釉质产品和使用方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201580023050.4 (22)申请日 2015.04.27 (30)优先权数据 61/984,814 2014.04.27 US (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2016.10.27 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2015/027798 2015.04.27 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2015/168022 EN 2015.11.05 (71)申请人 纽约州立大学研究基金会 地址 美国纽约 (72)发明人 斯特法诺斯吉尔卡尼德斯 马丽 萨

2、比恩布洛克松 (74)专利代理机构 隆天知识产权代理有限公司 72003 代理人 王芝艳 吴小瑛 (51)Int.Cl. A61K 35/32(2015.01) (54)发明名称 釉质产品和使用方法 (57)摘要 本申请描述了可用于生产产生釉质产品的 釉质类器官的三维(3D)培养系统。 本发明的特征 在于培养各种细胞类型以产生此类釉质类器官 的方法； 类器官本身； 由类器官产生的釉质产品； 以及将釉质产品成型为外科修复物的方法， 所述 外科修复物包括牙齿修复物和其它假体。 权利要求书2页 说明书15页 附图5页 CN 106456673 A 2017.02.22 CN 106456673 A

3、1.一种在体外产生釉质产品的方法， 所述方法包括： (a)在细胞培养物中提供分化的细胞； (b)将分化的细胞暴露于诱导去分化的试剂， 从而产生去分化的细胞； (c)将所述去分化的细胞暴露于5-羟色胺受体激动剂， 从而产生生成包含釉质素的细 胞外基质的成釉质细胞样细胞； 和 (d)将所述细胞外基质暴露于诱导矿物质化的组合物， 从而产生釉质产品。 2.一种在体外产生釉质产品的方法， 所述方法包括： (a)在细胞培养物中提供干细胞或前体细胞； (b)将干细胞或前体细胞暴露于5-羟色胺受体激动剂， 从而产生生成细胞外基质的成 釉质细胞样细胞； 和 (c)将所述细胞外基质暴露于诱导矿物质化的组合物， 从

4、而产生釉质产品。 3.权利要求1的方法， 其中所述分化的细胞是上皮细胞。 4.权利要求3的方法， 其中所述上皮细胞是口腔上皮角质形成细胞。 5.权利要求1的方法， 其中所述分化的细胞从动物收获或是所建立的细胞系的细胞。 6.权利要求1的方法， 其中诱导去分化的所述试剂是转化生长因子。 7.权利要求6的方法， 其中所述转化生长因子是TGF 1。 8.权利要求1的方法， 其中所述去分化的细胞表达N-钙粘着蛋白和八聚体结合转录因 子4(Oct-4)， 但不表达E-钙粘着蛋白。 9.权利要求1或权利要求2的方法， 其中所述分化的细胞、 所述干细胞或所述前体细胞 是经遗传修饰的。 10.权利要求1或权利

5、要求2的方法， 其中所述5-羟色胺受体激动剂是5-羟色胺， 氮杂唑 酮， 曲坦， LY-334,370， 拉西地酸， 麦角酰二乙胺， 麦斯卡林， 2,5-二甲氧基-4-溴苯乙胺， 氯 卡色林， 西沙必利， 替加色罗， 普卢卡必利， AS-19， 或其盐、 水合物或类似物。 11.权利要求10的方法， 其中所述类似物是二甲-4-羟色胺或N,N-二甲基色胺。 12.权利要求1或权利要求2的方法， 其中所述诱导矿物质化的组合物包含钙和磷酸盐。 13.权利要求1或权利要求2的方法， 其中所述细胞培养物包含表皮生长因子、 胰岛素样 生长因子或成纤维细胞生长因子。 14.权利要求1或权利要求2的方法， 其

6、中所述细胞培养物包含层粘连蛋白， 胶原蛋白 IV， 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或巢蛋白。 15.权利要求1或权利要求2的方法， 其中所述细胞培养物包含从Engelbreth-Holm- Swarm(EHS)小鼠肉瘤提取的溶解的基底膜制备物。 16.权利要求1或权利要求2的方法， 其中所述细胞培养物经配置可使所述成釉质细胞 样细胞增殖成三维细胞簇。 17.权利要求1或权利要求2的方法， 还包括将所述成釉质细胞样细胞暴露于包含生长 因子的组合物的步骤。 18.权利要求17的方法， 其中所述组合物包含成纤维细胞生长因子、 转化生长因子或上 皮生长因子。 19.通过权利要求1-18中任一项所述的方法制备的釉

