医用有机凝胶方法和组合物.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811049910.3 (22)申请日 2012.12.05 (30)优先权数据 61/566,768 2011.12.05 US (62)分案原申请数据 201280073745.X 2012.12.05 (71)申请人 因赛普特有限责任公司 地址 美国马萨诸塞州 (72)发明人 R.艾尔海克 P.贾勒特 A.S.索内 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 李真 (51)Int.Cl. A61K 9/06(2006.01) A61K 38/38(

2、2006.01) A61K 47/34(2017.01) (54)发明名称 医用有机凝胶方法和组合物 (57)摘要 本发明涉及医用有机凝胶方法和组合物。 描 述了顺序溶剂生物材料。 实施方式包括在有机溶 剂中制造的材料， 所述材料被除掉溶剂并用于患 者中， 在患者处它们吸收水并形成水凝胶。 这些 材料对于尤其是递送治疗剂、 组织扩充和放射学 标记是有用的。 权利要求书1页 说明书36页 附图7页 CN 109200013 A 2019.01.15 CN 109200013 A 1.用于治疗性水溶性生物试剂的控制释放的生物材料， 其包括药学上可接受的干凝 胶， 所述干凝胶包括分散于其中的所述生物

3、试剂的固体颗粒， 其中所述干凝胶当暴露于水 时为水凝胶。 2.权利要求1的生物材料， 其中所述干凝胶包括共价交联的亲水聚合物和/或其中所述 水溶性生物试剂为具有二级和/或三级结构的蛋白质。 3.权利要求1或2的生物材料， 其中所述水溶性生物试剂当水凝胶形成时基本上以固相 保持， 且当水凝胶暴露于哺乳动物体内的生理溶液时在一段时间期间缓慢地溶解。 4.权利要求1-3中任一项的生物材料， 其中所述有机凝胶包括共价交联的亲水聚合物。 5.权利要求1-4中任一项的生物材料， 其中所述干凝胶在水中水合之后是通过选自如 下的能水解降解的连接的自发水解而能生物降解的： 酯、 碳酸酯、 酸酐和原碳酸酯。 6.

4、权利要求1-5中任一项的生物材料， 其中所述干凝胶为包含第一官能团的第一前体 和包含第二官能团的第二前体的化学反应产物， 其中所述第一官能团和所述第二官能团反 应以形成共价键。 7.药物的控制递送的方法， 包括将权利要求1-6中任一项的生物材料放置成与患者的 组织接触。 8.权利要求7的方法， 其中所述组织包括腹膜内空间、 肌肉、 真皮、 表皮、 自然内腔或空 隙、 腹腔、 前列腺、 直肠、 在前列腺和直肠之间的位置、 胸、 在辐射靶和健康组织之间的组织、 和脉管系统。 9.包括权利要求1-8中任一项的生物材料的试剂盒。 10.权利要求9的试剂盒， 其中所述生物材料为在暴露于水时形成水凝胶颗粒

5、的干凝胶 颗粒的集合体。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109200013 A 2 医用有机凝胶方法和组合物 0001 本申请是申请号为201280073745.X、 申请日为2012年12月5日、 发明名称为 “医用 有机凝胶方法和组合物” 的专利申请的分案申请。 0002 相关申请的交叉引用 0003 本专利申请要求2011年12月5日提交的美国序列号61/566,768的优先权， 将其特 此通过参考引入本文中。 技术领域 0004 技术领域总体上涉及药物的控制释放， 且包括由小颗粒递送蛋白质。 背景技术 0005 治疗剂要求递送方式是有效的。 药物递送涉及在人或动物中施用药物

6、化合物以实 现治疗效果。 提供药剂随时间的释放的递送机制是有用的。 为了改善产品效力和安全性、 以 及患者方便性和顺应性的益处， 药物递送技术可帮助改变药物释放曲线(profile)、 吸收、 分布或药物消除。 发明内容 0006 尽管在这些领域中有大量的研究， 但是由于生物试剂、 包括蛋白质在体内的差的 稳定性， 使用生物试剂的治疗的有效性和成功仍然相当有限。 尽管有如下常识： 在药物加工 技术中蛋白质不应暴露于有机溶剂， 但已观察到可使用许多溶剂。 描述使用这样的溶剂的 方法， 包括对于双溶剂递送系统的实施方式， 其中第一溶剂为在加工中的有机溶剂且第二 溶剂为体内的生理流体。 0007 本

7、发明的实施方式是干凝胶， 其包括分散在所述干凝胶的基体中的蛋白质粉末或 其它水溶性生物试剂(生物制剂)粉末。 所述干凝胶可在就要使用的时候(at the point of use)水合并放置于组织中， 在组织中其随着时间可控地释放所述蛋白质。 下面详述该实施 方式等等。 附图说明 0008 图1A描绘生物材料的形成； 0009 图1B描绘图1A的生物材料的微观结构； 0010 图1C描绘生物材料的替代性实施方式的微观结构； 0011 图2A为显示卵白蛋白在生理溶液中在37下随时间的释放的HPLC数据的图； 0012 图2B为图2A的数据在对于水凝胶完全溶出时的蛋白质水平归一化之后的图； 001

