一种用于烟草花粉的高效诱变方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102293154 A (43)申请公布日 2011.12.28 CN 102293154 A *CN102293154A* (21)申请号 201110200354.7 (22)申请日 2011.07.18 201010584695.4 2010.12.13 CN A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 湖北省烟草科研所 地址 430030 湖北省武汉市硚口区宝丰路 6 号香溢大酒店 4 楼 (72)发明人 蔡长春 林国平 曹景林 王毅 杨树 张俊杰 (74)专利代理机构 武汉楚天专利事务所 42113 代理人 雷速 (54) 发明名称 一种用于烟草花

2、粉的高效诱变方法 (57) 摘要 本发明涉及一种用于烟草花粉的高效诱变 方法。该方法是在无菌条件下获取烟草花粉并 置于液体培养基中用浓度为 0.1-0.2的 EMS 在 30-32的环境下避光诱变处理， 再用 NLN-16 液 体培养基在 30-32避光环境下进行染色体加倍 处理， 之后置于 NLN-13 液体培养基中在 24-26 的环境下避光进行诱胚培养， 待幼胚出现即可用 24-26摇床避光振荡培养， 最后出现子叶的胚置 于固体培养基进行继代培养， 移栽季节幼苗经炼 苗后即可移栽入大田进行突变性状鉴定。本发明 克服了基因表达上显隐性的障碍， 有利于选择， 且 大大缩短了突变体性状稳定的周

3、期， 节省了育种 时间 ； 具有变异幅度大、 诱变频率高等特点。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 CN 102293154 A1/2 页 2 1. 一种用于烟草花粉的高效诱变方法， 其特征在于 ： 所述方法依次按以下操作步骤进 行 ： (1) 样品采集 ： 取烟株主花序或侧花序上健康的、 花粉处于单核靠边期的适龄花蕾， 迅 速保存于冰盒 ； (2) 消毒处理 ： 在超净工作台上剥取花蕾中的花药， 将取出的花药用无菌纱布或无菌 市售丝袜装好浸入 70-75浓度的乙醇中消毒 10-15s

4、， 再浸入饱和次氯酸钙溶液中浸泡 8-10min， 最后用无菌水漂洗多次 ； (3) 收集花粉 ： 将步骤 2 中消毒处理后的花药放入圆底试管中， 加入 1-3ml 的 B5-13 液 体培养基， 再加入 1-2ml 用于软化花药壁的酶液， 碾成匀浆， 然后用装有 300-400 目双层尼 龙膜的漏斗进行过滤， 并用离心管收集滤液， 离心处理后去上清液， 加 B5-13 液体培养基重 新悬浮， 再次离心处理后去上清液 ； (4) 诱变处理 ： 将步骤 3 中经过两次离心处理后收集的花粉用 B5-13 液体培养基悬浮， 加入浓度为 0.1-0.2的 EMS 溶液进行诱变处理， 放入温度为 30-

5、32的环境下避光培养 8-10h ； (5) 加倍处理 ： 将步骤 4 中诱变处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液 8-10min， 再用 NLN-16 液体培养基悬浮后转入玻璃容器中， 放置在温度为 30-32的环境避 光培养 50-70h， 进行加倍处理 ； (6) 诱胚培养 ： 将步骤 5 中的加倍处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清 液， 用 NLN-13 液体培养基悬浮花粉， 转入培养皿中， 放置在温度为 24-26的环境下， 进行 避光诱胚培养 14-21d， 待培养皿中出现幼胚， 便将培养皿放置转速为 56-65r/min 的摇床 内， 在温度为 24-26环境

6、下避光振荡培养 6-8d ； (7) 继代培养 ： 将步骤 6 中培养皿内出现子叶的胚转移到 MS 固体培养基上， 在温度为 25-27、 日光照为 8-10h 的环境中进行继代培养 ； (8) 幼苗转植 ： 对步骤 7 中继代培养的幼苗进行炼苗， 将通过炼苗后的幼苗根部的培养 基清洗干净， 移栽到温室的花钵中假植或者直接栽种于大田中进行突变体鉴定。 2. 根据权利要求 1 所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法， 其特征在于 ： 步骤 1 中 所述的适龄花蕾为长度在 2.0-2.3cm 之间、 花冠与花萼等长、 花粉发育时期为单核靠边期 的花蕾。 3. 根据权利要求 1 所述的一种用于烟草花粉

