一种油茶无性系组培外植体脱毒方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102696482 B (45)授权公告日 2013.06.12 CN 102696482 B *CN102696482B* (21)申请号 201210200050.5 (22)申请日 2012.06.18 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 湖南省林业科学院 地址 410004 湖南省长沙市韶山南路 658 号 (72)发明人 陈永忠 王瑞 陈隆升 王湘南 彭邵锋 罗健 马力 杨小胡 唐炜 王金路 王磊 (74)专利代理机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 43113 代理人 卢宏 (54) 发明名称 一种油茶无性系组培外植体脱毒方法 (57

2、) 摘要 本发明公开了一种油茶无性系组培外植体脱 毒方法， 包括如下步骤 ：（1） 将油茶无性系组培外 植体进行低温预处理 ；（2） 将低温预处理后的油 茶无性系组培外植体用乙醇消毒， 冲洗， 然后用 HgCl2处理 ； 其中， 所述的HgCl2处理是分两次以上 对油茶无性系组培外植体进行间歇性处理， HgCl2 处理的总时间为 4 20 分钟， HgCl2每处理一次 后用水冲洗。本发明的方法操作简单， 污染率低， 克服了传统保存率低的技术问题。 (51)Int.Cl. 审查员 王涛 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利

3、要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102696482 B CN 102696482 B *CN102696482B* 1/1 页 2 1. 一种油茶无性系组培外植体脱毒方法， 包括如下步骤 ： （1） 将油茶无性系组培外植体在 4恒温箱低温处理 3-7 天 ； （2）将经步骤 （1）低温处理的油茶无性系组培外植体进行修剪， 在质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液中浸泡 2 4 分钟， 流水冲洗 2 4 小时 ； （3） 将经步骤 （2） 处理后的油茶无性系组培外植体用体积百分比浓度 75% 的乙醇消毒 10 15 秒， 无菌水冲洗 3 4 次， 然后用质量百分比浓度

4、 0.1% 的 HgCl2处理 2 10 分钟， 无菌水冲洗 3 4 次， 然后再用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 2 10 分钟， 无菌水冲 洗 6 8 次。 2. 如权利要求 1 所述的脱毒方法， 其特征在于， 所述的油茶无性系组培外植体为当年 生带芽枝条。 3. 如权利要求 2 所述的脱毒方法， 其特征在于， 将经步骤 （1） 处理的带芽枝条取出后剪 成一叶一芽的茎段， 然后在质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液中浸泡 2 4 分钟， 流水冲 洗 2 4 小时， 然后再进行步骤 （3） 的处理。 4. 如权利要求 1 所述的脱毒方法， 其特征在于， 所述的油茶无性系组培外

5、植体为当年 生带叶枝条。 5. 如权利要求 4 所述的脱毒方法， 其特征在于， 将经步骤 （1） 处理的带叶枝条取出后剪 取叶片， 将叶片在在质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液中浸泡 2 4 分钟， 流水冲洗 2 4 小时， 然后再进行步骤 （3） 的处理。 6. 如权利要求 1 所述的脱毒方法， 其特征在于， 所述的油茶无性系组培外植体为未成 熟果实。 7. 如权利要求 6 所述的脱毒方法， 其特征在于， 将经步骤 （1） 处理的未成熟果实的种子 取出， 去掉外种皮， 将种子用在质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液中浸泡 2 4 分钟， 流水 冲洗 2 4 小时， 然后再进行步骤 （3

6、） 的处理。 8. 如权利要求 3 或 5 所述的脱毒方法， 其特征在于， 所述的步骤 （1） 低温处理是指在 4恒温箱中水培。 权 利 要 求 书 CN 102696482 B 2 1/5 页 3 一种油茶无性系组培外植体脱毒方法 技术领域 0001 本发明涉及一种油茶无性系组培外植体脱毒方法， 具体是提供一种通过预处理及 “多步式消毒法” 获得大量油茶无性系无菌苗的方法。 背景技术 0002 油茶 （Camellia spp） 是山茶科(Theacae)山茶属(Camellia)中种子含油量高、 具 有生产价值的油用物种的总称， 是我国特有的优质木本油料树种， 与油棕、 椰子和油橄榄并 称

