 0032 重组质粒 pCAGGS-GM 用 EcoRI 和 XhoI 进行酶切鉴定， 而 pJEV-REP-G-2A-M-IRES、 pJEV-REP-G-2A-M 和 pJEV-REP-IRES 三个重组质粒则均用 SalI 和 SpeI 进行酶切鉴定 （如 图 3） 。 0033 实施例 2 化学荧光法 Western-blot 检测 GP5 蛋白和 M 蛋白

21、表达 0034 将共表达 PRRSV 的 GP5 和 M 蛋白的质粒 （pJEV-REP-G-2A-M 和 pJEV-REP-G-2A-M-IRES） 与真核表达质粒 （pCAGGS-GM） 分别转染 293T 细胞， 转染 48h 后收 集细胞， 重组质粒转染 48h 后， 收获细胞， PBS 洗 2 次， 适量 PBS 重悬， 加入 2SDS 上样缓冲 液， 沸水浴作用 10min。制备 12% SDS- 聚丙烯酰胺凝胶 （PAGE） ， 按每孔 20l 点样， 并于 80V/0.5h 和 120V/1.5h 条件下电泳。电泳结束后， 在半干电转印仪上于 17V/10min 条件下 将蛋白

22、转移至硝酸纤维膜上。转移完成以后用 1PBS 洗膜 5min， 5% 脱脂乳 37封闭 1h。 用抗 GP5 蛋白和抗 M 蛋白特异性单克隆抗体室 4孵育过夜， PBST 洗 3 遍， 每遍 5min， 将 IRDye 800标记的羊抗鼠荧光二抗作1:7,500稀释后一起加入， 室温摇床上孵育1h， PBST洗 膜 3 次， 每次 5min， 用 Odyssey 红外荧光扫描成像系统进行扫描， 结果发现， 三种转染了质 粒的 293T 细胞都在 43KD 出现特异性条带， 表明 GP5 和 M 蛋白的表达是以 GP5/M 异源二聚 说 明 书 CN 102247606 B 5 4/5 页 6

23、体的形式存在 （见图 4） ， 表明这几种重组质粒在转染细胞后均可正确表达目的蛋白。 0035 实施例 3 间接免疫荧光检测 JEV 非结构蛋白的表达 0036 将 共 表 达 PRRSV 的 GP5 和 M 蛋 白 的 JEV 复 制 子 质 粒 （pJEV-REP-G-2A-M 和 pJEV-REP-G-2A-M-IRES） 与载体对照质粒 （pJEV-REP-IRES） 分别转染 293T 细胞 48h 后， 用 间接免疫荧光的方法检测到三种 JEV 复制子重组质粒均能表达 JEV NS1 蛋白 （见图 5） 。 0037 实施例 4 免疫小鼠血清特异性抗体的检测 0038 60 只 8

24、 周 龄 的 SPF 级 BALB/c 雌 性 小 鼠 分 为 5 组， 每 组 12 只， 分 别 免 疫 pJEV-REP-G-2A-M-IRES、 pJEV-REP-IRES、 pJEV-REP-G-2A-M、 pCAGGS-GM 和 PBS， 免疫剂量为 100L/ 只， 每侧各 50L， 共免疫 3 次， 每隔 3 周免疫一次。 0039 采集免疫后 0、 2、 4、 6、 8 和 10 周的免疫小鼠血清， 用猪蓝耳病 ELISA 检测试剂 盒进行检测 （其中将猪的酶标二抗更换为小鼠的酶标二抗） 。主要步骤如下 ： 1:100 稀释 待检小鼠血清， 取预包被的板， 每孔加 100L

25、待检血清， 置 37温育 30min ； 300L/ 孔 洗涤液洗板 4 次， 每次静置 3min ； 每孔加 NBL 公司的鼠酶标二抗 （1:7,500 稀释） 100L， 置 37温育 60min ； 洗涤 4 次， 方法同上 ； 每孔加底物 A 液和 B 液各 50L， 室温避光显色 10min ； 每孔加终止液 50L， 10 min 内用酶标仪 630nm 波长测定各孔的 OD 值 （见图 6） 。 从图中可以看出免疫组在一免后两周开始检测到特异性抗体， 二免后 pJEV-REP-G-2A-M 和 pJEV-REP-G-2A-M-IRES 免疫组相比对照组抗体水平开始增加， 并在三免