8、3 图3为显示卵白蛋白在生理溶液中在pH 8.5和37下和在生理溶液中在pH 7.4和 37下随时间的释放的HPLC数据的图。 数据对于完全溶出时的蛋白质水平归一化； 0014 图4为显示IgG在生理溶液中在37下随时间的释放的HPLC数据的图； 0015 图5为图4的数据在对于水凝胶完全溶出时的蛋白质水平归一化之后的图； 说 明 书 1/36 页 3 CN 109200013 A 3 0016 图6为描绘来自水凝胶赋形剂(vehicle)的组合计算的白蛋白的释放曲线的图； 0017 图7为描绘来自水凝胶赋形剂的组合计算的白蛋白的释放曲线的图； 0018 图8为在眼睛处或眼睛附近用于施加生物材

9、料的各种位点的图解； 0019 图9A为用于将生物材料放置在眼睛中的方法的图解， 且描绘将针插入眼睛中的过 程； 和 0020 图9B描绘图9A的在眼睛中接收生物材料的位点的多种实例。 具体实施方式 0021 本发明的实施方式为干凝胶， 其包括分散在所述干凝胶的基体中的蛋白质粉末或 其它水溶性生物试剂粉末。 所述干凝胶可在就要使用的时候水合且放置在组织中， 在组织 中其随时间可控地释放所述蛋白质。 所述粉末含有蛋白质的细颗粒。 所述干凝胶基体在水 合时为由交联的基体制成的水凝胶。 所述蛋白质处于固相且基本上是不可溶的直至所述基 体开始受侵蚀(侵蚀， erode)， 由此容许所述蛋白质进入溶液中

10、。 所述基体保护所述蛋白质 免受细胞、 酶促变性、 和不需要的局部反应的影响。 所述蛋白质处于基本上固相直至通过逐 渐的溶剂化(溶解)被释放， 且因此被保护免受变性、 自动水解、 蛋白质水解和局部化学反应 的影响， 其可导致效力的损失或产生抗原性。 0022 图1A描绘该方法的实施方式， 其以蛋白质颗粒100开始， 蛋白质颗粒100通过常规 手段制备以保持蛋白质的二级结构以及如果存在的三级或四级结构。 将这些与前体102、 104一起合并到有机溶剂106中。 加工混合物以实现生物材料的所需形状， 例如通过流延(铸 造)108、 作为棒110、 作为颗粒和/或球112、 和模塑形状114。 从所

11、述形状除掉(strip， 汽提) 溶剂且材料当暴露于水时将形成水凝胶。 直到对于患者实际使用干凝胶的时刻的整个过程 可在不存在水的情况下和/或在不存在疏水材料的情况下进行。 图1B描绘通过该方法制造 的生物材料120的微观结构。 所述结构代表跨越其制造和使用过程的材料： 有机凝胶、 干凝 胶、 和然后的水凝胶。 交联的基体由已彼此共价反应的前体124制成。 水溶性生物试剂的颗 粒124分散在所述基体内。 所述基体为连续相， 且所述颗粒在其内部展开且为不连续相， 也 称作分散相。 0023 替代性实施方式涉及使用通过疏水域(结构域、 区， domain)的形成而物理交联的 嵌段共聚物前体， 如图

12、1C中所描绘的。 生物材料130具有分散在基体中的生物试剂颗粒132。 所述前体具有亲水嵌段134和疏水嵌段136。 疏水嵌段136自组装以形成疏水域138， 其在所 述前体之间产生物理交联。 术语物理交联意指非共价键合的交联。 疏水域是一个这样的实 例， 以及聚氨酯或其它多嵌段共聚物的硬和软链段。 离子交联是另一实例。 术语交联被技术 人员充分地理解， 所述技术人员将立即能够将共价交联与物理交联、 以及物理交联的子类 型例如离子、 疏水和结晶域区别开。 0024 其它药物递送途径已使用例如脂质体或胶束包封蛋白质， 或制造纳米颗粒， 在所 述颗粒的产生中使用聚合物或其它试剂。 在水凝胶中的蛋白

13、质递送通常涉及使蛋白质与水 凝胶隔绝： 例如， 通过将水凝胶放置在脂质体、 胶束中、 或在具有粘结剂例如聚合物的混合 物中。 其它途径涉及将材料直接吸附到蛋白质以抑制它们的溶出。 另一途径是在递送过程 中使蛋白质沉淀， 如在美国公布No.2008/0187568中公开的。 其它途径使用水凝胶， 其中能 溶解的蛋白质分散遍及水凝胶， 其中水凝胶受侵蚀控制释放。 说 明 书 2/36 页 4 CN 109200013 A 4 0025 尽管有所有这些努力， 但是使用生物试剂(包括蛋白质)的持续释放治疗的有效性 和成功仍是有限的， 因为所述生物试剂在体内的稳定性趋于是差的。 并且构象的损失可不 仅导

