一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201611040847.8 (22)申请日 2016.11.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106718878 A (43)申请公布日 2017.05.31 (73)专利权人 云南省农业科学院花卉研究所 地址 650000 云南省昆明市盘龙区北京路 2238号 专利权人 玉溪云星生物科技有限公司 (72)发明人 余蓉培 杨春梅 张颢 阮继伟 吴丽芳 汪国鲜 单芹丽 (74)专利代理机构 昆明合众智信知识产权事务 所 53113 代理人 康珉 (51)Int

2、.Cl. A01H 4/00(2006.01) 审查员 李世超 (54)发明名称 一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快 速繁殖方法 (57)摘要 本发明公开一种以幼孢子囊群为外植体的 扇蕨组培快速繁殖方法。 该方法包括扇蕨无菌幼 孢子囊群外植体的获得、 绿色球状体的诱导、 绿 色球状体的增殖、 绿色球状体的分化、 组培苗培 养和生根。 本发明直接以扇蕨无菌幼孢子囊群为 外植体诱导出扇蕨绿色球状体仅需为42天50 天， 缩短了绿色球状体的诱导周期， 且繁殖效率 高， 绿色球状体诱导率达96100， 增殖倍数达 6.217.47倍， 绿色球状体的分化率达100， 生 根率达100， 繁殖周期短，

3、对于珍稀濒危植物扇 蕨种群数量的扩大， 以及扇蕨野生资源的可持续 开发利用具有重要意义。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 106718878 B 2018.12.25 CN 106718878 B 1.一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法， 其特征在于包括以下步骤： (1)扇蕨无菌幼孢子囊群外植体的获得 选择带有扇蕨幼孢子囊群的扇蕨叶片， 用软的毛刷蘸1体积分数的洗洁精水对扇蕨 幼孢子囊群表面进行清洗， 除去扇蕨幼孢子囊群表面的小鳞片和杂物， 直至可见黄绿色的 扇蕨幼孢子囊， 然后用手术刀片将扇蕨幼孢子囊群从叶片上剥离， 放置于烧杯中， 流动水冲 洗11.5小时， 再在无

4、菌条件， 将扇蕨幼孢子囊群用5体积分数的次氯酸钠溶液消毒12 15分钟， 无菌水冲洗56次， 每次冲洗5分钟， 即得扇蕨无菌幼孢子囊群外植体； 所述扇蕨幼 孢子囊为黄绿色， 且孢子囊壁完整， 孢子囊外壁覆盖有棕褐色鳞片的扇蕨孢子囊； (2)扇蕨绿色球状体的诱导 将步骤(1)中获得的扇蕨无菌幼孢子囊群切成小块， 接种于绿色球状体诱导培养基上， 2025暗培养48小时， 然后转入光照培养， 培养时间为4048天， 得到扇蕨绿色球状 体， 光照培养条件为： 2025,每天的光照时间为12小时， 光照强度为2000lx； 所述绿色 球状体诱导培养基为： 1/4MS1/2MS+TDZ 0.51.0mg/

5、L+NAA 0.10.3mg/L+蔗糖30.0g/L +琼脂7.0g/L， pH为5.80； (3)扇蕨绿色球状体的增殖 将步骤(2)诱导获得的扇蕨绿色球状体切割成块， 接种于绿色球状体增殖培养基上， 培 养时间为30天， 得到增殖的扇蕨绿色球状体， 培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相 同； 所述绿色球状体增殖培养基为： 1/2MSMS+6-BA 0.30.5mg/L+NAA 0.10.3mg/L+蔗 糖30.0g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80； (4)扇蕨绿色球状体的分化 将步骤(3)增殖得到的扇蕨绿色球状体切割成块， 接种于绿色球状体分化培养基上， 培 养时间为30天，

6、得到分化幼苗， 培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同， 所述绿色 球状体分化培养基为： 1/4MS1/2MS+KT0.10.2mg/L+水解酪蛋白100180mg/L+活性炭1 2g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80； (5)扇蕨组培苗的培养和生根 将步骤(4)得到的分化幼苗接种于组培苗培养和生根培养基上， 培养时间为60天， 每30 天更换一次组培苗培养和生根培养基， 得到植株高度为1.5cm以上的生根组培苗， 培养条件 与步骤(2)中所述的光照培养条件相同， 所述组培苗培养和生根培养基为： 1/2MSMS+NAA 0.20.3mg/L+活性炭12g/L+蔗糖2

7、0g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80。 2.根据权利要求1所述的一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法， 其特 征在于： 步骤(2)中所述的将步骤(1)中获得的无菌扇蕨幼孢子囊群切成小块的大小为1mm 2mm1mm2mm1mm2mm； 步骤(3)中所述的将步骤(2)诱导获得的扇蕨绿色球状体切割 成块的大小为13mm13mm13mm； 步骤(4)中所述的将步骤(3)增殖得到的扇蕨绿色 球状体切割成块大小为13mm13mm13mm。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106718878 B 2 一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明属植物

8、组织培养领域， 具体涉及一种以幼孢子囊为外植体的扇蕨组培快速 繁殖方法。 背景技术 0002 扇蕨Neocheiropteris palmatopedata(Barker)Christ ,隶属水龙骨科 (Polypodiaceae)扇蕨属， 草本植物。 根状茎粗壮横走， 密被鳞片； 叶片扇形， 鸟足状掌形分 裂， 形态奇特， 具有较高观赏价值。 为中国特产的蕨类植物， 产于云南、 四川、 贵州， 生长于海 报1500-2700米的密林或山崖林下。 扇蕨不仅具有观赏价值， 还在蕨类植物系统发育中具有 重要研究价值， 但由于生境的破坏， 其野外分布种群数量急剧减少，国家重点保护野生植 物名录(第一