7、为世界四大木本油料树种 （庄瑞林， 中国油茶M， 北京:中国林业出版社， 1988） 。 我国现 有油茶栽培面积 4531 万亩， 主要分布于南方 14 个省 （区） ， 油茶种子榨取的茶油风味独特， 营养丰富， 脂肪酸组成合理， 不饱和脂肪酸含量高达 90%， 油酸含量 80% 以上， 不含人体难以 吸收的芥酸和山俞酸， 也不含会引起人体血压增高而导致血管硬化的胆固醇， 油质优于橄 榄油等其它食用油， 是理想的食用油 （陈永忠， 杨小胡， 彭邵锋， 等， 我国油茶良种选育研究 现状及发展策略 J， 林业科技开发， 2005， 19（4） ： 1-4） 。茶油的副产品茶枯和茶壳还可以 通过综合

8、利用提取茶皂素、 磨制刨光粉和发酵高蛋白饲料等， 油茶果壳可生产活性碳和提 取鞣料等， 所以通过深加工和综合利用可大幅度提高油茶产品的附加值。油茶适应性广、 耐瘠薄， 是南方低山、 丘陵和岗地很好的经济林树种之一， 不与粮、 棉争地， 而且还具有一 年种植， 多年受益的特点， 丰产期长达 80 年， 在我国南方农村经济和生态建设中占有很重 要的地位 （黎先胜， 我国油茶资源的开发利用研究 J， 湖南科技学院学报， 2005， 26 (11) ： 127-129） ， 发展油茶生产有利于缓解我国食用油长期依赖进口， 供需紧张的矛盾， 对提高我 国国民经济和人民生活水平具有重大意义。 0003 油

9、茶种苗繁育主要采用播种育苗和芽苗砧嫁接法。 过去油茶繁殖方法主要是播种 育苗， 后代分化严重， 难以保持母株的优良性状， 一般 68 年始果， 产量高低不一。目前油茶 种苗繁育主要采用无性繁殖方式芽苗砧嫁接法， 该方法技术难度大， 嫁接成活率和合格 苗出圃率均较低， 出圃时间长达 2 年， 造林成活率不稳定， 造林成本高， 林相整齐度差， 苗木 繁殖系数低， 难以满足全国油茶产业发展对油茶优良无性系的需求， 迫切需要研究油茶优 良无性系高效组培快繁新技术。 0004 组培快繁技术是一种广泛用于农业、 林业的无性繁殖方法， 具有繁殖速度快、 方法 简单、 操作容易， 材料消耗少， 不受季节和地域

10、限制的特点， 同时子代能够保持母株的优良 遗传特性。因此， 研究油茶优良无性系组培快繁技术， 对缓解油茶苗木紧张、 加快油茶产业 发展， 缓解我国食用油紧张局面， 推动农村经济和社会主义新农村建设具有重大战略意义。 植物组织培养需经过初代、 继代、 生根、 移栽四个阶段， 得到完整植株。 初代培养阶段无菌材 料的获取是组培能否成功的关键， 因植物材料表面常常带有各种微生物， 而培养基营养全 面， 适合微生物生长， 且接种后植物组织失去了表皮的保护， 抵抗力不强， 所以如果灭菌不 彻底的话， 微生物将迅速滋生， 抑制甚至杀死植物组织细胞， 使前功尽弃。 0005 目前， 对油茶组织培养外植体脱毒

11、技术的研究很少， 黄雅莉等研究了不同外植体 消毒时间对油茶组织培养的影响， 研究结果表明， HgCl2消毒 6min 效果最好， 油茶岑软 2 号 说 明 书 CN 102696482 B 3 2/5 页 4 与岑软 3 号的成活率分别达到 71% 与 73%（黄雅莉， 张日清， 马锦林， 等， 油茶愈伤组织和芽 诱导培养条件的筛选 . 经济林研究， 2010， 28（1） ： 30-34） 。刘海龙等对油茶不同外植体的 灭菌条件进行了研究， 研究结果表明， 以油茶种子、 茎段为外植体， 采用酒精、 升汞、 高锰酸 钾 3 种灭菌剂， 探讨不同处理对外植体污染和种子萌发的影响。结果表明， 油茶

12、茎段较好 的灭菌方法 : 毛刷刷洗 +75% 酒精 1015s+0.1%HgCl21015min， 污染率最低为 24.5% ； 新萌 条较好的灭菌方法 ： 75% 酒精 47s+0.1%HgCl256 min， 污染率最低为 14.3% ； 种子灭菌的条 件 ： 0.5%KMnO4024 h+75% 酒精 315 min+0.1%HgCl22040 min（不剥壳去皮） ， 75% 酒精 30 s+0.1%HgCl2 8 min（剥壳去皮） ， 这 2 种处理污染率均较低， 种子发芽率相差不大 （刘海龙， 陈晓明， 蔡玲， 油茶不同外植体灭菌条件研究， 广西林业科学， 2010， 39（2）

