用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基、培养方法及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710247560.0 (22)申请日 2017.04.17 (71)申请人 山东省果树研究所 地址 271000 山东省泰安市龙潭路66号 (72)发明人 孙清荣 陈新 关秋竹 孙洪雁 张力思 (74)专利代理机构 济南誉丰专利代理事务所 (普通合伙企业) 37240 代理人 李茜 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基、 培养方法及其应用 (57)摘要 一种用于红树苺离体叶片产生不定芽的培 养

2、基、 培养方法及其应用， 其步骤是： 选取红树苺 离体叶片， 植入到不定芽诱导培养基进行培育， 形微软中国1， 把不定芽绿苗植入到生根培养 基进行培育， 形成试管生根小植株， 通过细胞分 裂素物质6苄基氨基嘌呤 （BA） 、 噻苯隆 （TDZ） 和 异戊烯基腺嘌呤 （2ip） 、 分别和生长素物质吲哚 丁酸 （IBA） 组合构成不定芽诱导培养基， 因此实 现了对红树苺离体叶片的产生不定芽培养。 权利要求书4页 说明书15页 附图2页 CN 107047303 A 2017.08.18 CN 107047303 A 1.一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法， 其特征是： 其步骤是： 选取红

3、树苺 离体叶片， 植入到不定芽诱导培养基进行培育， 形成微软中国1 ， 形微软中国2 植入到 生根培养基进行培育， 形成试管生根小植株， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.10.5mg/L IBA + 20g/L40g/L 蔗糖或 MS + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或 MS + 0.14 mg/L TDZ + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或NN69 + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖，

4、 生根培养基设置为1/4 MS + 0.11 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。 2.根据权利要求1所述的用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法， 其特征是： 不定 芽诱导培养基设置为： MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.10.5mg/L IBA + 20g/L40g/L 蔗 糖。 3.根据权利要求1所述的用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法， 其特征是： 其步 骤是： 一、 培养条件 实验中所用的培养基都在灭菌前调pH值到5.8， 然后在置121， 1个大气压下高压灭菌 20分钟， 培养室培养温度为25 2， 光照强度为3200勒克斯 （Lx） ， 光照周期为16小

5、时/ 天， 二、 叶片培养 选择红树苺品种 费尔杜德 （Fertod Zamatos） ， a、 试管苗继代增殖： 试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖， 获得健壮生长用于取叶的足够试材， 继代 增殖培养基设置为MS + 0.51.5 mg/L BA + 0.010.5 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/ L 蔗糖， b、 离体叶片培养诱导产生不定芽： 试管苗在继代增殖培养基上生长45周， 此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片， 用 无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤， 根据叶片大小切36刀， 至少一边的叶缘不切断， 保 持叶片是一个带多个伤口的完整叶片， 把切好的叶片接种在不

6、定芽诱导培养基， 诱导产生 不定芽绿苗， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.10.5mg/L IBA + 20g/L40g/L 蔗糖或 MS + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或 MS + 0.14 mg/L TDZ + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或NN69 + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖， c、 不定芽绿苗生根: 切取生长高度在1.5 厘米以上的不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培

7、养,培养 条件为先连续暗培养7天， 然后转到16小时光周期培养条件下培养， 形成试管生根小植株， 生根培养基设置为1/4 MS(MS无机成分减少到原来的1/4) + 0.11 mg/L IBA + 20 g/L 蔗糖。 4.根据权利要求1所述的用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法， 其特征是： 其步 骤是： 一、 培养条件 实验中所用的培养基都在灭菌前调pH值到5.8， 然后在置121， 1个大气压下高压灭菌 权 利 要 求 书 1/4 页 2 CN 107047303 A 2 20分钟， 培养室培养温度为24， 光照强度为3200勒克斯 （Lx） ， 光照周期为16小时/天， 二、 叶片培