7、的高效诱变方法， 其特征在于 ： 步骤 2 中 的饱和次氯酸钙的浓度为 10 ； 无菌水漂洗 2-3 次， 每次 4-6min。 4. 根据权利要求 1 所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法， 其特征在于 ： 步骤 3 中 所述酶液为纤维素酶、 果胶酶、 蜗牛酶和水的混合液， 酶液中纤维素酶、 果胶酶和蜗牛酶的 质量浓度分别为 0.6、 0.2和 0.5。 5. 根据权利要求 1 所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法， 其特征在于 ： 步骤 3 中 第一次离心时间 5min， 转速 1000r/min， 二次离心时间 5min， 转速 500r/min ； 步骤 5 和 6 中 的离心处理时间

8、都为 5min， 转速 800r/min。 6. 根据权利要求 1 所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法， 其特征在于 ： 步骤 5 中 NLN-16 液体培养基中秋水仙素的浓度为 45-65mg/L。 7. 根据权利要求 1 所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法， 其特征在于 ： 步骤 5 中 权 利 要 求 书 CN 102293154 A2/2 页 3 加倍处理的玻璃容器为 100ml 三角瓶， 每瓶装 10ml 溶液， 密度为 3-4 蕾 /ml。 权 利 要 求 书 CN 102293154 A1/6 页 4 一种用于烟草花粉的高效诱变方法 技术领域 0001 本发明涉及烟草诱变技术

9、领域， 特别是涉及一种用于烟草花粉的高效诱变方法。 背景技术 0002 烟 草 (Nicotiana tabacum L， .) 在 植 物 分 类 学 上 属 于 双 子 叶 植 物 纲 (Dicotyledoneae)、 管花目(Tubifiorae)、 茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)， 是许多 国家的重要经济作物， 其中烤烟(2n24II)是中国也是世界上种植面积最大的烟草类型。 0003 长期以来， 由于烟草育种中过度使用为数不多的几个主体亲本， 加之定向选择， 使 得育成品种遗传基础狭窄、 品种单一化现象日趋严重， 导致很难培育出有较大突破性的新 品种， 经

10、常出现新品种 “审而不种” 的尴尬局面， 也给以遗传多样性为基础的分子标记遗传 连锁图谱构建和基因定位带来了较大困难。 0004 已有的研究表明， 尽管不同烟草种间遗传多样性较种内稍显丰富， 但相比其他农 作物如水稻、 油菜、 玉米等其种质资源间的遗传多样性仍相差甚远。因为对种间杂交后代 性状的改良其难度更大， 所需时间更多， 因此在实际的育种工作中较少会利用种间杂交方 式培育新品种， 而更多的是利用同一烟草类型即种内亲本来选育品种以缩短对目标后代综 合性状的改良时间。因此， 国内许多烟草科技工作者试图通过物理和化学等人为诱变的方 法以有效拓宽烟草狭窄的遗传背景， 丰富其种质资源的遗传多样性，

11、 这些诱变方法一般是 利用 X- 射线、 - 射线、 60Co、 中子、 高速离子、 宇宙射线等物理因素， 或者甲基磺酸乙酯 (EMS)、 硫酸二乙酯 (DES)、 叠氮化钠、 碱基类似物、 PEG 等化学因素对烟草种子、 幼苗、 茎尖、 幼胚、 合子等组织进行诱变处理， 也取得了一些较好的成果。 但这些诱变处理不同程度的存 在诱变剂难吸收、 诱变频率低、 变异幅度小、 后代筛选难度大、 产量低及易产生嵌合体等问 题。 发明内容 0005 本发明根据现有技术的不足提供一种用于烟草花粉的高效诱变方法， 该方法在烟 草花粉离体液体培养的游离状态下施以 EMS 化学诱变， 可大大增强烟草遗传物质对外

12、界诱 变因素的敏感性， 从而成倍提高诱变频率和变异幅度， 产生变异的花粉再经过加倍处理后 以纯合二倍体的形式将突变性状予以很好的保持和固定， 克服了基因表达上显隐性的障 碍， 有利于选择， 且大大缩短了突变体性状稳定的周期， 节省了育种时间 0006 为实现上述目的， 本发明所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法， 其具体步骤 依次如下 ： 0007 (1) 样品采集 ： 取烟株主花序或侧花序上健康的、 花粉处于单核靠边期的适龄花 蕾， 迅速保存于冰盒 ； 0008 (2) 消毒处理 ： 在超净工作台上剥取花蕾中的花药， 将取出的花药用无菌纱布或 无菌市售丝袜装好浸入 70-75浓度的乙醇中消毒