7、质产品。 20.一种在体外产生釉质产品的方法， 所述方法包括： 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106456673 A 2 (a)提供产生包含釉质素的细胞外基质的原代细胞； 和 (b)将所述原代细胞置于三维培养系统中， 任选地具有诱导矿物质化的试剂和/或包含 生长因子的组合物， 其中所述原代细胞被培养足够的时间以允许形成包含釉质产品的釉质 类器官。 21.根据权利要求20所述的方法， 其中所述原代细胞是成釉质细胞。 22.通过权利要求20或权利要求21的方法制备的釉质产品。 23.一种成型为外科修复物的方法， 所述方法包括： (a)提供通过权利要求1-22中任一项所述的方法制备的釉质

8、产品； 和 (b)使所述釉质产品经受印模或成型为计算机辅助设计包所示的釉质产品。 24.根据权利要求23所述的方法， 其中所述外科修复物是牙科修复物。 25.根据权利要求24所述的方法， 其中所述牙科修复物是牙冠， 镶盖， 相应的支架， 镶嵌 物， 覆盖物， 全口拖牙， 部分拖牙或桥。 26.根据权利要求23所述的方法， 其中所述外科修复物是矫形假体。 27.一种包含产生釉质素的细胞的细胞培养系统， 其中所述系统被配置为允许所述细 胞形成釉质类器官的三维系统。 28.如权利要求27所述的细胞培养系统， 其中产生釉质素的细胞天然地产生釉质素。 29.权利要求28的细胞培养系统， 其中产生釉质素的

9、细胞是成釉质细胞。 30.权利要求27的细胞培养系统， 其中产生釉质素的细胞是被遗传工程化而表达釉质 素的。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106456673 A 3 釉质产品和使用方法 0001 相关申请的交叉引用 0002 本申请要求于2014年4月27日提交的美国临时申请号61/984,814的申请日的权 益。 发明领域 0003 本发明涉及可用于成型为修复性牙科产品和骨骼假体 （包括用于修复牙面缺陷 （例如腭裂） 的假体） 的釉质产品。 所述釉质产品还可用于替换已经被创伤或疾病损坏的其 它骨骼的部分和用于整容手术。 用于从釉质产品生产、 成型为和植入牙修复物或骨骼假体 的组

10、合物和方法， 包括在CAD/CAM技术的辅助下成型或用3D打印机组装釉质产品的方法， 也 在本发明的范围内。 0004 背景 0005 釉质是牙齿中的主要组织之一。 它在早期发育期间、 在牙齿突出牙龈之前形成， 并 且其覆盖牙齿的可见部分。 在发育期间， 釉质器官内的上皮细胞分化为成釉质细胞， 成釉质 细胞产生硬化的高矿物质含量的釉质。 更具体地， 釉质器官在体内天然地以发育中牙齿的 组织学切片中的细胞聚集体出现， 并且其包括存有成釉质细胞的内釉质上皮、 外釉质上皮、 中间层和星网状层。 牙器官由釉质器官和间充质组成。 0006 保护和修复釉质是牙科医生和在牙科领域工作的其他人员的主要关注点。

11、 这是具 有挑战性的， 因为釉质在口中去矿物质化并且不再生。 虽然再矿物质化牙齿的机制是已知 的， 但是平衡状态可以容易地倾向于去矿物质化。 例如， 牙菌斑内的细菌 （例如变形链球菌 （Streptococcus mutans） ） 可以产生有机酸， 特别是在糖的存在下， 降低口中的pH， 促进去 矿物质化和龋齿。 工程化釉质显然是需要的， 但这被证明是困难的， 因为不仅在长出的牙齿 中缺少成釉质细胞， 而且是发育的要求； 到目前为止， 可以分化为成釉质细胞的上皮细胞必 须与间充质细胞相互作用以正确发育。 以前的生产釉质的努力包括基于细胞的策略和无细 胞策略两种。 通常， 基于细胞的策略依赖于

12、在MatrigelTM（一种胶状且含蛋白质的细胞培养 基质） 中与间充质细胞组合的稳定细胞系的发育， 并且其被移植到动物中并在此体内产生 釉质 （参见例如DenBesten et al.,Connect Tissue Res.38(1-4):3-8,1998； DenBesten e t a l .,Eur .J .O ra l Sci .,1 07 (4) :276- 81 ,1 999 ； Na ka ta e t a l ., Biochem.Biophys.Res.Commun.,308(4):834-839,2003； Honda et al.,Cells Tissues Organ

13、s 189(1-4):261-267,2009； Shinmura et al.,J.Cell.Physiol.217(3):728-738, 2008； Nakagawa et al.,J.Dental Res.88(3):219-223,2009； Takahashi et al.,In Vitro Cell Dev .Biol .Anim .,46(5):457-468 ,2010； Liu et al .,J .Tissue Eng.Regen.Med.7:934-943,2012； Hu et al.,J.Dent.Res.,85(5):416-421,2006； and Chen,