8、养 选择红树苺品种 优系 号 ， a、 试管苗继代增殖： 试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖， 获得健壮生长用于取叶的足够试材， 继代 增殖培养基设置为MS + 0.7 mg/L BA + 0.4 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/L 蔗糖， b、 离体叶片培养诱导产生不定芽： 试管苗在继代增殖培养基上生长45周， 此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片， 用 无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤， 根据叶片大小切36刀， 至少一边的叶缘不切断， 保 持叶片是一个带多个伤口的完整叶片， 把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基， 形成不定 芽绿苗， 不定芽诱导培养基设置为： MS +

9、9.0 mg/L 2ip + 0.4mg/L IBA + 28g/L 蔗糖或 MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 40 g/L 蔗糖或 MS + 3mg/L TDZ + 0.4 mg/L IBA + 40 g/L 蔗糖或NN69 + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖， c、 形成不定芽绿苗生根: 切取生长高度在1.5 厘米以上的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养, 培养条件为先连续暗培养7天， 然后转到16小时光周期培养条件下培养， 形成试管生根小植 株， 生根培养基设置为1/4 MS + 0.11 mg/L IBA

10、+ 20 g/L蔗糖。 5.一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基， 设置为包含有继代增殖培养基、 不 定芽诱导培养基和生根培养基。 6.根据权利要求5所述的用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基， 其特征是： 不定芽 诱导培养基设置为包含有基本培养基、 植物生长调节剂和碳水化合物， 基本培养基设置为 包含有无机营养物质和有机添加物并且碳水化合物设置为蔗糖或其它糖类物质， 植物生长 调节剂设置为包含有细胞分裂素类物质和生长素类物质。 7.根据权利要求5所述的用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基， 其特征是： 继代增 殖培养基设置为MS + 0.51.5 mg/L BA + 0.010.5 mg

11、/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/L 蔗糖， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.10.5mg/L IBA + 20g/L 40g/L 蔗糖或 MS + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或 MS + 0.14 mg/L TDZ + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或NN69 + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖， 生根培养基设置为1/4 MS + 0.11 mg/L IBA + 20

12、g/L蔗糖， 或继代增殖培养基设置为MS + 0.7 mg/L BA + 0.5 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/L 蔗糖， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 9.0mg/L 2ip + 0.2mg/L IBA + 29g/L40g/L 蔗糖， 生根培养基设置为1/4 MS+ 0.9 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。 8.根据权利要求7所述的用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基， 其特征是：（1） MS （Murashige and Skoog） 培养基, 组成如下 （表1） ： 表1 MS 基本培养基组成 权 利 要 求 书 2/4 页 3 CN 107047

13、303 A 3 改良NN69培养基： 组成如下 （表2） ： 表2 NN69 基本培养基组成成分 权 利 要 求 书 3/4 页 4 CN 107047303 A 4 （2） 植物生长调节物质： 6苄基氨基嘌呤 （BA） ， 噻苯隆 （TDZ） , 异戊烯基腺嘌呤 （2ip） ， 吲哚丁酸 （IBA） ， （3） 碳源： 蔗糖， （4） 无离子水， （5） 琼脂粉。 9.一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法和用于红树苺离体叶片的产生不 定芽培养基在红树苺品种 费尔杜德 离体叶片再生不定芽的应用。 10.一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法和用于红树苺离体叶片的产生不 定芽培养基在红

14、树苺品种 优系 号 离体叶片再生不定芽的应用。 权 利 要 求 书 4/4 页 5 CN 107047303 A 5 用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基、 培养方法及其 应用 0001 一、 技术领域 本发明涉及一种产生不定芽培养基、 培养方法及其应用， 尤其是一种用于红树苺离体 叶片的产生不定芽培养基、 培养方法及其应用。 0002 二、 背景技术 植物离体叶片不定芽再生是诱变育种、 体细胞变异筛选、 嵌合体分离等细胞工程育种 的基础， 也是遗传转化操作、 外源基因转移等基因工程育种的基础， 和在一个新品种或新材 料较少时实现植物新品种快速繁殖的基础， 因此植物叶片的离体培养被广泛应用于植