13、 ： 61-63， 68） 。毕 方铖等用 2.5% 次氯酸钠、 消毒时间 20min 对腋芽消毒效果最好， 污染率为 10%， 芽的萌发诱 导率为 85% （毕方铖， 谭晓风， 张智俊， 等， 油茶离体培养诱导再生植株的研究 J. 经济林研 究， 2004， 22 (2) ： 5-9） 。 0006 根据现有技术表明， 油茶组培外植体脱毒多采用 “两步式消毒法” ， 即 75% 乙醇 5-30 秒 + 无菌水 2-3 次 +0.1%HgCl25-40 分钟 + 无菌水 5-6 次， 采用这种方法材料保存率 低， 由于灭菌时间难以控制， 若时间太短， 灭菌不彻底， 材料会因微生物滋生死亡， 若

14、灭菌时 间过长， 灭菌剂会对植物组织细胞产生毒害而萌发困难， 导致萌芽率低。 发明内容 0007 本发明旨在克服现有技术中的不足， 提供一种油茶无性系组培外植体脱毒方法。 0008 为了达到上述目的， 本发明提供的技术方案为 ： 0009 所述油茶无性系组培外植体脱毒方法， 包括如下步骤 ： 0010 （1） 将油茶无性系组培外植体在 0 10条件下进行低温预处理 ； 0011 （2） 将低温预处理后的油茶无性系组培外植体用乙醇消毒， 冲洗， 然后用 HgCl2处 理 ； 其中， 所述的 HgCl2处理是分两次以上对油茶无性系组培外植体进行间歇性处理， HgCl2 处理的总时间为 4 20 分

15、钟， HgCl2每处理一次后用水冲洗。 0012 乙醇消毒和单次 HgCl2处理的操作过程是本领域的常规操作步骤和条件。例如乙 醇消毒是采用体积百分比浓度 75% 的乙醇消毒处理， 单次 HgCl2处理是用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 ； 其中的处理时间可根据不同外植体并结合本领域常识作适当调整。 0013 优选地， 步骤 （1） 是将油茶无性系组培外植体放置于 4恒温箱低温处理 3-7 天 ； 步骤 （2） 是将低温处理后的油茶无性系组培外植体用体积百分比浓度75%的乙醇消毒10 15秒， 无菌水冲洗34次， 然后用质量百分比浓度0.1% 的HgCl2处理210分钟， 无菌水

16、 冲洗 3 4 次， 然后再用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 2 10 分钟， 无菌水冲洗 6 8 次。 0014 进一步， 本方法还包括如下步骤 ： 将经步骤 （1） 低温处理后的油茶无性系组培外 植体取出后进行预处理， 然后在 0.1% 的多菌灵溶液中浸泡 2 4 分钟， 流水冲洗 2 4 小 时， 然后再进行步骤 （2） 的处理。 0015 其中， 所述的油茶无性系组培外植体为从油茶健壮植株上剪取的当年生带芽枝条 带叶枝条或未成熟果实。所用的组培外植体可以依据现有技术中公布的方法获得。 0016 当外植体为当年生带芽枝条时， 将经步骤 （1） 低温处理的带芽枝条取出后剪成一

17、 说 明 书 CN 102696482 B 4 3/5 页 5 叶一芽的茎段， 即， 将叶片剪掉， 保留叶柄， 然后在质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液中浸 泡 2 4 分钟， 流水冲洗 2 4 小时， 然后再进行步骤 （2） 的处理。其中， 所述的步骤 （1） 低 温处理是指在 4恒温箱中水培。 0017 当外植体为当年生带叶枝条时， 将经步骤 （1） 低温处理的带叶枝条取出后剪取叶 片， 将叶片在在质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液中浸泡 2 4 分钟， 流水冲洗 2 4 小 时， 然后再进行步骤 （2） 的处理。其中， 所述的步骤 （1） 低温处理是指在 4恒温箱中水培。 001

18、8 当外植体为未成熟果实时， 将经步骤 （1） 低温处理的未成熟果实的种子取出， 去掉外种皮， 将种子用在质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液中浸泡 2 4 分钟， 流水冲洗 2 4 小时， 然后再进行步骤 （2） 的处理。 0019 上述方法中步骤 （2） 的处理过程在超净工作环境下完成。 0020 与现有技术相比， 本发明方法的有益效果为 ： 0021 本发明方法主要包括外植体预处理及 “多步式消毒法” 步骤， 与传统的 “两步式消 毒法” 不同， 采用本发明的脱毒方法能使外植体污染率低于 6.7%， 萌芽率达 95.5% 以上。本 发明方法操作简单， 污染率低， 克服了传统保存率低的技