14、Arch.Oral Biol.37:771-778,1992） 。 由于釉质含有约97%的羟基磷灰石并且不含细 胞， 合成方法也是可能的 （参见例如Yamagishi et al.,Nature 433:819,2005； and Brunton et al.,Br.Dental J.215:741,2013） 。 通过无细胞方案制备的釉质产品已经在临 床试验中得到测试， 并且显示其有效的治疗了早期、 轻微的龋齿 （Yamagishi et al., 说 明 书 1/15 页 4 CN 106456673 A 4 Nature 433:819,2005； and Brunton et al.,

15、Br.Dental J.215:741,2013） 。 0007 概述 0008 本发明部分地基于发明人开发的培养系统， 其包括体外、 3维 （3D） 、 基于细胞的培 养系统， 为含有产生釉质产品的成釉质细胞样细胞的釉质类器官生长提供环境。 在这个意 义上， 本发明的培养系统复制了釉质器官。 与迄今为止所使用的方法不同， 本文所述的培养 系统可以生产釉质产品， 而不使用天然存在的釉质器官或依靠牙间质或间充质细胞。 0009 本发明的方法可以使用各种不同的细胞类型进行， 这些细胞类型被置于细胞培养 系统中， 所述细胞培养系统被配置为允许所培养细胞3D生长为釉质类器官。 当置于培养物 中的细胞不

16、产生釉质素 （例如， 其中最初培养的细胞是与成釉质细胞不同的分化细胞） 时， 所述方法包括使细胞去分化， 然后再分化为成釉质细胞样细胞的步骤。 当置于培养物中的 细胞是干细胞或前体细胞时， 可以省略去分化步骤， 并且当置于培养物中的细胞是产生釉 质素的细胞 （例如原代细胞） 或由细胞系衍生的的细胞时， 可以既省略去分化步骤又省略诱 导釉质素产生。 0010 因此， 在第一方面， 本发明的特征在于通过以下在体外产生釉质产品的方法：（a） 在细胞培养物中提供分化的细胞；（b） 将分化的细胞暴露于诱导去分化的试剂， 从而产生去 分化的细胞；（c） 将去分化的细胞暴露于5-羟色胺受体激动剂， 从而产生

17、表达釉质素的成釉 质细胞样细胞 （例如通过产生包含釉质素的细胞外基质） ； 和 （d） 将细胞外基质暴露于诱导 矿物质化的组合物， 从而产生釉质产品。 在第二方面， 本发明的特征在于通过以下在体外产 生釉质产品的方法：（a） 在细胞培养物中提供干细胞或前体细胞；（b） 将干细胞或前体细胞 暴露于5-羟色胺受体激动剂， 从而产生生产细胞外基质的成釉质细胞样细胞； 和 （c） 将细胞 外基质暴露于诱导矿物质化的组合物， 从而产生釉质产品。 在第三方面， 本发明的特征在于 通过以下在体外产生釉质产品的方法：（a） 提供细胞 （例如， 分离的成釉质细胞， 永生化的成 釉质细胞或工程化以表达釉质素的细胞

18、） ； 和 （b） 将成釉质细胞置于培养系统 （例如， 二维或 三维培养系统） 中。 可以保持培养物以允许细胞生长和分裂， 并且可以增加培养物中类器官 的密度 （例如， 通过收获和再铺板或重新培养它们） ， 以促进较大的类器官的形成， 这将更容 易聚集形成聚集体。 为了促进细胞增殖和/或增加在培养中形成的釉质类器官的大小， 可以 将细胞暴露于如下进一步阐述的含有血清和/或生长因子或生长因子组合的组合物 （例如 细胞培养基） 。 一旦细胞增殖并产生包含釉质素的细胞外基质， 它们可用作釉质产品， 并且 我们可以指定这样的产品为未矿物质化的釉质产品。 这些未矿物质化的釉质产品可用于通 过例如三维打印

19、成型为修复物和假体。 可以将未矿物质化的釉质产品暴露于诱导矿物质化 的试剂， 从而产生矿物质化的釉质产品， 其也可用于形成修复物和假体 （例如通过3D打印） 。 矿物质化的釉质产品可以通过暴露于减少釉质类器官中的有机物质的量的试剂来进一步 开发。 因此， 任何方法可以进一步包括一旦已经达到期望的尺寸就从釉质类器官去除有机 物质的步骤。 矿物质化并缺乏有机物质 （例如， 不含或基本上不含有机物质） 的釉质类器官 可尤其适于CAD/CAM技术以产生修复物和假体。 0011 在使用分化细胞的任何实施方案中， 细胞可以是上皮细胞 （例如， 口腔上皮角质形 成细胞） ， 但是本发明不限于此； 可以使用可