15、物的 新种质创制及新品种的培育中。 0003 植物叶片培养始于20世纪50年代， 第一个获得叶片培养成功的植物种是紫箕， 之 后， 随着研究的深入， 培养基成分得到不断的改良和完善， 叶片培养成功的植物种越来越 多， 特别是离体体细胞诱变育种技术及植物遗传工程育种技术的应用和发展， 使叶片培养 研究越来越受到植物育种家的重视， 因为离体体细胞诱变和植物遗传转化操作的成功应用 依赖于离体叶片高效不定芽再生体系的建立， 现有的植物叶片培养， 获得不定芽再生成功 的植物种类也在与日俱增， 但由于不同物种遗传背景的复杂性， 至今还不能实现对所有植 物种的叶片培养再生， 即使已成功的物种， 由于不同类型

16、和不同品种其基因型的差异， 其再 生的难易和所需的培养基条件也存在较大差异； 特别是一些果树的品种其基因型高度杂 合， 品种之间遗传背景差异较大， 很难获得同种多个品种都能成功的培养基， 因此现有的组 培技术都是对特定物种的类型或品种是适宜的， 换一个品种或类型可能就是不适宜的或说 不是最佳的， 例如树苺现在已获得了很多品种或类型绿苗的组培快繁成功， 但叶片培养获得不定芽 的还没有取得技术上的完全成功， 现有的不同红树苺品种叶片再生不定芽的最有效植物生 长调节物质都是TDZ， 但再生率差异较大， 对红树苺品种 费尔杜德 （Fertod Zamatos） 进行 再生不定芽的诱导， 不能完成不定芽

17、再生。 0004 基于现有的技术问题、 技术特征和技术效果， 做出本发明的申请技术方案。 0005 三、 发明内容 本发明的客体是一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基， 本发明的客体是一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法， 本发明的客体是一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基和培养方法的应用。 0006 为了克服上述技术缺点， 本发明的目的是提供一种用于红树苺离体叶片的产生不 定芽培养基、 培养方法及其应用， 因此利于品种快速繁殖育苗和品种的改良。 0007 为达到上述目的， 本发明采取的技术方案是： 一种用于红树苺离体叶片的产生不 定芽培养方法， 其步骤是： 选取红树苺离体叶片，

18、 植入到不定芽诱导培养基进行培育， 形成 不定芽绿苗， 把不定芽绿苗植入到生根培养基进行培育， 形成试管生根小植株， 不定芽诱导 培养基设置为： MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.10.5mg/L IBA + 20g/L40g/L 蔗糖或 MS 说 明 书 1/15 页 6 CN 107047303 A 6 + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或 MS + 0.14 mg/L TDZ + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或NN69 + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L

19、 IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖， 生根培养基设置为1/4 MS + 0.11 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。 0008 由于设计了6苄基氨基嘌呤 （BA） 、 噻苯隆 （TDZ） 、 异戊烯基腺嘌呤 （2ip） 和吲哚 丁酸 （IBA） ， 通过6苄基氨基嘌呤 （BA） ， 噻苯隆 （TDZ） ， 异戊烯基腺嘌呤 （2ip） 和吲哚丁酸 （IBA） 两种以上的植物生长调节物质在不定芽诱导培养基的作用， 因此实现了对红树苺离 体叶片的产生不定芽培养。 0009 本发明设计了， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.1 0.5mg/L

20、 IBA + 20g/L40g/L 蔗糖。 0010 本发明设计了， 其步骤是： 一、 培养条件 实验中所用的培养基都在灭菌前调pH值到5.8， 然后在置121， 1个大气压下高压灭菌 20分钟， 培养室培养温度为25 2， 光照强度为3200勒克斯 （Lx） ， 光照周期为16小时/ 天， 二、 叶片培养 选择红树苺品种 费尔杜德 （Fertod Zamatos） ， a、 试管苗继代增殖： 试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖， 获得健壮生长用于取叶的足够试材， 继代 增殖培养基设置为MS + 0.51.5 mg/L BA + 0.010.5 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 3