14、致效力的损失， 而且其可通过导致不想要的效果或引起免疫反应而可为有害的。 尽管 有非常多的努力， 但是还不存在足够有效以具有真实世界临床价值的普遍可应用的解决方 案， 如在Wu and Jin， AAPS PhamSciTech 9(4):1218-1229(2008)中所评述的。 0026 然而， 令人惊奇地， 本文中提供的实施方式显示， 蛋白质或其它生物试剂的溶解性 和从基体的释放可通过如下控制： 将生物试剂作为固相颗粒设置在合适的基体中， 使得不 需要这些其它的涉及聚合物、 包封剂、 粘结剂等的途径。 此外， 生物试剂甚至在含水的体内 环境中也抵抗变性。 在基体中的颗粒是水溶性的， 但是

15、， 尽管不具有任何包衣(coating)等， 仍然缓慢地溶解， 且它们在生理溶液中的溶出(其通常以分钟或小时度量)可延长至数天、 数星期或数月。 而且， 已观察到另一出乎意料且令人惊奇的结果： 即， 生物试剂不趋于聚集， 即使它们必须以非常高的浓度存在于基体内也是如此。 看起来生物试剂非常缓慢地离开颗 粒。 第一工作原理(本发明不限于其)是， 由高度可移动的聚合物-例如如下的聚合物： 例如 聚乙二醇(PEG)或聚乙烯亚胺-制成的基体的分子链(分子束， molecular strand)在它们自 身周围形成排斥(排阻)体积， 其限制任何其它大分子在紧邻附近的溶解度。 该结构属性不 仅通过在基体内

16、的物理截留(entrapment)将蛋白质限制在固相， 而且限制大分子的溶出， 使得蛋白质颗粒不能移动到溶液中； 当颗粒和蛋白质通过与水的溶剂化开始溶胀时， 它们 被基体限制直至基体至少部分地溶解。 因此， 随着交联密度降低且分子链进一步分开地移 动， 促进被截留的大分子颗粒的逐渐溶出。 这些过程由此提供出乎意料且令人惊奇的结果： 生物试剂留在固相中直至它们变得临近它们从基体释放的时刻： 因此， 蛋白质或其它生物 试剂是稳定的， 因为其不遭受长时间在溶解状态中的有害作用。 释放也受大分子从基体扩 散出来的限制且受大分子的分子量以及形成基体的聚合物的特性的影响。 第二工作原理是 与第一工作原理互

17、补的且同样不是本发明限于其的机理： 基体的分子链与蛋白质附近的水 分子缔合， 使得蛋白质不能够溶解。 该第二原理可适用于具有高度可移动的、 亲水的直链的 聚合物例如PEG。 除PEG之外， 还可选择呈现出与所选择的蛋白质的排斥体积效应的其它水 溶性聚合物或共聚物。 例如， 诸如聚丙烯酸、 聚乙烯醇、 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和聚甲基丙 烯酸羟乙酯(PHEMA)的聚合物通常将具有这样的效应。 一些多糖也具有这些效应。 PEG和/或 这些其它聚合物也可作为固体引入有机凝胶中。 它们将在水的存在下， 即， 在水凝胶中溶解 (溶液化， solubilize)。 而且， 非交联的PEG和/或PEG共聚

18、物例如PLURONIC是这样的添加剂， 其可与蛋白质一起被陷在水凝胶中以提升排斥体积效应， 由此将蛋白质保持在固体状态。 0027 本文中公开的系统的方面涉及在通过将蛋白质颗粒放置在能水合的干凝胶中导 致的随时间的释放的控制方面的大的提高。 实施例1-2详述了用于形成含有水溶性生物试 剂的颗粒的干凝胶的方法。 使用蛋白质白蛋白和免疫球蛋白(IgG)作为水溶性治疗剂蛋白 质的模型。 制备这些蛋白质的粉末。 将粉末颗粒与水凝胶前体在有机溶剂中组合以形成有 机凝胶。 实施例1的表1-5阐述了包括分散的蛋白质粉末的有机凝胶的实例。 将所述有机凝 胶破碎并筛分成颗粒的集合体(集合， collection

19、)， 将其排空有机溶剂以形成干凝胶。 工作 实施例2记录了蛋白质从干凝胶的释放。 0028 如图2-5中说明的， 蛋白质被充分(完全)释放； 出乎意料地， 不存在有机凝胶前体 与蛋白质的可检测的反应， 这防止它们在基体降解时被溶解。 实际上， 这些蛋白质， 和通常 说 明 书 3/36 页 5 CN 109200013 A 5 的蛋白质， 含有胺和硫醇官能团， 其对于强的亲电体例如所使用的亲电前体是潜在地非常 反应性的。 尽管预期有与这些亲电官能团的反应， 但反应的缺乏表明， 通过如下防止这些反 应： 在凝胶化之前， 让蛋白质处于非溶解相或基本上固相， 而形成凝胶的前体处于液相。 释 放曲线显