20、以在细胞培养物中去分化和/或重编程以开始 表达釉质素 （例如在细胞外基质中） 的任何分化的细胞。 在任何实施方案中， 细胞培养物 （例 如， 3D培养物） 中的细胞可以是原代细胞。 也就是说， 无论产生釉质产品的方法是否包括培 说 明 书 2/15 页 5 CN 106456673 A 5 养分化的细胞、 干细胞或前体细胞或成釉质细胞， 细胞可以是从动物收获并置于细胞培养 物中的细胞。 在其他实施方案中， 可以从动物收获细胞 （分化的细胞、 干细胞、 前体细胞或成 釉质细胞） 并随后永生化。 因此， 本发明的方法可以用原代细胞或细胞系的细胞进行。 此外， 细胞可以从各种来源获得， 包括哺乳动物

21、， 如人。 可以对所用的任何细胞进行遗传修饰 （例 如通过重组技术来改变由细胞表达的基因产物） 。 0012 当使用时， 诱导去分化的药剂可以是转化生长因子 （例如TGF （例如TGF 1） ） 。 去分 化的细胞可以是表达通常与干细胞相关的标记 （例如， N-钙粘着蛋白或八聚体结合转录因 子4 （Oct-4） ） 而不是通常与成熟表型相关的标记 （例如， 去分化的上皮细胞可能不能表达上 皮标志物E-钙粘着蛋白） 的细胞。 0013 在使用时， 5-羟色胺受体激动剂可以是5-羟色胺， 氮杂唑酮 （azapirone） ， 曲坦 （triptan） ， LY-334 ,370， 拉西地酸 （la

22、smiditan） ， 麦角酰二乙胺 （lysergic acid diethylamide）， 麦斯卡林 （mescaline）， 2 ,5-二甲氧基-4-溴苯乙胺， 氯卡色林 （lorcaserin） ， 西沙必利 （cisapride） ， 替加色罗 （tegaserod） ， 普卢卡必利 （prucalopride） 或AS-19； 其盐、 水合物或类似物 （例如N,N-二甲基色胺） ； 或其任何组合。 0014 诱导矿物质化的组合物可包括钙和/或磷酸盐 （例如， 含有钙或磷酸盐的矿物质） 。 0015 为了多方面地支持细胞生长和分化， 细胞培养物可以包括表皮生长因子 （EGF） 家

23、族、 胰岛素样生长因子 （IGF） 家、 成纤维细胞生长因子 （FGF） 家族或其他生长因子 （例如， 血 小板衍生生长因子； PDGF； 还参见下文） 的一种或多种生长因子。 0016 任何细胞培养物均可以包括 （例如在培养基质或培养基中） 层粘连蛋白， 胶原蛋白 IV， 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖， 巢蛋白 （entactin/nidogen） 或从Engelbreth-Holm-Swarm （EHS） 小鼠肉瘤提取的溶解的基膜制备物。 在任何实施方案中， 细胞培养物可以被配置为允 许细胞 （例如成釉质细胞或成釉质细胞样细胞） 增殖成三维细胞簇， 我们可以称之为釉质类 器官。 成釉质细胞或成釉质

24、细胞样细胞可以在本发明的培养系统中暴露于包括血清和/或 一种或多种生长因子 （例如， EGF、 IGF、 FGF、 TGF或神经生长因子） 的组合物。 0017 在本发明的任何方法中， 可以处理釉质类器官以减少或去除其中的有机物质。 例 如， 可以用次氯酸钠和/或肥皂/去污剂 （例如， Triton-X100） 处理 （例如浸渍） 釉质类器官。 如果需要， 处理可包括将釉质类器官浸入超声波浴中和/或将其暴露于热 （例如干热） 以促 进有机物质的破坏和/或去除。 因此， 本文所述的釉质产品可以不含或基本上不含有机物 质。 0018 在另一方面， 本发明的特征在于通过本文所述的方法制备的釉质产品。

25、 该产品可 以被收获和包装以供销售 （与使用说明书一起） ， 或者可以被成型为外科修复物， 其然后也 可以被包装以供销售。 为了得到本发明的修复物， 可以提供如本文所述的釉质产品， 并使产 品经受进一步组装或成形的工艺。 例如， 釉质产品可以进行如计算机辅助设计包所示的印 模或成形。 在一个实施例中， 釉质产品可以经制型而包括凹陷 （indentation） 和/或突起 （protrusion） ， 并且可以在第一釉质产品上形成凹陷以啮合第二釉质产品上的突起。 因此， 可以由多个较小的产品组装更大的产品， 然后可以将这些更大的产品进一步制型为适于修 复较大缺陷的修复物 （例如， 长骨 （例如股

