微藻培养生产虾青素的生产工艺.pdf

1、10申请公布号CN104212865A43申请公布日20141217CN104212865A21申请号201410469553122申请日20140915C12P23/00200601C12R1/8920060171申请人李健地址102425北京市房山区新镇泳池路3号楼72发明人李健朱大玲谢修俊张兆雷74专利代理机构济南舜源专利事务所有限公司37205代理人张红凤54发明名称微藻培养生产虾青素的生产工艺57摘要本发明公开了一种利用微藻培养生产虾青素的生产工艺，属于微藻生物技术领域。其首先是在光生物反应器内培养雨生红球藻绿色细胞，并通过控制各个工艺参数，如培养液温度、培养液PH、表面光照、培养液

2、雷诺数和培养液湍流能耗散率等多种参数的综合影响来获得雨生红球藻绿色细胞；其次将雨生红球藻绿色细胞和培养基二加入到开放式微藻培养池中进行培养；最后通过对变红的雨生红球藻培养液进行分离等工序，提取得虾青素。该工艺可以以较经济的方法大规模地培养雨生红球藻的绿色细胞和促使红球藻在体内大量积累虾青素，可以实现雨生红球藻绿色细胞的室外高速生长、雨生红球藻体内高浓素的虾青素积累和高效率的收集雨生红球藻。51INTCL权利要求书3页说明书7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书7页附图1页10申请公布号CN104212865ACN104212865A1/3页21一种利用

3、雨生红球藻生产虾青素的工艺，其特征在于，包括以下步骤A选取适量的无菌雨生红球藻藻种和培养基一，将二者加入外封闭式光生物反应器进行工程培养，获得雨生红球藻绿色细胞，具体按照如下参数数值进行培养温度1228；PH7080；表面光照日光1200UEM2SEC1；雷诺数1200034000；湍流能耗散率104WKG11WKG1；B促使步骤A中雨生红球藻绿色细胞在体内大量积累虾青素，称取适量步骤A所得的雨生红球藻绿色细胞和培养基二，将二者加入开放式微藻培养池中进行培养，获得变红的雨生红球藻培养液，具体按照如下参数数值培养温度1038；PH7080；表面光照日光2000UEM2SEC1；雷诺数300005

4、0000；湍流能耗散率104WKG11WKG1；C将步骤B所得变红的雨生红球藻培养液进行分离，采收藻细胞并提取虾青素。2根据权利要求1所述的利用雨生红球藻生产虾青素的工艺，其特征在于所述培养基一包括如下组分权利要求书CN104212865A2/3页33根据权利要求1所述的利用雨生红球藻生产虾青素的工艺，其特征在于所述培养基二包括如下组分4根据权利要求1所述的利用雨生红球藻生产虾青素的工艺，其特征在于所述步骤C权利要求书CN104212865A3/3页4中将红色雨生红球藻培养液进行离心分离，弃上清液，收集红色的红球藻沉淀；然后将所述红球藻沉淀稀释后，依次进行高压均质、喷雾干燥法后得到干藻粉；最后

5、，将所得干藻粉与等体积的食用油混合，提取虾青素。5根据权利要求4所述的利用雨生红球藻生产虾青素的工艺，其特征在于稀释剂为水，稀释后的红球藻浓度为70GL1。权利要求书CN104212865A1/7页5微藻培养生产虾青素的生产工艺技术领域0001本发明涉及微藻生物技术领域，具体涉及一种工程利用雨生红球藻生物合成生产天然虾青素的方法。背景技术0002虾青素是一种常见于水生动物体内的橙红色类胡罗卜素，具有防止机体紫外线灼伤，促进免疫和生殖能力的等生物学功能。这些功能被认为主要是因为天然虾青素具有超强抗氧化以及清除体内自由基的能力。虾青素目前是三文鱼等高级水产养殖饲料的必要成份，也被开发成为保健食品用

