山羊源化脓隐秘杆菌及其应用.pdf

1、10申请公布号CN104073450A43申请公布日20141001CN104073450A21申请号201410072433822申请日20140228CCTCCNOM201403720140122C12N1/20200601C12N15/31200601C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12N15/11200601C12N15/10200601C12N15/70200601C12N1/21200601C12R1/0120060171申请人重庆市畜牧科学院地址402460重庆市荣昌县昌州大道770号72发明人付利芝张素辉黄勇富沈克飞徐登峰邱进杰王可甜74专利代理机构北

2、京元本知识产权代理事务所11308代理人黎昌莉54发明名称山羊源化脓隐秘杆菌及其应用57摘要本发明涉及微生物领域，具体涉及一种山羊源化脓隐秘杆菌及其应用，所述山羊源化脓隐秘杆菌的生物保藏号为CCTCCNOM2014037。该山羊源化脓隐秘杆菌、山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段、POL溶血素基因片段、重组载体和重组菌株，可广泛用于化脓隐秘杆菌引起的山羊疾病的研究、诊断和治疗中，为进一步研究山羊源化脓隐秘杆菌生理生化特性及其对动物机体的危害奠定了基础。具体涉及山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段的制备方法，操作简单、可行。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书5页序

3、列表7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表7页附图1页10申请公布号CN104073450ACN104073450A1/1页21山羊源化脓隐秘杆菌，其特征在于生物保藏号为CCTCCNOM2014037。2根据权利要求1所述的山羊源化脓隐秘杆菌，其特征在于所述山羊源化脓隐秘杆菌是从山羊肺炎病例的心血或肺脏的化脓性坏死灶分离得到。3生物保藏号为CCTCCNOM2014037的山羊源化脓隐秘杆菌的POL溶血素基因片段，序列如SEQIDNO1所示。4权利要求3所述POL溶血素基因片段或该片段的互补序列片段在检测化脓隐秘杆菌中的应用。5山羊源化脓隐秘杆

4、菌DNA分子鉴定的特异性片段，序列如SEQIDNO2所示。6权利要求5所述的山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤A、取权利要求1或2所述的山羊源化脓隐秘杆菌，提取基因组DNA，制备模板DNA；B、所述模版DNA采用基因通用引物进行PCR扩增，分离得山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段；所述基因引物为16SRRNA、POL、NANH、NANP、CBPA、MA、MC、ME和MG中的一个或多个基因的特异性引物。7根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述特异性引物具体为16SRRNA基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO3所示，下游引物如SE

5、QIDNO4；POL基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO5所示，下游引物如SEQIDNO6；NANH基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO7所示，下游引物如SEQIDNO8；NANP基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO9所示，下游引物如SEQIDNO10；CBPA基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO11所示，下游引物如SEQIDNO12；MA基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO13所示，下游引物如SEQIDNO14；MC基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO15所示，下游引物如SEQIDNO16；ME基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO17所示，下游引物如

6、SEQIDNO18；MG基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO19所示，下游引物如SEQIDNO20。8权利要求5所述的山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段或该片段的互补序列片段在检测山羊源化脓隐秘杆菌中的应用。9一种重组载体，其特征在于由权利要求5所述的山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段克隆至PMD18T载体形成。10一种重组菌株，其特征在于由权利要求9所述的重组载体转化至ECOLIDH5菌株形成。权利要求书CN104073450A1/5页3山羊源化脓隐秘杆菌及其应用技术领域0001本发明涉及微生物领域，具体涉及一种山羊源化脓隐秘杆菌及其应用。背景技术0002化脓隐秘杆

7、菌属于隐秘杆菌属，原称化脓棒状杆菌CORYNEBACTERIUMPYOGENES、化脓放线菌ACTINOMYCESPYOGENES，1997年定名为化脓隐秘杆菌ARCANOBACTERIUMPYOGENES，是一种多形性、无运动性的革兰氏阳性杆菌，基础信息参见百度百科HTTP/BAIKEBAIDUCOM/VIEW/9523741HTM。0003化脓隐秘杆菌是一种对反刍家畜和猪非常重要的共生条件性致病菌。当动物处于应激状态如运输、寒冷、断奶及其他异常条件刺激时，致使机体抵抗力下降，体内的化脓隐秘杆菌或已处隐性感染的情况下的化脓隐秘杆菌大量增殖，加强致病作用而引起发病或恶化。该菌感染常引起皮肤、关