26、骨， 扁平骨诸如肩胛骨， 或不规则骨诸如骨盆或脊 柱中的骨） 中的缺陷） 。 0019 在一个实施方案中， 外科修复物是牙修复物 （例如， 牙冠， 镶盖 （veneer） ， 相应的支 说 明 书 3/15 页 6 CN 106456673 A 6 架， 镶嵌物， 覆盖物， 全口拖牙， 部分拖牙， 桥等） 。 在另一个实施方案中， 外科修复物是矫形 假体。 0020 在另一方面， 本发明的特征在于细胞培养系统， 其包括产生釉质素的细胞。 该系统 可以配置为允许细胞形成釉质类器官的三维系统。 产生釉质素的细胞可以是天然即产生釉 质素的细胞 （例如原代成釉质细胞或永生化原代细胞） 或已经通过例如暴

27、露于5-羟色胺受 体激动剂或通过遗传工程操作以表达釉质素的细胞。 在各种实施方案中， 本文所述的方法 可以在3D培养物中进行， 所述3D培养物包括包含生物聚合物 （例如胶原蛋白， 丝蛋白， 藻酸 盐， 壳聚糖， 肽， 透明质酸， 其保留支持细胞三维生长能力的衍生物， 或其任何混合或组合） 的支架。 在其他实施方案中， 支架可以包括陶瓷。 三维培养系统是本领域已知的。 可以咨询 例如Sumita等人 （Biomaterials 27:3238-3248,2006） 和Zhang等人 （Japanese Dental Science Rev.49:14-26,2013） 。 0021 基于我们迄今

28、为止的研究， 我们已经确定了在体内自然发育的釉质器官和我们的 体外3D培养系统中的釉质类器官之间的相似性。 例如， 在两种情况下， 形成包含表达釉质素 的极化柱状外周边界细胞的球状细胞簇。 除了釉质素 （或可选地） ， 可以存在其它釉质标记 物， 包括成釉蛋白 （ameloblastin） ， 釉蛋白(enamelin)和釉丛蛋白 （tuftelin） 。 还形成了含 有釉质素的细胞外可矿物质化基质， 为细胞提供结构和化学支持， 包括刚刚提及的边界细 胞； 这种细胞外基质充当将釉质产品矿物质化的基质。 釉质素蛋白由釉质细胞高度表达， 并 且该蛋白质经历自组装以形成与羟基磷灰石晶体相互作用并在垂

29、直于表面的方向上定向 晶体生长的纳米球。 本发明的釉质产品可以结晶， 并且在各种实施方案中， 它们的晶体结构 将不同于天然存在的牙釉质。 0022 在体内形成的球形釉质器官和本发明培养物中的釉质类器官二者均通过在三维 中扩展而生长。 当外周边界细胞增殖时， 它们产生包含矿物质化和釉质或釉质产品的基础 的细胞外基质。 因为预期在我们的培养系统中生产的釉质的物理性质与在天然牙齿中发现 的釉质的物理性质相似， 我们预计当安装在预制牙齿上时， 我们的釉质产品将有效地最小 化微渗漏， 并因此降低龋齿的风险。 此外， 使用本发明的材料形成的修复物可以提供更自然 的外观， 并且更容易被牙医及其患者接受。 金

30、属和瓷材料的成本上升也使得如本文所述生 产的釉质产品的制造具有成本效益。 0023 虽然用于釉质修复的产品目前由具有与天然存在的釉质不同的物理性质的材料 制成， 但是它们具有足够相似的性质， 以允许它们广泛用于各种外科修复物。 我们当前的期 望是， 本发明的釉质产品的物理性质将类似于天然存在的釉质产品的物理性质， 使得使用 如本文所述的釉质产品产生的修复物具有明显的优点。 结合在外科修复物中的釉质产品的 硬度可以通过改变矿物质化程度而变化。 为牙齿表面准备的修复物可能需要最高的矿物质 含量， 而用于骨置换或增强的修复物可以更少程度地矿物质化。 在应用修复物来置换软骨 或重塑软骨特征 （例如，

31、鼻子或耳朵） 时， 矿物质含量甚至可以更低。 因此， 在各种实施方案 中， 釉质产品的硬度可以与牙釉质、 骨或软骨的硬度基本相同。 0024 “约” 是指加或减10%。 例如， 约10 g为9-11 g， 包括端值。 0025 “成釉质细胞样细胞” 是指产生含有釉质素的细胞外基质 （ECM） 用作本文所述的培 养系统中矿物质化的支架的生物细胞。 0026 “分化的细胞” 是指可识别为除成釉质细胞之外的特化细胞类型的细胞。 例如， 分 说 明 书 4/15 页 7 CN 106456673 A 7 化的细胞可以是上皮细胞 （例如， 口腔上皮角质形成细胞） ， 肝细胞， 肌肉细胞或神经元。 如 本