20、示对释放速率的良好控制， 且范围从数小时的快速释放到数月的释放。 0029 而且， 释放的速率和动力学可进一步通过将多组的颗粒彼此组合而控制， 如在图6 和7中说明的。 这些证明基本上零级的释放， 这是以不依赖于时间的速率递送药物的能力且 药物在药物剂型内的浓度是合乎需要的。 零级释放机制确保随时间释放稳定量的药物， 使 潜在的波峰/波谷波动和副作用最小化， 同时使药物浓度保持在治疗窗内的时间量(效力) 最大化。 0030 用于制备用于水溶性生物试剂的有机凝胶-水凝胶、 双溶剂递送系统的方法和材 料 0031 第一实施方式涉及形成共价交联的基体。 制备水溶性生物试剂的细粉末并将其悬 浮在不将所

21、述水溶性生物试剂例如蛋白质溶剂化的有机溶剂中。 术语粉末在本文中宽泛地 用于指干燥颗粒的集合体。 术语颗粒是宽泛的且包括球、 泪珠形状、 小棒和其它不规则的形 状。 通常， 粉末被加工以提供具有其已知的尺寸、 形状和分布(与平均值或平均数的差异)的 受控颗粒组成。 蛋白质粉末典型地含有稳定用糖例如蔗糖或海藻糖。 这些糖通常是水溶性 的且不是有机溶解性的。 发现， 在整个方法中， 这些将与蛋白质一起保持， 直至水合以形成 水凝胶的时刻。 制备基体前体， 其具有通过在有机溶剂中彼此反应形成交联的有机凝胶的 能力。 前体选择成在所述有机溶剂中是能溶解的。 将前体和水溶性生物试剂粉末在有机溶 剂中混合

22、， 使得水溶性生物试剂颗粒分散遍及在前体之间形成共价键时形成的基体。 在有 机溶剂中形成的基体称作有机凝胶。 除去溶剂以形成干凝胶。 在水中水合时， 基体形成内部 共价交联的水凝胶。 该方法为顺序的(serial)双溶剂方法， 因为有机溶剂必须是对于生物 试剂和前体有效的、 可除掉的(即， 可除去的而没有留下药学上不可接受的残余物)， 但前体 必须是在体内含水环境中是有效的。 蛋白质决不暴露于有机相和水相两者。 认为水溶液中 的蛋白质暴露于例如与有机液体或固体或空气气泡的界面对蛋白质吸附和变性作贡献。 有 机凝胶到干凝胶到水凝胶的顺序方法消除了界面暴露的可能性， 即， 实施方式包括如本文 中描

23、述的方法在水溶性生物试剂不暴露于在下列的任何组合之间的界面的情况下进行： 空 气、 气体、 水、 有机溶剂。 0032 另一实施方式是通过采用液体反应性聚合物作为基体前体形成共价交联的凝胶 (在本文中也称作假有机凝胶)。 制备基体前体， 其具有通过在不存在有机溶剂的情况下例 如当处于熔融状态时彼此反应形成交联的有机凝胶的能力。 将前体和水溶性生物试剂粉末 在高到足以使前体聚合物液化、 但低到足以保持蛋白质稳定性的温度下混合。 这样的温度 的实例为从约10到约75、 或直至约60或直至约75； 技术人员将立即理解， 在明确陈 述的值之间的所有值和范围被设计且引入本文中， 如同详细地写出的一样。

24、采用混合条件 使得水溶性生物试剂颗粒分散遍及在前体之间形成共价键时形成的基体。 所述反应因此在 聚合物的熔体中进行， 术语熔体意味着不存在溶剂。 然而， 在熔体中可存在其它材料， 例如 生物试剂、 糖、 蛋白质、 缓冲液。 实施方式包括材料和制造医用材料的方法， 其包括围绕水溶 性生物试剂的粉末形成凝胶， 其中所述粉末分散在所述凝胶中， 其中形成所述凝胶包括制 备一种或多种前体的熔体和使所述前体共价交联。 所述凝胶的体积的大部分， 例如， 约 说 明 书 4/36 页 6 CN 109200013 A 6 30-约95体积/体积， 可被所述生物试剂或其它固体(例如糖、 缓冲盐)占据； 技术人员

25、将 立即理解， 在明确陈述的值之间的所有值和范围被设计且引入本文中， 如同详细地写出的 一样， 例如， 至少30体积/体积或约40-约75。 0033 所述顺序双溶剂方法的另一实施方式涉及形成具有物理交联的交联材料。 一种这 样的实施方式使用嵌段共聚物作为前体。 所述前体具有亲液的(亲溶剂的)嵌段和疏液的 (憎溶剂的)嵌段。 将这些前体添加到有机溶剂并形成物理交联基体。 在特定有机溶剂中沉 淀以形成有机凝胶的嵌段(也称作链段)可为或可不为在水中沉淀以形成水凝胶的相同链 段。 在除掉溶剂之后， 所得干凝胶在水溶液中形成水凝胶， 因为一个或多个嵌段或链段部分 是疏水的且一个或多个嵌段或链段部分是亲