13、 10-15s， 再浸入饱和次氯酸钙溶液中浸 泡 8-10min， 最后用无菌水漂洗多次 ； 说 明 书 CN 102293154 A2/6 页 5 0009 (3) 收集花粉 ： 将步骤 2 中消毒处理后的花药放入圆底试管中， 加入 1-3ml 的 B5-13液体培养基， 再加入1-2ml用于软化花药壁的酶液， 碾成匀浆， 然后用装有300-400目 双层尼龙膜的漏斗进行过滤， 并用离心管收集滤液， 离心处理后去上清液， 加 B5-13 液体培 养基重新悬浮， 再次离心处理后去上清液 ； 0010 (4) 诱变处理 ： 将步骤 3 中经过两次离心处理后收集的花粉用 B5-13 液体培养 基悬

14、浮， 加入浓度为 0.1-0.2的 EMS( 甲基磺酸乙酯 ) 溶液进行诱变处理， 放入温度为 30-32的环境下避光培养 8-10h ； 0011 (5) 加倍处理 ： 将步骤 4 中诱变处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上 清液8-10min， 再用NLN-16液体培养基悬浮后转入玻璃容器中， 放置在温度为30-32的环 境避光培养 50-70h， 进行加倍处理 ； 0012 (6) 诱胚培养 ： 将步骤 5 中的加倍处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去 上清液， 用 NLN-13 液体培养基悬浮花粉， 转入培养皿中， 放置在温度为 24-26的环境下， 进行避光诱胚培养 14-

15、21d， 待培养皿中出现幼胚， 便将培养皿放置转速为 56-65r/min 的摇 床内， 在温度为 24-26环境下避光振荡培养 6-8d ； 0013 (7) 继代培养 ： 将步骤 6 中培养皿内出现子叶的胚转移到 MS 固体培养基上， 在温 度为 25-27、 日光照为 8-10h 的环境中进行继代培养 ； 0014 (8) 幼苗转植 ： 对步骤 7 中继代培养的幼苗进行炼苗， 将通过炼苗后的幼苗根部的 培养基清洗干净， 移栽到温室的花钵中假植或者直接栽种于大田中进行突变体鉴定。 0015 步骤1中所述的适龄花蕾为长度在2.0-2.3cm之间、 花冠与花萼等长、 花粉发育时 期为单核靠边期

16、的花蕾。 0016 步骤 2 中的饱和次氯酸钙的浓度为 10 ； 无菌水漂洗 2-3 次， 每次 4-6min。 0017 步骤 3 中所述酶液为纤维素酶、 果胶酶、 蜗牛酶和水的混合液， 酶液中纤维素酶、 果胶酶和蜗牛酶的质量浓度分别为0.6、 0.2和0.5。 步骤3中第一次离心时间5min， 转速 1000r/min， 二次离心时间 5min， 转速 500r/min ； 步骤 5 和 6 中的离心处理时间都为 5min， 转速 800r/min。 0018 步骤 5 中 NLN-16 液体培养基中秋水仙素的浓度为 45-65mg/L。 0019 步骤 5 中加倍处理的玻璃容器为 100

17、ml 三角瓶， 每瓶装 10ml 溶液， 密度为 3-4 蕾 /ml。 0020 本发明在烟草花粉离体液体培养的游离状态下施以 EMS 化学诱变， 可大大增强烟 草遗传物质对外界诱变因素的敏感性， 从而成倍提高诱变频率和变异幅度， 较容易产生超 诱变材料， 而产生变异的花粉再经过加倍处理后以纯合二倍体的形式将突变性状予以很好 的保持和固定， 克服了基因表达上显隐性的障碍， 有利于选择， 且大大缩短了突变体性状稳 定的周期， 节省了育种时间。 0021 本发明所述的烟草花粉诱变方法对不同烟草类型均适用。实践证明， 用本发明的 方法对处于离体液体培养状态下的烤烟花粉进行诱变处理， 具有诱变频率高、