32、文所定义的分化细胞不产生天然釉质， 但可以在细胞培养物中重新编程以产生釉质产 品。“去分化的细胞” 是先前可识别为特化细胞类型但不再具有至少一种先前识别的性状 （例如， 其中将其识别为分化细胞的一种性状） 的细胞。 例如， 去分化的口腔角质形成细胞可 能不再表达上皮标志物， 如E-钙粘着蛋白， 角蛋白， 桥粒蛋白 （例如桥粒粘蛋白或桥粒胶蛋 白） 或角质化的包膜蛋白； 去分化的肝细胞可能不再表达主要血浆蛋白 （例如血清白蛋白或 C-反应蛋白） ， 载体蛋白 （例如白蛋白， 血浆铜蓝蛋白， 运皮质激素蛋白， 触珠蛋白， 血色素结 合蛋白， IGF结合蛋白， 视黄醇结合蛋白， 甲状腺素视黄质运载蛋

33、白， 或转铁蛋白） ， 激素 （例 如IGF-1， 血小板生成素或铁调素） ； 或载脂蛋白； 去分化的肌细胞可能不再表达肌动蛋白或 肌球蛋白； 并且去分化的神经元可能不再表达神经递质。 用于本发明方法的去分化的细胞 包括表达5-羟色胺受体并且在暴露于5-羟色胺受体激动剂后能够表达釉质素的细胞。 去分 化的细胞也可以， 但不必然表达间充质标志物N-钙粘着蛋白或干细胞标志物OCT4。 0027 “釉质器官” 是指在体内天然存在的细胞聚集体， 而 “釉质类器官” 是指如本文所述 在体外开发 （在细胞培养物中， 包括配置用于细胞在三维中扩增的细胞培养物） 的细胞构建 体。 0028 “细胞外基质” 是

34、指由细胞分泌的分子的集合， 其为细胞和其周围的细胞提供结构 和/或生物化学支持。 ECM可以包括但不必然包括以下一种或多种： 胶原蛋白 （例如胶原蛋白 IV） ， 硫酸软骨素， 弹性蛋白， 纤连蛋白， 透明质酸， 硫酸角蛋白， 层粘连蛋白， 蛋白聚糖 （例如 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖） 和巢蛋白。 0029 除非上下文另有说明， 否则我们使用术语 “体外” 来指细胞培养。 0030 “原代细胞” 是取自活生物体的细胞和未曾作为细胞系被永生化的细胞。 0031 “干细胞” 或 “前体细胞” 是指不产生天然釉质或釉质产品但在根据本文所述的方 法培养时分化成可产生天然釉质或釉质产品的细胞的多能细胞 （p

35、luripotent cell或 multipotent cell） ； 干细胞和前体细胞完全分化程度较低。 通常， 多能干细胞进一步特化 成多能祖细胞， 然后多能祖细胞产生功能性细胞。 可用于本发明方法的干细胞和前体细胞 表达5-羟色胺受体。 0032 “外科修复物” 是指植入或以其他方式施加到患者身体 （例如， 通过外科手术操作） 以改善物理缺陷 （例如， 由疾病或创伤引起的牙齿或骨骼缺陷） 或以增强物理结构 （例如， 在 整容外科手术中） 的组合物。 例如， 缺陷可以包括由退行性疾病、 癌症或损伤产生的裂缝、 腔 或缝隙。 外科修复物可以是牙科修复物 （即， 在牙科操作中应用的组合物，

36、其是或包括釉质 产品） 或骨骼假体 （即， 在外科手术操作中应用的组合物， 以 （完全或部分） 修复牙面结构或 长、 扁平或不规则骨的一部分） 。 可以使用CAD/CAM技术从釉质产品成型得到外科修复物。 “修复性牙科产品” 或 “牙科修复物” 可以是用于 （完全或部分） 恢复牙齿的结构或外观的组 合物。 这些组合物包括牙冠， 镶盖， 相应的支架， 镶嵌物， 覆盖物， 部分拖牙， 全口拖牙和桥 （例如固定桥） 。 牙科修复是一种类型的外科修复， 并且我们还可以使用术语 “外科修复” 来 指代将本文所述的包含釉质产品或由釉质产品组成的组合物施用于患者的方法。 本文所述 的任何治疗方法可包括鉴定需

37、要治疗的患者 （例如， 人类患者， 无论是男人， 女人还是儿童） 的步骤。 因此， 所述方法可以包括鉴定具有牙科、 面部或牙面缺陷 （例如， 腭裂） 的患者； 患有 釉质发生不全病症的患者； 或具有需要修复的骨骼元件 （例如， 面部中的骨骼） 的患者的步 说 明 书 5/15 页 8 CN 106456673 A 8 骤。 该需要可以仅是患者感觉到的需要， 如可能是整容外科的情况。 0033 附图简要说明 0034 图1 （a） -1 （c） 是用苏木精和伊红 （a） ， 抗釉质素抗体 （b） 和茜素红 （c） 染色的本发明 3D釉质类器官的显微照片， 其染钙并指示矿物质化的类器官或釉质产品。