26、水的。 相关实施方式使用两种有机溶剂： 将嵌 段共聚物型前体溶解于第一有机溶剂中。 然后将共聚物溶液与第二有机溶剂混合， 所述第 二有机溶剂是与所述第一溶剂能混溶的， 但对于所述共聚物的链段的至少一种为非溶剂。 疏液域形成有机凝胶。 另一实施方式使用所述第一和第二有机溶剂且也使用所述第二有机 溶剂使生物试剂沉淀， 使得在相同的步骤形成有机凝胶和生物试剂的颗粒。 0034 所述顺序双溶剂方法的另一实施方涉及热凝胶化。 将在有机溶剂中在约-20至 约70范围内的温度下从溶液转变成有机凝胶的前体与生物试剂一起在其中前体处于溶 解状态的温度下放置在有机溶剂中。 然后将溶液冷却至低于凝胶化点的第二温度，

27、 和前体 形成有机凝胶。 因此， 用于制造有机凝胶的方法是加热溶剂以使共聚物溶解， 然后将溶液冷 却以使共聚物的链段的至少一种沉淀。 然后除掉溶剂以制造干凝胶。 选择前体使得干凝胶 在生理温度下为水凝胶。 0035 对于在这些方法中的使用能适用的嵌段共聚物包括许多的PEG共聚物。 PEG是亲水 的且对于许多有机溶剂是亲液的。 其它亲水聚合物和聚合物型链段为聚乙烯醇、 聚丙烯酸、 聚马来酸酐、 PVP、 PHEMA、 多糖、 聚乙烯亚胺、 聚乙烯基胺、 聚丙烯酰胺等。 其它嵌段选择成疏 水的和对于有机溶剂是疏液的。 这些其它嵌段的实例为： 聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、 聚 乳酸、 聚乙醇酸、

28、 聚三亚甲基碳酸酯、 聚二氧杂环己酮、 和聚烷基醚例如聚环氧丙烷 (PLURONICS， POLOXAMERS)。 所述共聚物可具有各嵌段类型的一种或多种。 0036 可进行这些方法使得水溶性生物试剂从其最初被制备的时间开始从未接触水直 至被放置在体内。 可进一步加工水溶性生物试剂， 使得一旦在来源或制造位置处以纯化的 形式获得， 其之后在凝胶制造过程期间便不溶解于水中和/或从未暴露于水中。 暴露于水可 导致多种问题。 一个问题是蛋白质将随时间经历水解， 使得其缓慢地降解。 另一问题是， 蛋 白质， 一旦其处于溶解状态， 便可重排或形成准稳定的聚集体例如二聚体或三聚体。 0037 本发明的实施

29、方式包括在不存在疏水聚合物和/或疏水溶剂的情况下进行的这些 方法。 需要疏水嵌段聚合物的实施方式不能以无疏水的方法进行， 但是技术人员可容易地 辨别哪些方法是可适用的。 一个实施方式提供在有机凝胶步骤和随后的步骤两者处亲水前 体在有机溶剂中在生物试剂颗粒的存在下且在不存在疏水材料的情况下共价交联。 在一些 实施方式中， 疏水的溶剂可存在而没有损害， 取决于所述溶剂， 因此实施方式包括不存在除 溶剂之外的疏水材料； 和/或不存在疏水聚合物； 和/或不存在疏水聚合物链段。 0038 常识教导有机溶剂通常使蛋白质变性。 一些生命科学过程可忍受某程度的变性， 例如， 在诊断或分析装置中。 然而， 在医

30、学领域中， 即使小程度的变性也是不合乎需要的。 变 性的蛋白 质可呈现出宽范围的 特性 ， 从溶解度的 损失到共同聚 集 (communal 说 明 书 5/36 页 7 CN 109200013 A 7 aggregation)。 共同聚集涉及疏水蛋白质彼此更接近以减少暴露于水的总面积的聚集。 距 离的减少可导致永久的或准稳定的缔合。 当蛋白质变性时， 其二级和三级结构改变， 但氨基 酸之间的一级结构的肽键通常保持完整无损。 0039 然而， 令人惊奇地， 已发现， 留在固相中的蛋白质可暴露于一些有机溶剂而没有大 量变性。 在无水条件下处理的完全无水的有机溶剂是优选的。 当蛋白质已经在水溶液

31、中时 和/或如果有机溶剂、 或有机/含水混合溶剂(例如乙醇/水)具有溶解或者甚至以有限的方 式溶胀蛋白质颗粒的倾向， 由暴露于有机溶剂的变性可发生。 蛋白质-溶剂相容性可通过如 下而在实验上建立： 暴露， 随后进行表征测试以确定蛋白质是否已变性和/或经历一个或多 个化学基团的代替或改变。 有机溶剂相容性可通过如下而简单地测试： 将受试蛋白质浸渍 在受试溶剂中一段合适的时间， 移除蛋白质、 例如通过过滤和真空干燥， 然后通过HPLC或其 它合适的分析方法测试蛋白质的收取。 最可能使蛋白质没有受损害的溶剂是无水的和疏水 的， 但还必须是对于形成凝胶的前体分子的良好溶剂。 在聚乙二醇(PEG)前体的