26、后两周 （8 周）三组疫苗组均达到抗体的高峰， 此时 pJEV-REP-G-2A-M（OD630=0.730.09）和 pJEV-REP-G-2A-M-IRES （OD630=0.710.08） 免疫组比 pCAGGS-GM （OD630=0.590.11） DNA 疫苗免疫组产生更高的抗体。结果表明复制子疫苗比 DNA 疫苗能产生更高的抗体水平。 0040 实施例 5 免疫小鼠的特异性淋巴细胞增殖水平 0041 三免后两周进行淋巴细胞增殖试验。首先用眼球采血法处死小鼠， 浸泡于 75% 的 乙醇中 ； 在超净台中取出小鼠脾脏置于35mm培养皿中， 注意无菌操作 ； 在培养皿中加入4-5 mL

27、 淋巴细胞分离液。用注射器将脾脏挑成碎块， 然后于 200 目的筛网下用注射器的活塞 进行研磨， 然后吹打成单个细胞悬液 ； 然后把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到 15mL 离 心管中， 覆盖 200-500L 的 1640 培养基， 保持液面分界明显 ； 室温， 800g 离心 30min ； 接 下来吸出淋巴细胞层， 再加入 10 mL1640 培养基， 颠倒洗涤。室温， 250g 离心 10min 收集 细胞 ； 最后倾倒上清液， 用 1640 培养基重悬细胞， 细胞计数， 然后用 1640 完全培养基将细 胞稀释到 1106个 / mL。将上述制备的淋巴细胞悬液离心后悬浮到 RPMI1

28、640 完全培养 基， 然后加到 96 孔平底细胞培养板 (1105 个 / 孔 )， 每孔加入 100L 的细胞悬液。再 加入相同体积的 PRRSV(1g)、 Mac145 空细胞对照或是 RPMI1640 完全培养基。培养板在 含 5% CO2 的 37恒温培养箱培养 84h 后， 每孔加入 10L CCK-8 试剂， 混匀后继续培养 3h， 然后用酶标仪检测波长为 450 nm 的光密度值。每个样品设三个重复， 计算刺激指数 (Stimulation Index, SI)。SI=PRRSV 刺激孔的平均光密度度值 OD450nm/Mac145 空细胞 对照孔密度度值 OD450nm。脾细

29、胞加入 PRRSV 刺激培养 80h 后， 加入 WST-8 溶液， 来判断 活细胞数量。活细胞的量由样品的 OD450nm 显示， 根据 PRRSV 刺激组和空细胞对照组的 OD450nm 计算刺激指数 (Stimulation Index,SI) 从而判断增殖水平。实验结果表明 （见图 7） pJEV-REP-G-2A-M(SI=1.8040.175) 和 pJEV-REP-G-2A-M-IRES(SI=1.8530.254) 免 疫组的 SI 明显高于 pJEV-REP-IRES（SI=1.1550.037） 空载体免疫组 (p0.01) ； DNA 疫 说 明 书 CN 1022476

30、06 B 6 5/5 页 7 苗组 （pCAGGS-GM） SI 指数 （SI=1.540.10） 也明显高于 PBS 对照组 (p0.01)， 但是增殖水 平低于其它两组复制子疫苗组。 说 明 书 CN 102247606 B 7 1/9 页 8 SEQUENCE LISTING 华南农业大学 一种基于 DNA 水平的高致病性猪蓝耳病病毒 JEV 复制子疫苗及其应用 29 PatentIn version 3.2 1 40 DNA PCMVp1 1 tttttggcgg ccgctagtta ttaatagtaa tcaattacgg 40 2 44 DNA PCMVP1L 2 tttttg

31、gcgg ccgctagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtc 44 3 47 DNA PJEV164olR 3 ctcggtcgac ggtggtaaca ctagtgcggg gtaggccgcg tttcagc 47 序 列 表 CN 102247606 B 8 2/9 页 9 4 43 DNA PJEV2403olF 4 actagtgtta ccaccgtcga ccgagaccga tcaattgctt tgg 43 5 20 DNA PJEVC5706R 5 ttacgctcgc cacaaaccac 20 6 20 DNA CJEV-5557F 6 cga

32、ccccgcc tggaaccacg 20 7 25 DNA CJEV-9155R 7 gaaccccaaa gcttcaaact ctaga 25 8 25 序 列 表 CN 102247606 B 9 3/9 页 10 DNA pJEV9117F 8 cttggagcac ggtatctaga gtttg 25 9 24 DNA pJEV10976R 9 agatcctgtg ttcttcctca ccac 24 10 25 DNA pJEV10395F 10 tgtgatttaa ggtagaaaag tagac 25 11 36 DNA SPAP2L 11 cgaggtacct acc