6、作饲料添加剂，虾青素能提高动物的免疫力，繁殖力，存活率和生长速度，加强动物产品的外观色泽和营养价值；其用作保健品，虾青素能有效清除体内有害的自由基，有防止治疗紫外线灼伤，帮助机体从疲劳状态快速恢复，治疗炎症，提高人体免疫力和延缓衰老等功效。随着国内高档水产品养殖需求的不断扩大和人们对虾青素保健功能的逐渐认识，虾青素的国内外市产需求在急剧扩大。0003虾青素的生产工艺主要有化学合成和生物提取两大类。目前世界主要有两家公司利用化学合成法生产虾青素，年产量在150到200吨左右。虾青素的生物来源有主要有三种；一是甲壳类动物，二是红发夫酵母，三是雨生红球藻。甲壳类动物的虾青素含量很低，来源有限，不能够

7、大规模生产；红发夫酵母培养的方法生产虾青素长期受到关注，世界上也有两家公司在用这种方法在生产，红发夫酵母培养方法生产虾青素也是我国“十五”科技攻关重点项目中的一个专题，但是根据目前的工艺参数来看，和化学合成的方法相比还存在着生产成本过高的问题；雨生红球藻是含有虾青素最丰富的生物，利用雨生红球藻培养来生产虾青素近年来在国际上逐渐取得了成功，国外已经有三家公司在大规模生产，国内也已经有公司在做中试研究并尝试扩大化生产。利用雨生红球藻生产的虾青素和化工合成的虾青素相比，不仅在单位生产成本上可以竞争和化学合成的产品竞争，而且构像和鱼虾等动物体内的虾青素更相同，更适于用作水产养殖添加剂和人类保健品。化工

8、合成的虾青素的主要成分的构象和鱼虾体内的天然虾青素有所区别，用微藻培养的方法生产天然虾青素，被认为是有良好经济前景的高新工业技术。0004现有技术中利用雨生红球藻生产天然虾青素的主要技术难点在于，培养雨生红球藻细胞成本高、雨生红球藻在体内积累虾青素时容易被其它菌类污染；微藻产业能够比较经济地大规模生产的微藻类如螺旋藻盐藻等都是利用开放式藻池实现的，这些藻类的培养都是在极端条件下进行的。如螺旋藻的培养，是在碱性很强的培养基中进行，在这种极端条件下，其它生物不容易在藻池内生长，能有效克服其它生物的污染。适于培养雨生红球藻的培养基没有克服其它生物污染的特殊性质，不能在比较经济的开放式藻池内大规模稳定

9、生产。雨生红球藻的培养基中性偏碱，容易受到其它藻类，病毒，细菌，真菌，摄食藻类的原生动物和小型无脊椎动物的污染，这些污染物可以在几个小时或几天内，彻底破坏一整池红球藻的生产。0005为了解决上述问题，目前国内外公司普遍采用的方法是用封闭的光生物反应器来说明书CN104212865A2/7页6大量培养雨生红球藻绿色细胞。虽然光生物反应器的研究设计和建造取得了很大的进展，但是在应用光生物反应器培养雨生红球藻细胞时现有的生产工艺都没有考虑培养液的流体力学参数对微藻生长的影响；而雨生红球藻在体内积累虾青素这一现象受到多种因素的综合影响，如光照、温度、搅拌因素、PH值、氮元素浓度、碳元素浓度、磷元素浓度

10、和铁元素浓度等。这些因素彼此之间相互关联，导致在科研水平上搞清楚这些因素的综合影响和在工业规模以比较经济的手段实现比较高浓度的虾青素累积的条件都比较困难。发明内容0006为此，本发明提出了一种利用微藻培养生产虾青素的新工艺，该工艺以此包括雨生红球藻绿色细胞的培养、促使雨生球藻大量合成虾青素的工艺和雨生红球藻提取干燥工艺。该工艺可以以较经济的方法大规模地培养雨生红球藻的绿色细胞和促使红球藻在体内大量积累虾青素，可以实现雨生红球藻绿色细胞的室外高速生长、雨生红球藻体内高浓素的虾青素积累和高效率的收集雨生红球藻。0007其技术解决方案包括0008一种利用雨生红球藻生产虾青素的工艺，包括以下步骤000