32、情况中， 采 用了例如二氯甲烷和碳酸二甲酯的溶剂。 其它溶剂例如丙酮(或丙酮/水)、 乙酸乙酯、 四氢 呋喃也可为有用的。 超临界流体溶剂例如二氧化碳对于形成有机凝胶也可为有用的。 0040 在本文中在别处详细描述了前体。 许多有用的前体是可作为多种前体利用的。 将 第一前体添加到溶剂-蛋白质混合物， 随后添加第二前体， 其与第一前体为反应性的以形成 交联。 第一前体可选择成仅具有如下的那些官能团： 其对于在不存在进一步的化学组分的 情况下与蛋白质形成共价键是非反应性的。 蛋白质具有可用于与一些亲电官能团反应以形 成共价键的胺和硫醇、 以及对于其它化学反应可利用的羧基和羟基。 所述前体可因此选

33、择 成对这些官能团是非反应性的。 例如， 所述前体可具有胺和/或硫醇和/或羟基和/或羧基且 对蛋白质是非反应性的。 因此， 本发明的实施方式涉及向蛋白质-有机溶剂混合物添加蛋白 质-非反应性的第一前体， 然后添加对第一前体为反应性的第二前体。 0041 水溶性生物试剂颗粒可不含如下的一种或多种： 粘结剂、 脂肪酸、 疏水材料、 表面 活性剂、 脂肪、 磷脂、 油、 蜡、 胶束、 脂质体、 和纳米囊(胶囊)。 包括水溶性生物试剂颗粒的有 机凝胶或干凝胶也可不含上述的一种或多种。 干凝胶中的蛋白质或其它水溶性生物试剂可 全部处于固相， 可为全部结晶的、 部分结晶的、 或基本上不含晶体(意味着超过9

34、0不含晶 体， 重量/重量； 技术人员将立即理解， 在明确陈述的范围内的所有范围和值被设计)。 0042 干凝胶-水溶性生物试剂材料可以所需的形状形成。 一种方法是使前体在具有所 需的形状的模具中反应。 在除去溶剂之前或之后将所述形状从模具移出。 还可使所述材料 碎裂成颗粒， 如在本文中在别处更详细地描述的。 0043 在有机溶剂中形成基体之后， 可除去溶剂以形成干凝胶。 可能的方法包括， 例如， 使用非溶剂的沉淀、 氮气吹扫干燥、 真空干燥、 冷冻干燥、 热和真空的组合、 和冻干法。 0044 如果在不存在第三(tertiary)溶剂的情况下使用熔融前体， 则无需采用任何溶剂 除去过程。 在

35、冷却时， 材料形成橡胶状固体(如果高于Tm)、 半刚性半结晶材料(如果低于Tm) 或刚性玻璃状固体(如果低于Tg)。 这些材料比由有机溶剂形成的干凝胶致密。 当用其它材 料例如治疗剂、 缓冲盐、 可视化试剂的颗粒填充时， 它们可为高度多孔的， 因为固体颗粒产 生并填充孔。 0045 所有这些方法可在没有水溶性生物试剂的情况下进行。 材料(包括颗粒)在没有生 物试剂的情况下对许多应用具有有用性。 用途包括， 例如， 组织扩充(augmentation)、 填充 说 明 书 6/36 页 8 CN 109200013 A 8 剂、 和在放射疗法中的组织分离。 0046 而且， 所有这些方法可用代替

36、所述生物试剂或者另外地与所述生物试剂一起的额 外的试剂进行。 这样的额外的试剂包括对于肉眼可见的可视化试剂和不透射线的试剂或材 料。 0047 颗粒制备 0048 可形成有机凝胶， 然后弄碎成颗粒， 所述颗粒随后被处理以除去有机溶剂以形成 干凝胶。 对于可注射的形式， 可将有机凝胶浸软(macerate)、 均质化、 挤出、 筛选、 剁碎、 切 丁、 或者以另外的方式弄碎成颗粒形式。 或者， 有机凝胶可作为含有悬浮的蛋白质颗粒的模 制品或滴(droplet)形成。 0049 一种用于制造有机凝胶颗粒的方法涉及产生基体， 将所述基体破碎以制造有机凝 胶颗粒。 因此， 用如本文中所描述的前体制造基

37、体， 然后将其破碎。 一种技术涉及制备具有 蛋白质颗粒的有机凝胶并将其磨碎， 例如， 在球磨机中或使用研钵和研杵。 可用刀或线将基 体剁碎或切丁。 或者可在共混机或均化器中将基体切碎。 另一方法涉及强迫有机凝胶通过 网， 收集碎片， 并使它们通过同一网或另一网直至达到所需的尺寸。 0050 在分散到有机凝胶中之前， 将水溶性生物试剂例如蛋白质制备为颗粒。 多种蛋白 质造粒(particulation)技术例如喷雾干燥或沉淀存在且可被采用， 条件是所关注的蛋白 质与这样的加工是相适应的。 颗粒制备的实施方式涉及接收没有实质(显著)变性的生物试 剂， 例如从供应者或动物或重组(recombinan