21、0 g/ L 蔗糖， b、 离体叶片培养诱导产生不定芽： 试管苗在继代增殖培养基上生长45周， 此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片， 用 无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤， 根据叶片大小切36刀， 至少一边的叶缘不切断， 保 持叶片是一个带多个伤口的完整叶片， 把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基， 形成不定 芽绿苗， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.10.5mg/L IBA + 20g/ L40g/L 蔗糖或 MS + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或 MS + 0.14 mg/L TD

22、Z + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或NN69 + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖， c、 不定芽绿苗生根: 切取生长高度在1.5 厘米以上的不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养,培养 条件为先连续暗培养7天， 然后转到16小时光周期培养条件下培养， 形成试管生根小植株， 生根培养基设置为1/4 MS+ 0.11 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。 0011 本发明设计了， 其步骤是： 一、 培养条件 实验中所用的培养基都在灭菌前调pH值到5.8， 然后在置121， 1个大气压下高压灭

23、菌 20分钟， 培养室培养温度为24， 光照强度为3200勒克斯 （Lx） ， 光照周期为16小时/天， 二、 叶片培养 选择红树苺品种 优系 号 ， a、 试管苗继代增殖： 说 明 书 2/15 页 7 CN 107047303 A 7 试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖， 获得健壮生长用于取叶的足够试材， 继代 增殖培养基设置为MS + 0.7 mg/L BA + 0.4 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/L 蔗糖， b、 离体叶片培养诱导产生不定芽： 试管苗在继代增殖培养基上生长45周， 此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片， 用 无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，

24、根据叶片大小切36刀， 至少一边的叶缘不切断， 保 持叶片是一个带多个伤口的完整叶片， 把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基， 形成不定 芽绿苗， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 9.0 mg/L 2ip + 0.4mg/L IBA + 28g/L 蔗糖或 MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 40 g/L 蔗糖或 MS + 3mg/L TDZ + 0.4 mg/L IBA + 40 g/L 蔗糖或NN69 + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖， c、 形成不定芽绿苗生根: 切取生长高度在1.5 厘米以上的形成不定芽绿苗转移到生

25、根培养基上进行生根培养, 培养条件为先连续暗培养7天， 然后转到16小时光周期培养条件下培养， 形成试管生根小植 株， 生根培养基设置为1/4 MS+ 0.11 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。 0012 本发明设计了， 一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基， 设置为包含有继 代增殖培养基、 不定芽诱导培养基和生根培养基， 。 0013 本发明设计了， 不定芽诱导培养基设置为包含有基本培养基、 植物生长调节剂和 碳水化合物， 基本培养基设置为包含有无机营养物质和有机添加物并且碳水化合物设置为 蔗糖或其它糖类物质， 植物生长调节剂设置为包含有细胞分裂素类物质和生长素类物质。 0014

26、 本发明设计了， 继代增殖培养基设置为MS + 0.51.5 mg/L BA + 0.010.5 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/L 蔗糖， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.10.5mg/L IBA + 20g/L40g/L 蔗糖或 MS + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或 MS + 0.14 mg/L TDZ + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖或NN69 + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20

27、g/L40 g/L 蔗糖， 生根培养基设 置为1/4 MS+ 0.11 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。 0015 本发明设计了，（1） MS （Murashige and Skoog） 培养基, 组成如下 （表1） ： 表1 MS 基本培养基组成 说 明 书 3/15 页 8 CN 107047303 A 8 改良NN69培养基： 组成如下 （表2） ： 表2 NN69 基本培养基组成成分 说 明 书 4/15 页 9 CN 107047303 A 9 （2 ） 植物生长调节物质： 6苄基氨基嘌呤 （BA） ， 噻苯隆 （TDZ）, 异戊烯基腺嘌呤 （2ip） ， 吲哚丁酸 （IBA