38、 0035 图2 （a） -2 （d） 是证明在培养中用TGF 1处理的细胞系IMOK的口腔上皮角质形成细 胞中， 丧失E-钙粘着蛋白表达且获得N-钙粘着蛋白表达的显微照片。 0036 图3 （a） -3 （f） 是用TGF 1处理前后用抗Oct4、 胶原蛋白1和釉质素的抗体染色的细 胞系IMOK的口腔上皮角质形成细胞的一系列显微照片。 0037 图4是一对显微照片， 其证明了用5-羟色胺处理后细胞系IMOK中的釉质表达的诱 导。 0038 图5是显示釉质产品的放射照片， 其看起来是不透明的并且被圈表示。 0039 图6是培养物中釉质类器官的一系列照片。 标记为 “原始” 的照片描绘了在用任何

39、 生长因子孵育之前的釉质类器官。 其余的照片显示了用胎牛血清 （FBS） 、 FBS和EGF或FBS、 EGF和PDGF培养接种的类器官的效果。 0040 详述 0041 在下面的段落中， 我们描述了用于在体外产生釉质类器官以及用于制备和使用来 自这些类器官产生的釉质产品的外科修复物的组合物和方法。 本文提供的描述用于示例但 不限制本发明。 0042 本文所述的组合物和方法可以不含天然存在的釉质器官、 牙间质和间充质细胞， 或者可以包括或通过使用这些部分与细胞类型 （例如干细胞、 前体细胞和分化的细胞 （例如 原代和永生化细胞） ） 和如下所述的试剂 （例如， 5-羟色胺受体激动剂、 生长因子

40、和矿物质化 物质） 组合进行。 0043 细胞和细胞类型： 可以采用在本文所述的条件下将产生釉质产品 （无论是未矿物 质化的或矿物质化的或无论是否基本上不含有机物质 （例如蛋白质、 核酸和其他细胞物 质） ） 的任何细胞或细胞类型。 这些细胞可以是分化的细胞， 其在培养物中被诱导去分化， 或 者它们可以是干细胞或前体细胞。 在任一情况下， 细胞可以源自许多不同来源， 包括任何数 量的真核组织 （例如， 血液、 骨髓、 皮肤或粘膜组织） 。 例如， 分化的细胞、 干细胞或前体细胞 可以从脊椎动物获得， 诸如哺乳动物 （例如人或其他灵长类动物， 狗， 猫， 马， 牛， 绵羊， 猪， 山 羊， 或啮

41、齿动物） 。 干细胞或前体/祖细胞可以是例如造血干细胞， 间充质干细胞， 来自成体 生物体的上皮干细胞， 上皮干细胞， 脂肪来源的干细胞或牙髓干细胞。 分化的细胞可以是上 皮细胞 （例如， 上皮角质形成细胞， 例如口腔上皮角质形成细胞， 或皮肤的上皮细胞） 。 可以 从其所在的口腔的任何区域 （例如， 腭） 采集口腔上皮细胞。 在任何实施方案中， 细胞可以是 永生化的和/或遗传修饰的。 0044 更具体地， 釉质类器官可包括釉质器官上皮 （EOE） 细胞 （例如， Chen等人 （1992） 使 用的小鼠EOE细胞， 也参见DenBesten et al.,Connect Tissue Res

42、.38(1-4):3-8,1998） 或 由其产生。 如上所述， 细胞可以是永生化的， 并且在这种情况下它们可以是例如由 DenBesten等人产生的永生化的EOE细胞系， PABSo-E （DenBesten et al.,Eur.J.Oral Sci.,107(4):276-81,1999） 。 这些细胞已经传代超过55次， 并保持成釉质细胞的特征， 例如 阳性表达釉质素、 MMP-20和EMSP1mRNA （成釉质细胞的标记物） 。 细胞还可以自发地永生化 说 明 书 6/15 页 9 CN 106456673 A 9 （ 例 如 ， 由 N a k a t a 等 人 报 道 的 自

43、发 永 生 化 的 小 鼠 成 釉 质 细 胞 细 胞 系 （Biochem.Biophys.Res.Commun.,308(4):834-839,2003） 。 另一种有用的细胞类型是 Malassez的上皮细胞残留物 （ERM细胞； 参见Shinmura et al.,J.Cellular Physiol.217: 728-738,2008） 。 ERM细胞可以通过外植体培养从牙周韧带组织获得， 用非血清培养基进行 亚培养 （sub-cultured） ， 并在3T3-J2饲养细胞层上扩增。 釉质类器官还可以包括皮肤上皮 细胞或从皮肤上皮细胞产生 （参见Liu et al.,J.Tissu