33、acatttg tagaggtttt acttgc 36 12 29 DNA GFP1F 序 列 表 CN 102247606 B 10 4/9 页 11 12 ccgcactagt atggtgagca agggcgagg 29 13 30 DNA GFP717R 13 ctcggtcgac cttgtacagc tcgtccatgc 30 14 42 DNA EGFP720Rol 14 gggggaggga gaggggcgtt acttgtacag ctcgtccatg cc 42 15 18 DNA IRES 1F 15 cgcccctctc cctccccc 18 16 38 DNA

34、 IRES 588R 16 ctcggtcgac catgttgtgg caagcttatc atcgtgtt 38 序 列 表 CN 102247606 B 11 5/9 页 12 17 22 DNA 2403F 17 cgagaccgat caattgcttt gg 22 18 27 DNA 2609R 18 cttcgctagg gatctgggcg tttctgg 27 19 35 DNA GP5F 19 ccgcactagt atgttgggga agtgcttgac cgcgt 35 20 67 DNA GP5R-FMDV2A-R 20 ctcaacgtct cccgccaact

35、tgaggaggtc gaagttcaga agctggagac gaccccattg 60 ttctgct 67 序 列 表 CN 102247606 B 12 6/9 页 13 21 65 DNA MF-FMDVF2A-F 21 gacctcctca agttggcggg agacgttgag tccaaccctg ggcctatggg gtcgtctcta 60 gacga 65 22 49 DNA MR 22 gggggaggga gaggggcgtt atttggcata tttaacaagg tttaccact 49 23 39 DNA MR-SalI 23 cctttgtcga

36、ctttggcata tttaacaagg tttaccact 39 24 18 DNA IRES 1F 24 cgcccctctc cctccccc 18 25 序 列 表 CN 102247606 B 13 7/9 页 14 38 DNA IRES 588R 25 ctcggtcgac catgttgtgg caagcttatc atcgtgtt 38 26 36 DNA GP5F-EcoRI 26 cctttgaatt catgttgggg aagtgcttga ccgcgt 36 27 42 DNA MR-XhoI 27 cctttctcga gttatttggc atatttaaca

37、 aggtttacca ct 42 28 31 DNA IRES-1F-SpeI-TAA 28 ccgcactagt taacgcccct ctccctcccc c 31 29 588 DNA IRES 序 列 表 CN 102247606 B 14 8/9 页 15 29 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 60 tgtgcgtttg tctatatgtg attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 120 cggaaacctg gccctgtctt c

38、ttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 180 ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 240 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 300 ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 360 cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc

39、 tctcctcaag cgtattcaac 420 aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 480 tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 540 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaac 588 30 588 DNA G-2A-M 30 ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATCGCTTTTTTtGTGGT

40、GTATCGTGCCGTTCTATCTTGCTGT GCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGtGAGCTGAATGGCACAG ATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGTGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGG GCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGT CTTGAGCAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTG

41、GCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCT GGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATT GTGGAGAAAGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAAC CCCTTTAACCAGAGTTTCAGCAGAACAATGGGGTCGTCTCCAGCTTCTGAACTTCGACCTCCTCAAGTTGGCGGGAGACG TTGAGTC

42、CAACCCTGGGCCTATGGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATGATAGCACAGCTCCACAGAAGGTGCTTTTG GCGTTTTCCATTACCTACACGCCAGTGATGATATATGCTCTAAAGGTAAGTCGCGGCCGACTGCTAGGGCTTCTGCACCT 序 列 表 CN 102247606 B 15 9/9 页 16 TTTGATCTTTCTGAATTGTGCTTTTACCTTCGGGTACATGACATTCGTGCACTTTGAGAGCACAAATAGGGTCGCGCTCA CTATGGGAGCAGTAGTTGCACTTCTTTGGGG

43、AGTGTACTCaGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGT TTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGCGGC AAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCC TCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTCAAGCAGGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCCAAA 1182 序 列 表 CN 102247606 B 16 1/3 页 17 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102247606 B 17 2/3 页 18 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102247606 B 18 3/3 页 19 图 7 说 明 书 附 图 CN 102247606 B 19