19、术问题。 附图说明 0022 图 1 是油茶组培苗接种后的实验结果图 ； 0023 图 2 是油茶组培苗萌芽状态的实验结果图 ； 0024 图 3 是油茶组培苗展叶状态的实验结果图 ； 0025 图 4 是油茶叶片愈伤组织诱导的试验结果图 ； 0026 图 5 是油茶种子愈伤组织诱导的试验结果图。 具体实施方式 0027 实施例 1 0028 从油茶健壮植株上剪取当年生带芽枝条， 采回后放置于 4恒温箱水培 3 天 ； 将枝 条剪成一叶一芽的茎段， 用质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液浸泡 3 分钟， 浸泡后流水冲 洗 2 小时 ； 在超净工作台上， 先用体积百分比浓度 75% 乙醇消毒

20、10 秒， 用无菌水冲洗 4 次， 然后用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 3 分钟， 无菌水冲洗 4 次， 然后再用质量百分比 浓度 0.1% 的 HgCl2处理 3 分钟， 无菌水冲洗 8 次， 污染率为 6.7%， 萌芽率为 100%。 0029 具体操作如下 ： 0030 （1） 4 月份从油茶健壮植株上剪取当年生带芽枝条， 带回后放入 1 升的烧杯中， 加 入 200 毫升纯净水， 放入 4恒温箱水培 3 天。 0031 （2） 枝条从恒温箱取出后剪成一叶一芽的茎段 （将叶片剪掉， 保留叶柄） ， 然后用质 量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液浸泡 2 4 分钟， 浸泡后

21、流水冲洗 2 小时。 0032 （3） 将流水冲洗后的外植体放置超净工作台上， 先用体积百分比浓度 75% 乙醇消 毒 10 秒， 用无菌水冲洗 3 次， 然后用质量百分比浓度 0.1%HgCl2处理 2 分钟， 无菌水冲洗 3 次， 然后再用 HgCl2处理 3 分钟， 无菌水冲洗 6 次， 冲洗完以后用剪刀将茎段两端剪掉 2 3 毫米， 同时将叶柄剪掉， 然后接种于初代培养基上， 培养基用 300ml 的广口瓶分装， 每瓶 30ml， 封口膜包扎， 在 121和 1.1kg.cm-2条件下， 用高压蒸汽灭菌锅灭菌 20min。培养条件 说 明 书 CN 102696482 B 5 4/5

22、页 6 的筛选 ： 在培养温度为 252， 光照 1500 2000LX， 每日光照时间为 12h 的培养室中培 养。其中， 所用培养基为本领域常规培养基。 0033 结果参见图 1 至 3。 0034 实施例 2 0035 从油茶健壮植株上剪取当年生带芽枝条， 采回后放置于 4恒温箱水培 5 天 ； 将枝 条剪成一叶一芽的茎段， 用质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液浸泡 3 分钟， 浸泡后流水冲 洗 2 小时 ； 在超净工作台上， 先用体积百分比浓度 75% 乙醇消毒 15 秒， 用无菌水冲洗 3 次， 然后用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 3 分钟， 无菌水冲洗 3 次，

23、 然后再用质量百分比 浓度 0.1% 的 HgCl2处理 4 分钟， 无菌水冲洗 6 次， 污染率为 4.4%， 萌芽率为 95.5%。具体操 作中的其他步骤同实施例 1。 0036 实施例 3 0037 从油茶健壮植株上剪取当年生带芽枝条， 采回后放置于 4恒温箱水培 7 天 ； 将枝 条剪成一叶一芽的茎段， 用质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液浸泡 3 分钟， 浸泡后流水冲 洗 3 小时 ； 在超净工作台上， 先用体积百分比浓度 75% 乙醇消毒 15 秒， 用无菌水冲洗 3 次， 然后用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 3 分钟， 无菌水冲洗 3 次， 然后再用质量百分比

24、 浓度 0.1% 的 HgCl2处理 5 分钟， 无菌水冲洗 8 次， 污染率为 0%， 萌芽率为 97.8%。具体操作 中的其他步骤同实施例 1。 0038 实施例 4 0039 从油茶健壮植株上剪取当年生枝条， 采回后放置于 4恒温箱水培 5 天 ； 水培后剪 取叶片， 将叶片用质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液浸泡 2 分钟， 浸泡后流水冲洗 2 小时 ； 在超净工作台上， 先用体积百分比浓度 75% 乙醇消毒 10 秒， 用无菌水冲洗 3 次， 然后用质量 百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 2 分钟， 无菌水冲洗 3 次， 然后再用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处