11、9A选取适量的无菌雨生红球藻藻种和培养基一，将二者加入外封闭式光生物反应器进行工程培养，获得雨生红球藻绿色细胞，具体按照如下参数数值进行培养0010温度1228；0011PH7080；0012表面光照日光1200UEM2SEC1；0013雷诺数1200034000；0014湍流能耗散率104WKG11WKG1；0015B促使步骤A中雨生红球藻绿色细胞在体内大量积累虾青素，0016称取适量步骤A所得的雨生红球藻绿色细胞和培养基二，将二者加入开放式微藻培养池中进行培养，获得变红的雨生红球藻培养液，具体按照如下参数数值培养0017温度1038；0018PH7080；0019表面光照日光2000UEM

12、2SEC1；0020雷诺数3000050000；0021湍流能耗散率104WKG11WKG1；0022C将步骤B所得变红的雨生红球藻培养液进行分离，采收藻细胞并提取虾青素。0023作为本发明的一个优选方案，上述培养基一包括如下组分0024说明书CN104212865A3/7页70025作为本发明的另一个优选方案，上述培养基二包括如下组分00260027说明书CN104212865A4/7页80028上述步骤C中将红色的雨生红球藻培养液进行离心分离，弃上清液，收集红色的红球藻沉淀；然后将所述红球藻沉淀稀释后，依次进行高压均质、喷雾干燥法后得到干藻粉；最后，将所得干藻粉与等体积的食用油混合，提取虾

13、青素。0029上述稀释剂为水，稀释后的红球藻浓度为70GL1。0030本发明提供了一种利用微藻培养生产虾青素的工艺，其首先在光反应器内培养获得雨生红球藻绿色细胞，并通过控制各个工艺参数，如培养液温度、培养液PH、表面光照、培养液雷诺数和培养液湍流能耗散率等多种参数的综合影响来获得雨生红球藻绿色细胞，通过该工艺获得的雨生红球藻绿色细胞，其不容易受到其它藻类，病毒，细菌，真菌，摄食藻类的原生动物和小型无脊椎动物的污染；其次，为了促使雨生红球藻大量的合成虾青素，本发明将雨生红球藻绿色细胞和培养基二加入到开放式微藻培养池中进行培养，并且通过控制各个工艺参数，如温度、雷诺数等来获得变红的雨生红球藻培养液

14、；最后，通过对变红的雨生红球藻培养液进行分离等工序，提取得虾青素。0031本发明充分考虑了培养液流体力学参数对雨生红球藻培养的影响和优化了促使雨生红球藻积累虾青素的培养基，可以实现雨生红球藻绿色细胞的室外高速生长、雨生红球藻体内高浓素的虾青素积累和高效率的收集雨生红球藻。0032本发明工艺可以以较经济的方法大规模地培养雨生红球藻的绿色细胞和促使红球藻在体内大量积累虾青素，并且先通过在光反应器内培养，后在开放式微藻池中培养，本发明工艺特别适用于大规模的工业化生产。说明书CN104212865A5/7页9附图说明0033下面结合附图对本发明做进一步清楚、完整的说明0034图1为本发明利用微藻培养生

15、产虾青素的工艺流程图。具体实施方式0035本发明所选用的雨生红球藻藻种可通过商业渠道获得，培养基一、培养基二是自己配制得到的。0036本发明公开了一种利用微藻培养生产虾青素的工艺，结合图1所示，具体包括以下步骤0037步骤1选取一定量的无菌雨生红球藻藻种和培养基一，按照一定比例将二者加入外封闭式光生物反应器进行工程培养，获得雨生红球藻绿色细胞；0038步骤2将雨生红球藻绿色细胞移入开放式微藻池中，接着向该微藻池中加入培养基二，培养基二中的具体组分在下述实施例详细说明，该步骤2与现有技术相比，其可使得雨生红球藻绿色细胞在体内大量积累虾青素；0039步骤3将红色的雨生红球藻培养液进行离心分离，弃上