28、） ， （3 ） 碳源： 蔗糖， （4 ） 无离子水， （5 ） 琼脂粉。 0016 本发明设计了， 继代增殖培养基设置为MS + 0.7 mg/L BA + 0.5 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/L 蔗糖， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 9.0mg/L 2ip + 0.2mg/L IBA + 29g/L40g/L 蔗糖， 生根培养基设置为1/4 MS+ 0.9 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。 0017 本发明设计了， 一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法和用于红树苺离 体叶片的产生不定芽培养基的实施例在红树苺品种 费尔杜德 离体叶片再生不定芽的应

29、 用。 0018 本发明设计了， 一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法和用于红树苺离 体叶片的产生不定芽培养基在红树苺品种 优系 号 离体叶片再生不定芽的应用。 0019 在本技术方案中， 植物叶片的离体培养， 是指在无菌和人工控制环境条件下， 以离 体叶片为外植体， 利用适当的培养基及培养方法诱导叶片产生不定芽的技术。 说 明 书 5/15 页 10 CN 107047303 A 10 0020 本发明的技术效果在于： 试管苗继代增殖。 实验室建立保存的红树苺品种 费尔杜 德 试管苗在增殖培养基上进行继代增殖培养， 获得健壮生长的试管绿苗， 为叶片培养提供 足够试材， 叶片培养诱导产生

30、不定芽， 试管苗在继代增殖培养基上生长45周时， 取健壮绿 苗顶端刚展开幼嫩叶片， 用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤,依据叶片大小， 切36刀 不等， 至少一边的叶缘不切断， 使叶片是一个有多个切口的完整叶片。 把有伤口的叶片逐个 接种在不定芽诱导培养基上。 不定芽诱导培养基包括基本培养基、 植物生长调节剂和碳水 化合物。 基本培养基主要包括无机营养物质 （大量营养元素和微量营养元素） 和有机添加 物。 碳水化合物通常是蔗糖或其他糖类物质， 碳水化合物的作用主要是作为培养基内的碳 源和能源， 并对维持培养基的渗透压起重要作用。 植物生长调节剂主要包括细胞分裂素类 物质和生长素类物质， 其作用

31、是调控植物生长和发育， 促进细胞分裂、 扩大、 伸长、 诱导芽的 分化及促进试管苗的生根等， 试管苗的生根， 试管苗的生根是植物组培快繁中关键的一步， 生根的失败就可能导致组培快繁的失败。 选用适宜的生根培养基进行试管苗生根诱导。 目 的是获得组织培养试管绿苗的生根小植株， 再把这些生根小植株从瓶内移栽到瓶外， 获得 育种的新材料或无性繁殖的试管苗， 实现优良品种试管苗工厂化生产， 针对树苺品种 费尔 杜德 叶片再生不定芽困难这一问题， 能有效克服叶片不定芽不能再生和再生率低的难题， 成功获得高效叶片不定芽再生。 不定芽继代繁殖后的绿苗成功获得生根， 对于该优良品种 的无性快繁育苗、 植物细胞

32、工程及基因工程的遗传改良也有很好的技术启示。 0021 在本技术方案中， 生根培养基中的1/4 MS表示生根培养基中MS的重量是不定芽诱 导培养基中MS的重量的14即根培养基中MS的重量与不定芽诱导培养基中MS的重量的比例 设置为1： 4。 0022 在本技术方案中， 以异戊烯基腺嘌呤 （2ip和吲哚丁酸 （IBA） 的不定芽诱导培养基 为重要技术特征， 在用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基、 培养方法及其应用的技术 领域中， 具有新颖性、 创造性和实用性， 在本技术方案中的术语都是可以用本技术领域中的 专利文献进行解释和理解。 0023 四、 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技

33、术中的技术方案， 下面将对实施例或现有技 术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据 这些附图获得其他的附图。 0024 图1为本发明的试管苗继代增殖的生长效果图： 图2为本发明的离体叶片培养诱导产生不定芽的生长效果图： A图不定芽诱导培养基为: MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L 40 g/L 蔗糖， B图不定芽诱导培养基为: MS + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20