8、节和器官的化脓性感染；严重时，常因脓毒败血症而死亡。已证实化脓隐秘杆菌是牛呼吸道疾病综合征重要的细菌性病原之一；而目前对于该菌对山羊的致病作用研究还较少。0004目前已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子有化脓隐秘杆菌溶血素PYOYSINPLO、胶原结合蛋白（COLLAGENBINDINGPROTEIN，CBPA）、神经氨酸酶（NEURAMINIDASES，NAN、菌毛MBRIAE等。这些毒力因子，在化脓隐秘杆菌在不同宿主体内栖居并引起各种感染过程中发挥着重要作用。重庆地区近几年大量引进优良羊种，养羊业发展迅速；而养殖生产条件良莠不齐，外加西南地区冬季潮湿阴冷，导致山羊肺炎时有发生。在规模羊场中有为数不

9、少的久治不愈、患有肺炎的羊只，大多生长缓慢、消瘦。0005本发明针对上述问题，对山羊源的化脓隐秘杆菌进行了探索。发明内容0006有鉴于此，本发明提供一种山羊源化脓隐秘杆菌及其应用，为化脓隐秘杆菌引起的山羊疾病的研究、诊断和治疗提供新的应用前景。0007为实现上述目的，本发明的技术方案为0008山羊源化脓隐秘杆菌，生物保藏号为CCTCCNOM2014037。所述山羊源化脓隐秘杆菌已于2014年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2014037。该菌具体分离自重庆市某羊场病羊，羊只极度消瘦、常咳嗽、流鼻液、生长缓慢。

10、将该菌的16SRRNA序列在GENBANK进行序列比对，发现所得序列与化脓隐秘杆菌菌种名称化脓隐秘杆菌，登陆编号HQ712123同源性高达99；涂片染色镜检，可见革兰氏阳性棒状杆菌，单在或成丛，无明显链状存在；命名为化脓隐秘杆菌FLZ0211ARCANOBACTERIUMPYOGENESFLZ0211。0009进一步，所述山羊源化脓隐秘杆菌是从山羊肺炎病例的心血或肺脏等器官的化脓性坏死灶分离得到。所述分离步骤包括从心血或肺脏等器官的化脓性坏死灶采集病料，无菌取病料划线接种于鲜血琼脂培养基，37恒温培养4872H，分离得到；优选含50L/说明书CN104073450A2/5页4L鲜血琼脂培养基。

11、0010本发明提供一种POL溶血素基因片段，即生物保藏号为CCTCCM2014037的山羊源化脓隐秘杆菌的POL溶血素基因片段，序列如SEQIDNO1所示。溶血素是化脓隐秘杆菌的一种外毒素，具有溶解多种动物的红细胞、免疫细胞的特性，能诱导巨噬细胞凋亡，这可能与该菌感染引发化脓病灶相关。通过实验证实，不同于其他毒力因子，该毒素在山羊源化脓隐秘杆菌分离株中普遍存在。因此，溶血素的基因，即POL溶血素基因片段或该片段的互补序列片段可广泛用于化脓隐秘杆菌的检测中，如作为检测化脓隐秘杆菌的靶标。0011本发明提供一种山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段，即生物保藏号为CCTCCM2014037的

12、山羊源化脓隐秘杆菌的16SRRNA，序列如SEQIDNO2所示。该山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段或特异性片段的互补序列片段，可广泛用于山羊源化脓隐秘杆菌的检测中，如利用该特异性片段，制备检测山羊源化脓隐秘杆菌的试剂盒。0012本发明还提供一种山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段的制备方法，该方法包括以下步骤0013A、取上述的山羊源化脓隐秘杆菌，提取基因组DNA，制备模板DNA；0014B、所述模版DNA采用基因通用引物进行PCR扩增，分离得山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段；所述基因引物为16SRRNA、POL、NANH、NANP、CBPA、MA、MC、ME和

13、MG中的一个或多个基因的特异性引物。0015进一步，所述特异性引物具体为16SRRNA基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO3所示，下游引物如SEQIDNO4；POL基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO5所示，下游引物如SEQIDNO6；NANH基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO7所示，下游引物如SEQIDNO8；NANP基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO9所示，下游引物如SEQIDNO10；CBPA基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO11所示，下游引物如SEQIDNO12；MA基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO13所示，下游引物如SEQIDNO14；M