18、 变异幅度大、 变异类型丰富及较容易获得性状纯合的变异材料等优点， 在拓宽烟草遗传背景、 丰富遗传 多样性、 增加分子标记多态性、 创新种质资源及花粉发育进程研究等方面， 具有较大的实用 价值。 说 明 书 CN 102293154 A3/6 页 6 具体实施方式 0022 实施例 1 ： 烤烟材料 1 花粉离体液体培养诱变， 其操作步骤如下 ： 0023 (1)、 样品采集 ： 取烤烟烟株主花序上单核靠边期的健康适龄花蕾， 长度范围为 2.0-2.2cm， 取好的花蕾迅速用 4-7的冰盒保存 ； 0024 (2)、 消毒处理 ： 将步骤 1 中冰盒内的花蕾取出， 在超净工作台用镊子小心剥取出

19、 花蕾中的花药， 用无菌纱布装好花药浸入 70的乙醇中 15s， 再浸入 10的饱和次氯酸钙 溶液中 8min， 用无菌水冲洗 3 次， 每次 5min ； 0025 (3)、 收集花粉 ： 将步骤 2 中消毒处理后的花药放入圆底大试管中， 加入 2ml 的 B5-13液体培养基(B5基本培养基中蔗糖浓度为13)， 再加入1-2ml纤维素酶质量浓度为 0.6、 果胶酶质量浓度为 0.2和蜗牛酶质量浓度为 0.5的混合酶液用于软化花药壁， 之后用圆头玻璃棒碾成匀浆， 用装有 300 目双层尼龙膜的漏斗进行过滤， 并用 10ml 的离心 管收集滤液， 离心 5min， 转速 1000r/min，

20、去掉上清液， 加 B5-13 液体培养基重新悬浮， 离心 5min， 转速 500r/min， 去上清夜 ； 0026 (4)、 诱变处理 ： 将步骤 3 中经过两次离心处理后收集的花粉用 4ml B5-13 液体培 养基悬浮， 加入浓度为 0.1的 EMS 溶液 6ml 进行诱变处理， 放置于温度为 30的环境中避 光培养 10h ； 0027 (5)、 加倍处理 ： 将步骤 4 中的诱变处理后的溶液移入离心管中， 离心 8min， 转速 900r/min， 去掉上清液， 用秋水仙素浓度为 45mg/L 的 NLN-16 液体培养基悬浮后转入 100ml 三角瓶进行加倍处理， 每瓶 10ml

21、， 密度 3 蕾 /ml， 32避光培养 55h ； 0028 (6)、 诱胚培养 ： 将步骤 5 中的加倍处理后的溶液移入离心管中， 离心 5min， 转 速 800r/min， 去掉上清液， 用 NLN-13 液体培养基悬浮花粉， 转入培养皿中， 放置在温度为 24-26的环境下， 避光诱胚培养 18d， 待幼胚出现即可用转速为 65r/min 的摇床在 24避 光振荡培养 6d ； 0029 (7)、 继代培养 ： 将步骤 6 中出现子叶的胚移置于 MS 固体培养基进行继代培养， 其 温度为 25， 每日光照 10h ； 0030 (8)、 幼苗转植 ： 移栽季节幼苗经炼苗 2-3d 后

22、即可移栽到温室的花钵中假植或者 于烟苗移栽季节直接栽种于大田中进行突变体鉴定， 移栽前务必彻底清洗烟苗根系上附带 的培养基。 0031 对诱变处理后代的突变表型进行了初步鉴定， 共获得双单倍体后代材料 214 株， 其中表型可明显分辨为突变的如皱叶、 早花突变体共有 2 株， 诱变频率达到了 0.93， 其余 材料外观与正常野生型植株无明显差别， 待进一步开展其他性状鉴定， EMS 对烟草种子的诱 变频率一般 0.1， 这种方法提高了近 10 倍。 0032 实施例 2、 烤烟材料 2 花粉离体液体培养诱变， 其操作步骤如下 ： 0033 (1)、 样品采集 ： 取烤烟烟株侧花序上单核靠边期的