34、g/L40 g/ L 蔗糖， C不定芽诱导培养基为: MS + 0.14 mg/L TDZ + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖， D不定芽诱导培养基为: NN69 + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/ L 蔗糖， 说 明 书 6/15 页 11 CN 107047303 A 11 图3为本发明的不定芽绿苗生根的生长效果图： 五、 具体实施方式 根据审查指南， 对本发明所使用的诸如 “具有” 、“包含” 以及 “包括” 术语应当理解为不 配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。 0025 在本发明的描述

35、中， 需要说明的是， 术语 “中心” 、“上” 、“下” 、“左” 、“右” 、“竖直” 、 “水平” 、“内” 、“外” 等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系， 仅是为了 便于描述本发明和简化描述， 而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、 以特定的方位构造和操作， 因此不能理解为对本发明的限制。 此外， 术语 “第一” 、“第二” 、 “第三” 仅用于描述目的， 而不能理解为指示或暗示相对重要性。 0026 在本发明的描述中， 需要说明的是， 除非另有明确的规定和限定， 术语 “安装” 、“相 连” 、“连接” 应做广义理解， 例如， 可以是固定连接， 也可以是

36、可拆卸连接， 或一体地连接； 可 以是机械连接， 也可以是电连接； 可以是直接相连， 也可以通过中间媒介间接相连， 可以是 两个元件内部的连通。 对于本领域的普通技术人员而言， 可以具体情况理解上述术语在本 发明中的具体含义。 0027 此外， 下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构 成冲突就可以相互结合。 0028 一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法， 下面结合实施例， 对本发明进 一步描述， 以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。 第一个实施例， 其步 骤是： 一、 培养条件 实验中所用的培养基都在灭菌前调pH值到5.8， 然后在置121，

37、1个大气压下高压灭菌 20分钟， 培养室培养温度为25， 光照强度为3200勒克斯 （Lx） ， 光照周期为16小时/天， 二、 叶片培养 选择红树苺品种 费尔杜德 （Fertod Zamatos） ， a、 试管苗继代增殖： 试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖， 获得健壮生长用于取叶的足够试材， 继代 增殖培养基设置为MS + 0.5 mg/L BA + 0.01 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/L 蔗糖， b、 离体叶片培养诱导产生不定芽： 试管苗在继代增殖培养基上生长4周， 此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片， 用无菌 手术刀片垂直于叶片中脉横切伤， 根据叶片大小

38、切3刀， 至少一边的叶缘不切断， 保持叶片 是一个带多个伤口的完整叶片， 把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基， 形成不定芽绿苗， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 3.0 mg/L 2ip + 0.1mg/L IBA + 20g/L 蔗糖， c、 形成不定芽绿苗生根: 切取生长高度在1.5 厘米的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养,培养 条件为先连续暗培养7天， 然后转到16小时光周期培养条件下培养， 形成试管生根小植株， 生根培养基设置为1/4 MS(MS无机成分减少到原来的1/4) + 0.1mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。 0029 本实施例的实验结果： 1. 试管苗

39、的增殖生长 试管苗在继代培养基MS + 0.51.5 mg/L BA + 0.010.5 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 说 明 书 7/15 页 12 CN 107047303 A 12 30 g/L蔗糖上增殖生长良好。 表现为既有增殖生长又有伸长生长， 叶展且叶色绿(图1)， 便 于叶片试材的采集和切取， 是较理想的增殖培养基。 0030 2.叶片培养诱导产生不定芽 叶片产生不定芽的适宜培养基为MS + 3.010.0 mg/L 2ip + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖， 不定芽再生率达88%， 且单位叶片不定芽数多 （图2， A） ； 在

40、培养基MS + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖 （图2， B） 和MS + 0.14 mg/L TDZ + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖 （图2， C） ， 再生率仅为15%； 在培养基NN69 + 15 mg/L BA + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖 （图2， D） 及NN69 + 29 mg/L 2ip + 0.10.5 mg/L IBA + 20 g/L40 g/L 蔗糖， 不定芽再生率在22%以下， 且每叶仅产 生1芽。 0031 4 试管苗的生根