25、理 2 分钟， 无菌水冲洗 6 次， 污染率为 4%， 愈伤组织诱导率达 100%。 0040 具体操作如下 ： 0041 （1） 3-5 月份从油茶健壮植株上剪取当年生枝条， 带回后放入 1 升的烧杯中， 加入 200 毫升纯净水， 放入 4恒温箱水培 5 天。 0042 （2） 枝条从恒温箱取出后剪取叶片， 将叶片用质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液 浸泡 2 分钟， 浸泡后流水冲洗 1 小时。 0043 （3） 将流水冲洗后的外植体放置超净工作台上， 先用体积百分比浓度 75% 乙醇消 毒 10 秒， 用无菌水冲洗 3 次， 然后用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 2 分

26、钟， 无菌水冲 洗 3 次， 然后再用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 2 分钟， 无菌水冲洗 6 次， 冲洗完以后 用剪刀剪除叶缘、 叶柄及叶脉， 将叶片剪成 0.5cm*0.5cm， 然后接种于诱导培养基上， 培养基 用300ml的广口瓶分装， 每瓶30ml， 封口膜包扎， 在121和1.1kg.cm-2条件下， 用高压蒸汽 灭菌锅灭菌 20min。培养条件的筛选 ： 温度为 252； 光照条件 ： 暗培养 20 天后转入光培 养， 光培养条件为光照 1500 2000LX， 每日光照时间为 12h。其中， 所用培养基为本领域常 规培养基。 0044 实施例 5 0045 7

27、月份从油茶健壮植株上剪取油茶未成熟果实， 采回后放置于 4恒温箱低温处 理 5 天 ； 低温处理后将种子取出 （去掉果皮） ， 然后将外种皮去掉， 将种子用质量百分比浓度 说 明 书 CN 102696482 B 6 5/5 页 7 0.1% 的多菌灵溶液浸泡 3 分钟， 浸泡后流水冲洗 2 小时 ； 在超净工作台上， 先用体积百分比 浓度 75% 乙醇消毒 15 秒， 用无菌水冲洗 3 次， 然后用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 3 分钟， 无菌水冲洗 3 次， 然后再用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 5 分钟， 无菌水冲洗 6 次， 污染率为 3%， 愈伤组织诱

28、导率达 100%。 0046 具体操作如下 ： 0047 （1） 7 月份从油茶健壮植株上剪取油茶未成熟果实， 带回后放入 4恒温箱低温处 理 5 天。 0048 （2） 果实从恒温箱取出后去掉果皮及外种皮， 然后将种子用质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液浸泡 3 分钟， 浸泡后流水冲洗 2 小时。 0049 （3） 将流水冲洗后的外植体放置超净工作台上， 先用体积百分比浓度 75% 乙醇消 毒15秒， 用无菌水冲洗3次， 然后用质量百分比浓度0.1%的HgCl2处理3分钟， 无菌水冲洗 3 次， 然后再用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 5 分钟， 无菌水冲洗 6 次， 冲洗

29、完以后用 手术刀剪除内种皮， 然后接种于诱导培养基上， 培养基用 300ml 的广口瓶分装， 每瓶 30ml， 封口膜包扎， 在 121和 1.1kg.cm-2条件下， 用高压蒸汽灭菌锅灭菌 20min。培养条件的筛 选 ： 在培养温度为 252， 光照 1500 2000LX， 每日光照时间为 12h 的培养室中培养。其 中， 所用培养基为本领域常规培养基。 0050 实施例 6 0051 10 月份从油茶健壮植株上剪取油茶成熟果实， 采回后放置于 4恒温箱低温处 理 7 天 ； 低温处理后将种子取出 （去掉果皮） ， 然后将外种皮去掉， 将种子用质量百分比浓度 0.1% 的多菌灵溶液浸泡 4 分钟， 浸泡后流水冲洗 4 小时 ； 在超净工作台上， 先用体积百分比 浓度 75% 乙醇消毒 15 秒， 用无菌水冲洗 4 次， 然后用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 8 分钟， 无菌水冲洗 4 次， 然后再用质量百分比浓度 0.1% 的 HgCl2处理 10 分钟， 无菌水冲洗 8 次， 污染率为 5%， 愈伤组织诱导率达 98.7%。具体操作中的其他步骤同实施例 5。 说 明 书 CN 102696482 B 7 1/1 页 8 图 1图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102696482 B 8