38、t)来源。 对于蛋白质， 固相是稳定的形式。 将蛋 白质冻干或浓缩或如接收到的那样使用。 然后通过将蛋白质以固体状态并避免高温、 水分 且任选地在无氧环境中加工而将蛋白质制备为细粉末而没有变性。 粉末可通过例如如下制 备： 磨碎、 球磨研磨、 低温研磨(cryomilling)、 微流化、 或研钵和研杵研磨、 ， 随后筛分固体 蛋白质。 蛋白质也可在相容的无水有机溶剂中在保持蛋白质为固体形式的同时被加工， 在 所述无水有机溶剂中所讨论的蛋白质是不可溶的。 颗粒尺寸减小至所需的范围可通过例如 如下实现： 磨碎、 球磨研磨、 在相容的有机溶剂中的固体蛋白质悬浮体的喷射研磨。 应使高 的剪切速率加工

39、、 高的压力和突然的温度变化最小化， 因为它们导致蛋白质的不稳定性。 因 此， 必须注意以避免损害的方式处理蛋白质或其它水溶性生物试剂， 且在没有结果的合适 的再设计和测试的情况下， 不应认为用于制造颗粒的常规方法的使用是合适的， 且将不预 期其是有用的。 0051 术语蛋白质的粉末是指由一种或多种蛋白质制造的粉末。 类似地， 水溶性生物试 剂的粉末是具有由一种或多种水溶性生物试剂制成的颗粒的粉末。 蛋白质颗粒中的蛋白质 或生物试剂颗粒中的生物试剂彼此缔合以向干燥颗粒提供机械完整性和结构， 即使是在不 存在粘结剂或包封剂的情况下。 这些粉末与使用包封或例如脂质体、 胶束、 或纳米囊的途 径、

40、基本上包封蛋白质或生物试剂的其它技术的蛋白质或生物试剂递送不同。 粉末和/或包 含它们的干凝胶或水凝胶可不含包封材料且不含脂质体、 胶束、 或纳米囊的一种或多种。 此 外， 可制造不含如下的一种或多种的蛋白质颗粒或水溶性生物试剂颗粒： 粘结剂、 非肽 (non-peptidic)聚合物、 表面活性剂、 油、 脂肪、 蜡、 疏水聚合物、 包括比4个CH2基团长的烷 基链的聚合物、 磷脂、 形成胶束的聚合物、 形成胶束的组合物、 两性分子、 多糖、 三个或更多 个糖的多糖、 脂肪酸、 和脂质。 冻干的、 喷雾干燥的或以其它方式加工的蛋白质常常与糖例 如海藻糖一起配制以通过用于制备蛋白质的冻干法或其

41、它方法使蛋白质稳定。 可容许这些 说 明 书 7/36 页 9 CN 109200013 A 9 糖在整个有机凝胶/干凝胶方法中持续存在于颗粒中。 颗粒可制造成包括约20-约100 (干的， 重量/重量)蛋白质； 技术人员将立即理解， 在明确陈述的范围内的所有范围和值被 设计， 例如， 约50-约80或至少90或至少约99。 0052 可通过多种方法将生物试剂的颗粒或有机凝胶的颗粒或干凝胶的颗粒分离成具 有所需的尺寸范围和尺寸分布的集合体。 分级(sizing)的非常精细的控制是可得到的， 其 中尺寸范围从1微米到若干mm， 且其中对于窄的分布， 颗粒尺寸的平均值和范围是可控的。 技术人员将立

42、即理解， 在明确陈述的范围内的所有范围和值被设计， 例如， 约1-约10 m或约 1-约30 m。 约1-约500微米是另一这样的有用的范围， 其中尺寸落入整个所述范围内且具有 在所述范围内的一个值处的平均尺寸、 以及以平均值为中心的标准偏差例如约1-约 100。 用于将颗粒分级的简单方法涉及使用订制的或标准化的筛网目尺寸。 除标准的美国 和Tyler网目尺寸之外， 也通常使用以商品等级(Market Grade)、 研磨等级(Mill Grade)和 拉伸筛绢(Tensile Bolting Cloth)的筛。 被迫使通过网的材料可显示变形使得颗粒尺寸 不是精确地匹配网目尺寸； 不过， 可选

43、择网目尺寸以实现所需的颗粒尺寸范围。 通常使用颗 粒尺寸分析仪， 其中蛋白质颗粒分散于有机或油相中。 还通常使用显微镜方法来测定颗粒 尺寸。 球状颗粒是指颗粒其中最长的中心轴(通过颗粒的几何中心的直线)不超过其它中心 轴的长度的约两倍的颗粒， 其中所述颗粒为字面上地球状的或者具有不规则的形状。 棒状 颗粒是指其中纵向中心轴超过最短的中心轴的长度的约两倍的颗粒。 实施方式包括： 制造 多个颗粒集合体， 其中所述集合体具有不同的体内降解速率， 和将所述集合体混合以制造 具有所需的降解性能的生物材料。 0053 没有变性地递送水溶性生物试剂 0054 这些过程可使用蛋白质或其它水溶性生物试剂进行。