41、 健康绿苗在生根培养基1/4 MS + 0.11 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上培养20天,生根 率在85%以上， 说明所选用生根培养基能有效诱导 费尔杜德 试管苗的生根 （图 ） 。 0032 第二个实施例， 其步骤是： 一、 培养条件 实验中所用的培养基都在灭菌前调pH值到5.8， 然后在置121， 1个大气压下高压灭菌 20分钟， 培养室培养温度为27， 光照强度为3200勒克斯 （Lx） ， 光照周期为16小时/天， 二、 叶片培养 选择红树苺品种 费尔杜德 （Fertod Zamatos） ， a、 试管苗继代增殖： 试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖， 获得健壮生长用于

42、取叶的足够试材， 继代 增殖培养基设置为MS +1.5 mg/L BA + 0.5 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/L 蔗糖， b、 离体叶片培养诱导产生不定芽： 试管苗在继代增殖培养基上生长45周， 此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片， 用 无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤， 根据叶片大小切36刀， 至少一边的叶缘不切断， 保 持叶片是一个带多个伤口的完整叶片， 把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基， 形成不定 芽绿苗， 不定芽诱导培养基设置为： MS + 10.0 mg/L 2ip +0.5mg/L IBA + 20g/L40g/L 蔗糖， c、 形成不定芽绿苗生根:

43、切取生长高度在1.5 厘米以上的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养, 培养条件为先连续暗培养7天， 然后转到16小时光周期培养条件下培养， 形成试管生根小植 株， 生根培养基设置为1/4 MS(MS无机成分减少到原来的1/4) + 1 mg/L IBA + 20 g/L蔗 糖。 0033 第三个实施例， 其步骤是： 一、 培养条件 实验中所用的培养基都在灭菌前调pH值到5.8， 然后在置121， 1个大气压下高压灭菌 20分钟， 培养室培养温度为23， 光照强度为3200勒克斯 （Lx） ， 光照周期为16小时/天， 二、 叶片培养 选择红树苺品种 费尔杜德 （Fertod Zama

44、tos） ， 说 明 书 8/15 页 13 CN 107047303 A 13 a、 试管苗继代增殖： 试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖， 获得健壮生长用于取叶的足够试材， 继代 增殖培养基设置为MS + 1.0mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/L 蔗糖， b、 离体叶片培养诱导产生不定芽： 试管苗在继代增殖培养基上生长45周， 此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片， 用 无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤， 根据叶片大小切36刀， 至少一边的叶缘不切断， 保 持叶片是一个带多个伤口的完整叶片， 把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基， 形成不定

45、芽绿苗， 不定芽诱导培养基设置为： MS +6.0 mg/L 2ip + 0.3mg/L IBA + 30g/L蔗糖， c、 形成不定芽绿苗生根: 切取生长高度在1.5 厘米以上的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养, 培养条件为先连续暗培养7天， 然后转到16小时光周期培养条件下培养， 形成试管生根小植 株， 生根培养基设置为1/4 MS(MS无机成分减少到原来的1/4) + 0.6 mg/L IBA + 20 g/L 蔗糖。 0034 第四个实施例， 其步骤是： 一、 培养条件 实验中所用的培养基都在灭菌前调pH值到5.8， 然后在置121， 1个大气压下高压灭菌 20分钟， 培养室培养温度为25 2， 光照强度为3200勒克斯 （Lx） ， 光照周期为16小时/ 天， 二、 叶片培养 选择红树苺品种 费尔杜德 （Fertod Zamatos） ， a、 试管苗继代增殖： 试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖， 获得健壮生长用于取叶的足够试材， 继代 增殖培养基设置为MS + 0.51.5 mg/L BA + 0.010.5 mg/L IBA + 6 g/L 琼脂 + 30 g/ L 蔗糖， b、 离体叶片培养诱导产生不定芽： 试管苗在继代增殖培养基上生长45周， 此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片， 用