14、C基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO15所示，下游引物如SEQIDNO16；ME基因的特异性引物其上游引物如SEQIDNO17所示，下游引物如SEQIDNO18；MG基因的特异性引物0016其上游引物如SEQIDNO19所示，下游引物如SEQIDNO20。0017所述PCR扩增反应按常规方法进行。所述分离可将PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳后回收DNA分子鉴定的特异性片段，将其克隆至PMD18T载体，转化ECOLIDH5菌株，筛选阳性克隆，并使用载体引物M13/M13进行双向测序。将测定的16SRRNA基因序列与GENBANK中的16SRRNA基因序列进行同源性比较，从山羊化脓病灶中分离到

15、化脓隐秘杆菌。0018在上述研究的基础上，本发明提供一种重组载体，由序列如SEQIDNO2所示的山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段克隆至PMD18T载体形成。进一步，本发明还提供一种重组菌株，由所述的重组载体转化至ECOLIDH5菌株形成。该重组载体及重组菌株可广泛用于山羊源化脓隐秘杆菌的研究和产品等的应用中。0019本发明的有益技术效果是0020本发明的山羊源化脓隐秘杆菌、山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片说明书CN104073450A3/5页5段、POL溶血素基因片段、重组载体和重组菌株，可广泛用于化脓隐秘杆菌引起的山羊疾病的研究、诊断和治疗中，为进一步研究山羊源化脓隐秘

16、杆菌生理生化特性及其对动物机体的危害奠定了基础。本发明山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段的制备方法，操作简单、可行。附图说明0021图1为山羊源化脓隐秘杆菌毒力因子的PCR鉴定（其中，M为DNAMARKERDL2000（M条带从图片底部向顶部依次显示的基因片段长度为100BP、250BP、500BP、750BP、1000BP、2000BP），1为POL，2为NANH，3为NANP，4为CBPA，5为MA，6为MC，7为ME，8为MG）；0022图2为化脓隐秘杆菌部分16SRRNA基因的PCR鉴定（其中，M为DNAMARKERDL2000，9为化脓隐秘杆菌16SRRNA基因长约1500

17、BP的目的条带）。具体实施方式0023以下将参照附图，对本发明的实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件进行。例如分子克隆实验指南（第三版，J萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本发明所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售购买产品。00241病料病料来自重庆市某羊场病羊，羊只极度消瘦、常咳嗽、流鼻液、生长缓慢，采集病羊心血及肺脏等器官化脓性坏死灶。00252菌株及主要试剂ECOLIDH5，由重庆市畜牧科学院兽医研究所保存；RTAQDNA聚合酶、PMDL8T载体、DNTPS和DNAMARKER、DNA胶回

18、收试剂盒，购自宝生物工程大连有限公司；基因组DNA提取试剂盒，购自TIANGEN公司。00263实验动物3周龄清洁级昆明小鼠，购自重庆腾鑫生物技术有限公司；1月龄山羊，购自附近山羊养殖场。00274培养基的制备0028营养琼脂培养基，购自杭州微生物试剂有限公司；0029鲜血琼脂培养基，由重庆市畜牧科学院兽医研究所制备。方法如下灭菌加玻璃珠的三角瓶，经颈静脉无菌采集山羊鲜血，并匀速震荡制成脱纤维羊血，按6比例加入灭菌后冷却至4550的普通营养琼脂培养基，轻轻摇匀后，趁热分装于平皿中制成平板；00305分离0031将无菌采集的病料接种于含50L/L鲜血琼脂培养基，37培养48H观察菌落生长特性。取

19、单菌落接种于含50L/L鲜血琼脂培养基平板培养，纯培养物用于提取基因组DNA，按基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取。按常规方法进行PCR反应。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。0032表1PCR扩增化脓隐秘杆菌的引物0033说明书CN104073450A4/5页600346鉴定00351）毒力因子的PCR鉴定0036PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳，检测化脓隐秘杆菌的主要毒力因子溶血素基因PLO、神经氨酸酶基因NANH和NANP、胶原结合蛋白CBPA、菌毛基因MA、MC、ME和MG。其电泳图如图1所示，其中，M为DNAMARKERDL2000，1为POL，2为NANH，