44、e Eng.Regen.Med.7:934-943, 2012） 。 Hu等人在用牙间质培养这些细胞时证实了这些细胞的重编程 （J.Dent.Res.,85(5): 416-421,2006） 。 0045 遗传修饰的细胞： 在它们已经被培养并且产生支持矿物质化的细胞外基质之前或 之后， 本发明构建体内的细胞可以被遗传修饰以包括异源基因或基因构建体。 用于遗传工 程改造细胞的方法是本领域公知的， 并且包括例如由Chen对小鼠釉质器官上皮细胞 （EOE） 细胞所使用的电穿孔方法 （Chen,Arch.Oral Biol.37:771-778,1992） 。 如果需要， 可以工程 改造细胞以表达由

45、成骨细胞或骨细胞表达的一种或多种蛋白质。 细胞还可以被遗传修饰以 产生釉质素或成釉质细胞的另一种标记物， 或者产生或产生更多的ECM成分 （包括ECM定义 中列出的一种或多种成分） 。 因此， 存在三种用于产生可用于本发明的方法中的细胞的方 法： 通过提供天然表达ECM和釉质素的细胞 （例如通过分离成釉质细胞或永生化成釉质细胞 系的细胞） ； 通过遗传工程化细胞以产生ECM和釉质素； 或通过重编程培养中的细胞 （例如分 化的细胞、 干细胞或其他前体） 以表达ECM和釉质素 （例如通过暴露于包括血清和/或生长因 子或本文所述的因子的培养基） 。 0046 基质和培养条件： 对于本文所述的培养系统

46、， 可以将细胞最初置于常规的二维培 养中， 在此它们主要在单层中生长， 然后转移至3D培养， 或者它们可以直接置于3D培养。 例 如， 当所述方法使用通过基因或重组方法或通过去分化和再分化修饰以产生釉质素的分化 细胞时， 可以将细胞最初置于二维培养中， 所述二维培养物未设计为支持三维生长。 当需要 3D生长时， 本文所述的细胞或细胞类型可以与基质混合， 所述基质例如基底膜基质 （例如， 来自BD Bioscience， San Jose CA的BD Matrigel TM； 目录356234； 参见Hughes et al., Proteomics 10(9):1886-1890,2010）

47、， 并使用生长培养基 （例如， DMEM-高蔗糖） 在体外生 长。 BD MatrigelTM基底膜基质是从Engelbreth-Holm-Swarm （EHS） 小鼠肉瘤提取的可溶性制 备物， 其包含了包括层粘连蛋白、 胶原蛋白IV、 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白的细胞外基 质蛋白。 它还含有TGF 、 EGF、 胰岛素样生长因子、 成纤维细胞生长因子、 组织纤溶酶原激活 物和在EHS肿瘤中天然存在的其它生长因子。 尽管基质的精确组成可以变化， 但是其可以包 括细胞外基质蛋白和生长因子的混合物， 并且其可以源自肿瘤细胞 （例如Engelbreth- Holm-Swarm （EHS） 小鼠肉瘤

48、细胞） 。 基质可以是在没有其它因子 （例如本文所述的转分化因 子） 的情况下维持多能细胞在其多能状态 （即， 其促进自我更新） 的基质。 还可以将细胞 （例 如原代或永生化口腔角质形成细胞） 最初置于由其它培养基 （例如CnT-02生长培养基 （CELLNTEC） ） 支持的培养物中。 0047 在三维培养物中， 细胞可以变成多层的或聚集的， 其中层状和/或聚集的细胞生长 由支架引导。 例如， 3D培养物可以在AggreWell TM 400板 （Stemcel Technologies， Grenoble， France） 中生长。 每个板具有六个孔， 并且每个孔含有大约4,700个直径为

49、400 m 的微孔。 釉质类器官可以从这样的孔转移到ProtoTissueTM生物反应器 （MC2Biotek， 说 明 书 7/15 页 10 CN 106456673 A 10 Horsholm， Denmark） ， 并在37下在湿润的培养箱中在5%CO2、 95%空气中培养， 每2-5天更换 培养基。 这样的生物反应器可以支持球体生长和细胞外基质的形成。 更通常而言， 可以使用 基于以下或由以下产生的3D培养物： 细胞外基质或支架 （例如， 采用水凝胶） ， 改性表面， 旋 转生物反应器， 微载体， 磁悬浮， 悬滴板和/或磁性3D生物打印。 在无支架技术中， 可以使用 低粘附力板和微图案化表面。 0048 细胞可以保持在培养中， 直到它们达到一定水平的汇合度。 例如， 可以维持细胞直 到它们为约10-90% （例如约30-40%， 40-50%， 50-60%， 60-70%， 70-80%或80-90%） 汇合。 004