44、这些包括肽和蛋白质。 如本 文中使用的术语蛋白质是指至少约5000道尔顿的肽。 如本文中使用的术语肽是指任何大小 的肽。 术语寡肽是指具有最高达约5000道尔顿的质量的肽。 肽包括治疗蛋白质和肽、 抗体、 抗体片段、 短链可变区(片段)(scFv)、 生长因子、 血管生成因子、 和胰岛素。 其它水溶性生物 试剂为碳水化合物、 多糖、 核酸、 反义核酸、 RNA、 DNA、 小干扰RNA(siRNA)和适体。 本文中的描 述常常是按照蛋白质阐述的， 但所述方法普遍可适用于其它水溶性生物试剂。 0055 蛋白质容易地变性。 然而， 如本文中所描述的， 蛋白质可基本上没有变性地递送， 包括其中不使用

45、粘结剂、 亲脂材料、 表面活性剂、 或其它预防组分的情况。 术语基本上没有 变性是这样的蛋白质， 其被加工成颗粒而没有所述蛋白质的化学结构的改变(没有化学基 团的添加或现存的化学基团的变化)和没有蛋白质的构象即二级和/或三级和/或四级结构 的变化。 在该环境中， 术语基本上意指对于通过对于表位(抗原决定部位)变性的酶联免疫 吸附测定(ELISA)和通过对于在等点电(pI)方面超过0.2的位移的等电聚焦(IEF)在常规条 件下测试的平均化的测试组未观察到在经加工的蛋白质和对照蛋白质之间的显著差异(p 值95)以0.065mg/ml溶解在TRIS缓冲液中。 采取初始样品用于基 线和且在不同的时间点

46、处采样以确定在缓冲液中的蛋白质稳定性。 通过HPLC和ELISA分析 样品的蛋白质含量。 结果总结于下表中。 0251 表6HPLC蛋白质稳定性研究(50mL Tris缓冲液， pH 8.5， 以50rpm震动) 0252 经过的时间(小时)收取的卵白蛋白收取的IgG 0.00100.0100.0 2.0098.397.1 6.0097.299.5 24.0095.597.7 48.0095.098.3 96.0094.193.3 0253 表7ELISA蛋白质稳定性研究(50mL Tris缓冲液， pH 8.5， 以50rpm震动， 37) 0254 经过的时间(小时)收取的卵白蛋白收取的I

47、gG 5分钟97.7109.5 2小时99.587.1 6小时98.485.5 24小时91.376.0 48小时99.978.8 96小时70.183.8 0255 结果显示蛋白质对于对加速的体外蛋白质释放测试的使用是充分稳定的。 0256 体外蛋白质持续释放研究 0257 将来自实施例1的干凝胶样品切割， 称重并添加到在50mL离心管中的50ml TRIS缓 冲液。 使用不锈钢溶出笼将样品保持在离心管的下半部。 将所述管在37和50RPM下浸没在 震动着的水浴中。 0258 表8加速的和实时的体外蛋白质释放研究 0259 说 明 书 35/36 页 37 CN 109200013 A 37

48、 0260 0261 在2小时、 4小时、 8小时处和在那之后直至凝胶降解的每8小时取缓冲液介质样品。 在每个时间点将缓冲液介质完全交换。 通过HPLC和ELISA分析所收集的样品。 结果以图形显 示于图2-5中。 0262 药物释放曲线定制 0263 多种赋形剂的组合可用于定制治疗剂的释放速率。 将对于各颗粒的释放速率合 并， 并计算复合的总释放速率， 如图6和7中所描绘的。 图6描绘从约10到约60小时的基本上 零级的释放动力学。 图7描绘微调的系统。 存在一级释放， 其提供对于最初24小时的初始爆 发， 之后是另外的从约24到约100小时的零级释放。 零级释放持续直至材料的最终溶出。 0

49、264 实施例3.由前体的熔体形成交联的凝胶 0265 将0.86g以SS封端的约15,000道尔顿的8-臂支化PEG(8a15KSS)在50下熔融。 将 1.14g以伯胺封端的约20,000道尔顿的8-臂支化PEG(8a20KNH2)与0.5g牛血清白蛋白(BSA) 粉末一起称重在10ml注射器中， 然后浸在60的水浴中以使8a20KNH2熔融。 将一滴8a15KSS 熔体挨着一滴8a20KNH2熔体/BSA放置在50热板表面上。 所述滴在少于2秒内快速地混合 成凝胶。 如通过显微镜方法观察的， 形成的凝胶含有固体形式的BSA颗粒。 0266 将形成的凝胶转移到填充有Tris-缓冲生理盐水(TBS)pH8.5缓冲液的闪烁管以使 聚合物迅速水解和释放BSA。 0267 在凝胶降解之后， 注意到所得TBS释放介质是透明的， 指示BSA在TBS中的