20、3为NANP，4为CBPA，5为MA，6为MC，7为ME，8为MG。鉴定结果表明，化脓隐秘杆菌分离株存在溶血素基因PLO、神经氨酸酶基因NANH和NANP、胶原结合蛋白基因CBPA、菌毛基因MC和ME，无菌毛基因MA和MG。0037已知化脓隐秘杆菌具有广泛的宿主感染范围和感染组织，这与其含有胶原结合蛋白和神经氨酸酶等毒力因子有关。胶原在高等动物组织中普遍分布，为化脓隐秘杆菌利用胶原结合蛋白粘附感染组织提供可能，而神经氨酸酶能够分解宿主细胞的唾液酸，并降低膜表面黏液的黏滞性，便于细菌潜入深层组织。二者在菌体的定植和侵袭过程中起重要的作用。对化脓隐秘杆菌毒力因子的分子检测结果如图1，该结果表明该分

21、离株同时含有溶血素基因PLO、神经氨酸酶基因NANH和NANP、胶原结合蛋白基因CBPA、菌毛基因MC和MC，提示其致病力可能较强。0038另外，从分离菌中扩增出270BP化脓隐秘杆菌特异的溶血素基因POL片段。溶血素基因POL片段产生溶血素，溶血素是化脓隐秘杆菌的一种外毒素，具有溶解多种动物的红细胞、免疫细胞的特性，能诱导巨噬细胞凋亡，这可能与该菌感染引发化脓病灶相关，不同于其他毒力因子，该毒素在化脓隐秘杆菌分离株中普遍存在。因此，可用其基因作为检测化脓隐秘杆菌的靶标。00392）山羊源化脓隐秘杆菌DNA分子鉴定的特异性片段的鉴定0040利用细菌通用引物对化脓隐秘杆菌进行PCR鉴定，结果如图

22、2，扩增出长约1500BP说明书CN104073450A5/5页7的目的条带。PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳后回收的DNA分子鉴定的特异性片段，克隆至PMD18T载体，转化ECOLIDH5菌株，筛选阳性克隆使用载体引物M13/M13进行双向测序，将测定的16SRRNA基因序列与GENBANK中的16SRRNA基因序列进行同源性比较。0041通过细菌16SRRNA基因鉴定得出，从山羊化脓病灶中分离得到化脓隐秘杆菌。涂片染色镜检，可见革兰氏阳性棒状杆菌，单在或成丛，无明显链状存在。7攻毒试验0042挑取单个菌落，接种于含50L/L鲜血肉汤培养基，37震荡培养48H，然后进行活菌计数，调整菌液浓度至1

23、109CFU/ML，腹腔注射菌液02ML/只小鼠。观察临床症状，对死亡小鼠进行称量、剖检、细菌分离培养及病原鉴定，对未死亡小鼠进行体重称量，处死后进行剖检。0043小鼠在接种化脓隐秘杆菌后约1H后均表现精神沉郁、食欲减退等现象，1D后症状有所好转。7D后所有小鼠未死亡，处死小鼠。约1/3小鼠恢复健康，在接种部位有皮肤脓肿，生长速度与正常小鼠相当。其余小鼠停止生长，消瘦，体重较攻毒前下降，精神状态不佳。剖检未发现已恢复健康小鼠器官有明显可见病变，除了皮肤脓肿之外。消瘦小鼠有严重的腹膜炎，脓性腹膜包裹肝脏，肝脏遍布出血点，有大量坏死病灶，胃、肠道严重水肿，粘膜脱落，空无食物。其他器官组织无明显病变

24、。从上述小鼠病灶中分离、鉴定出化脓隐秘杆菌。0044山羊攻毒试验表明病变主要集中在接种部位。这些结果显示病变发生在接种部位或紧邻接种部位，提示病原不易在体内扩散。但病原菌对动物的危害则视感染部位和组织深度而异。从临床病例及攻毒试验结果来看，山羊化脓隐秘杆菌感染是慢性消耗性感染，不会发生急性死亡。但这种慢性感染为混合感染创造了条件，长期散播病原，使疫情复杂化。0045最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。说明书CN104073450A1/7页800010002序列表CN104073450A2/7页90003序列表CN104073450A3/7页100004序列表CN104073450A104/7页110005序列表CN104073450A115/7页120006序列表CN104073450A126/7页130007序列表CN104073450A137/7页14序列表CN104073450A141/1页15图1图2说明书附图CN104073450A15