23、健康适龄花蕾， 长度范围为 2.1-2.3cm， 取好的花蕾迅速用冰盒 4-7保存 ； 0034 (2)、 消毒处理 ： 将步骤 1 中冰盒内的花蕾取出， 在超净工作台上小心剥取花蕾中 的花药， 用无菌市售丝袜装好花药浸入 75的乙醇中 10s， 再浸入 10的饱和次氯酸钙溶 液中 10min， 用无菌水冲洗 2 次， 每次 5min ； 0035 (3)、 收集花粉 ： 将步骤 2 中消毒处理后的花药移入圆底大试管中， 加入 3ml 的 说 明 书 CN 102293154 A4/6 页 7 B5-13 液体培养基 (B5 基本培养基中蔗糖浓度为 13 )， 再加入 1-2ml 纤维素酶质量

24、浓度 为 0.6、 果胶酶质量浓度为 0.2和蜗牛酶质量浓度为 0.5的混合酶液用于软化花药 壁， 之后用圆头玻璃棒碾成匀浆， 用装有400目双层尼龙膜的漏斗进行过滤， 并用10ml的离 心管收集滤液， 离心 5min， 转速 1000r/min， 弃上清液， 加 B5-13 液体培养基重新悬浮， 离心 5min， 转速 500r/min， 去掉上清夜 ； 0036 (4)、 诱变处理 ： 将步骤3经过两次离心处理后收集的花粉用6mlB5-13液体培养基 悬浮， 加入浓度为 0.2的 EMS 溶液 4ml 进行诱变处理， 32避光培养 8h ； 0037 (5)、 加倍处理 ： 将步骤4中的诱

25、变处理后的溶液离心9min， 转速800r/min， 弃上清 液， 用秋水仙素浓度为 65mg/L 的 NLN-16 液体培养基悬浮后转入 100ml 三角瓶进行加倍处 理， 每瓶 10ml， 密度 4 蕾 /ml， 30避光培养 69h ； 0038 (6)、 诱胚培养 ： 将步骤 5 中的加倍处理后的溶液移置离心管中， 离心 5min， 转 速 800r/min， 去掉上清液， 用 NLN-13 液体培养基悬浮花粉， 转入培养皿中， 放置在温度为 24-26的环境下避光诱胚培养21d， 待幼胚出现即可用转速为55r/min摇床在温度为26 的环境下避光振荡培养 8d， ； 0039 (7)

26、、 继代培养 ： 将步骤 6 中出现子叶的胚移置于 MS 固体培养基进行继代培养， 温 度为 26， 每日光照 8h ； 0040 (8)、 幼苗转植 ： 移栽季节幼苗经炼苗 2-3d 后即可移栽到温室的花钵中假植或者 于烟苗移栽季节直接栽种于大田中进行突变体鉴定， 移栽前务必彻底清洗烟苗根系上附带 的培养基。 0041 对诱变处理后代的突变表型进行了初步鉴定， 共获得双单倍体后代材料 125 株， 发现迟花多叶突变体 1 株， 其余材料外观与正常野生型植株无明显差别， 表型突变率达到 了 0.8， 也高于 EMS 对烟草种子的诱变频率。 0042 NLN 四个母液配方如下 ： 0043 1.

27、 大量元素 (20 倍 )， 单位 ： g/L 0044 0045 2. 铁盐 (20 倍 )， 单位 ： g/L 0046 0047 3、 微量元素 (200 倍 )， 单位 ： g/L 说 明 书 CN 102293154 A5/6 页 8 0048 0049 注意 ： 硫酸铜和氯化钴可先配成一级母液 (200100 倍 )。 0050 4. 有机成分 (200 倍 )， 单位 ： g/L 0051 药品 用量 (g/L) 肌醇 20 烟酸 1.0 甘氨酸 0.4 盐酸硫氨 (B1) 0.1 盐酸吡哆素 (B6) 0.1 叶酸 0.1 生物素 0.01 谷氨酰胺 160 丝氨酸 20 谷胱甘肽 (GSH) 6.0 0052 NLN-13 培养基 (1000ml) 0053 0054 NLN-16 培养基 (1000ml) 说 明 书 CN 102293154 A6/6 页 9 0055 0056 注 ： 此专利中的 NLN-16 含有秋水仙素浓度为 45-65mg/L。配制时应注意 ： 0057 1、 调 PH 值 ： 培养基配好后， 灭菌前 PH 值必须调整在 5.85 5.95 之间。 0058 2、 培养基灭菌 ： NLN-13 和 NLN-16 不能高温高压灭菌， 必须用规格为 0.22um 的滤 膜抽滤灭菌。 说 明 书