16、清液，收集红色的红球藻沉淀；然后将所述红球藻沉淀稀释后，依次进行高压均质、喷雾干燥法后得到干藻粉；最后，将所得干藻粉与等体积的食用油混合，提取虾青素。0040分别按照如下配方配制好培养基一和培养基二，培养基一的组分包括00410042说明书CN104212865A6/7页100043培养基二的组分包括00440045上述培养基一和培养基二配制完成后，密封备用。0046下面结合具体实施例做进一步说明0047实施例10048步骤1雨生红球藻绿色细胞的培养步骤；0049取5ML雨生红球藻无菌培养液，加入到装有100ML上述培养基一的锥形瓶中，光照说明书CN104212865A107/7页11培养20

17、天时间，雨生红球藻浓度达到021GL1后，转移到盛装有1L培养基一的锥形瓶中，继续光照培养，25天后，雨生红球藻浓度达到054GL1，接种雨生红球藻藻液到装有4L上述培养基一的室外光反应器中；0050采用放置遮阳网的办法控制照在光生物反应器表面的光强度在1000UE以下，设置光生物反应器的温度为20，通过向培养基一输入二氧化碳控制PH为75，调节光反应器的搅拌转速为300RPM，通气量为25L/MIN，这种条件下，雨生红球藻藻液的雷诺数约20000，湍流能耗散率为102WKG1，保持生产控制条件不变培养6天后，雨生红球藻藻液的浓度为050，计算表明，雨生红球藻藻液在光生物反应器中的生长速率为0

18、29/天。0051步骤2促使雨生红球藻绿色细胞在体内大量积累虾青素；0052称取上述培养基二35L，将光生物反应器培养好的即步骤1中的雨生红球藻藻液和培养基二混合，配得藻液约四十升，藻液浓度约为006G/L；0053将上述藻液转移到室外的开放式微藻池进行培养，用添加二氧化碳的办法控制培养液的PH为75，控制微藻培养池的转轮速度为50RPM，培养液的雷诺数为40000，湍流能耗散率为005W/KG，保持培养条件不变，添加自来水少许保持液面高度不变，连续培养5天，记录气温最低16，最高37，最高日照强度为1850UEM2SEC1，藻液的浓度为031，计算得红球藻生长速率为038/天，得变红的雨生红

19、球藻培养液。0054步骤3下游处理；0055将变红的雨生红球藻培养液从开放式微藻培养池转移到容量为50L的容器中，控制转速为3000RPM，离心分离10分钟，弃上清液，得雨生红球藻沉淀705G；用100ML自来水将获得的雨生红球藻沉淀稀释，然后加入到高压均质机中反复均质三次；将均质后的藻液在摄氏150度喷雾干燥，得干燥粉132克，藻粉的体积为18立方厘米，取少量藻粉测量虾青素含量为49。0056称取2克藻粉约占28立方厘米，加入到28ML的大豆油中，涡旋搅拌约30分钟，离心分离15分钟，分离藻粉和大豆油，将所获得的藻渣和变红的豆油分别和普通的豆油和2克未提取过的藻粉混合，涡旋搅拌约30分钟，离

20、心分离藻渣和上清油；0057重复用提取过虾青素的大豆油提取未别提取过的藻粉中的虾青素三次后，测豆油中虾青素含量为117，总体积为2毫升，向获得的虾青素油中加入09毫升普通大豆油，得含8的虾青素29毫升。0058实施例20059与实施例1不同之处在于步骤A中设置光生物反应器的温度为12，通过向培养基一输入二氧化碳控制PH为7，调节光反应器的搅拌转速为300RPM，通气量为25L/MIN。0060实施例30061与实施例1不同之处在于步骤A中设置光生物反应器的温度为28，通过向培养基一输入二氧化碳控制PH为8，调节光反应器的搅拌转速为300RPM，通气量为25L/MIN。说明书CN104212865A111/1页12图1说明书附图CN104212865A12