9、批) 将其列为国家二级重点保护野生植物。 0003 野外调查中发现， 扇蕨通过孢子繁殖产生的实生孢子体较少， 大部分都过根状茎 繁殖来维持种群。 有性生殖周期长及配子体发育形成孢子体的百分率低是扇蕨主要的濒危 原因， 自然生境的破坏更加剧了濒危程度。 0004 蕨类植物组培快速繁殖方法主要包括： (1)孢子无菌培养， 即： 以孢子为外植体进 行组培繁殖， 繁殖周期较长， 部分蕨类种类形成孢子体的百分率较低。 (2)以孢子体为外植 体的组培繁殖， 其中以孢子体为外植体诱导绿色球状体， 并构建绿色球状体繁殖途径， 是目 前蕨类植物组培快速繁殖中最为高效的方法， 但需要经过大量的试验才能筛选到适宜的

10、外 植体和激素组合， 因此， 已构建绿色球状体组培繁殖途径的蕨类植物种类十分有限。 0005 目前， 已有扇蕨组织培养的相关报道， 但现有技术以无菌孢子体为外植体的扇蕨 组培繁殖方法， 主要是以通过孢子无菌培养获得的无菌孢子体幼苗为外植体， 其先从成熟 孢子播种到诱导出无菌孢子体幼苗至少需要56个月， 且无菌孢子体幼苗的诱导率仅30 左右， 获得外植体的周期较长， 繁殖效率低。 尚未见以幼孢子囊群直接为外植体的扇蕨组培 快速繁殖方法的相关报道。 发明内容 0006 为解决扇蕨自然繁殖力低、 现有扇蕨组培培养从成熟孢子萌发形成原叶体原叶 体增殖原叶体诱导获得无菌孢子体幼苗为外植体至少需要56个月

11、， 且无菌孢子体幼苗 的诱导率仅30左右， 繁殖周期长， 繁殖效率低， 适宜的无菌孢子体外植体难以获得的技术 问题， 本发明提供一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法。 0007 本发明提供的一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法， 包括以下步 骤： 0008 (1)扇蕨无菌幼孢子囊群外植体的获得 0009 选择带有扇蕨幼孢子囊群的扇蕨叶片， 用软的毛刷蘸1体积分数的洗洁精水对 扇蕨幼孢子囊群表面进行清洗， 除去扇蕨幼孢子囊群表面的小鳞片和杂物， 直至可见黄绿 色的扇蕨幼孢子囊， 然后用手术刀片将扇蕨幼孢子囊群从叶片上剥离， 放置于烧杯中， 流动 说 明 书 1/6 页 3 C

12、N 106718878 B 3 水冲洗11.5小时， 再在无菌条件， 将扇蕨幼孢子囊群用5体积分数的次氯酸钠溶液消毒 1215分钟， 无菌水冲洗56次， 每次冲洗5分钟， 即得扇蕨无菌幼孢子囊群外植体； 所述扇 蕨幼孢子囊为黄绿色， 且其孢子囊壁完整， 孢子囊外壁覆盖有棕褐色鳞片的扇蕨孢子囊； 0010 (2)扇蕨绿色球状体的诱导 0011 将步骤(1)中获得的扇蕨无菌幼孢子囊群切成小块， 接种于绿色球状体诱导培养 基上， 2025暗培养48小时， 然后转入光照培养， 培养时间为4048天， 得到扇蕨绿色 球状体， 光照培养条件为： 2025,每天的光照时间为12小时， 光照强度为2000lx

13、； 所述 绿色球状体诱导培养基为： 1/4MS1/2MS+TDZ 0.51.0mg/L+NAA 0.10.3mg/L+蔗糖 30.0g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80； 0012 (3)扇蕨绿色球状体的增殖 0013 将步骤(2)诱导获得的扇蕨绿色球状体切割成块， 接种于绿色球状体增殖培养基 上， 培养时间为30天， 得到增殖的扇蕨绿色球状体， 培养条件与步骤(2)中所述的光照培养 条件相同； 所述绿色球状体增殖培养基为： 1/2MSMS+6-BA 0.30.5mg/L+NAA 0.1 0.3mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80； 0014 (4)扇蕨绿色球

14、状体的分化 0015 将步骤(3)增殖得到的扇蕨绿色球状体切割成块， 接种于绿色球状体分化培养基 上， 培养时间为30天， 得到分化幼苗， 培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同， 所述 绿色球状体分化培养基为： 1/4MS1/2MS+KT0.10.2mg/L+水解酪蛋白100180mg/L+活 性炭12g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80； 0016 (5)扇蕨组培苗的培养和生根 0017 将步骤(4)得到的分化幼苗接种于组培苗培养和生根培养基上， 培养时间为60天， 每30天更换一次组培苗培养和生根培养基， 得到植株高度为1.5cm以上的生根组培苗， 培养 条件

15、与步骤(2)中所述的光照培养条件相同， 所述组培苗培养和生根培养基为： 1/2MSMS+ NAA 0.20.3mg/L+活性炭12g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80。 0018 2.根据技术方案1所述的一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法， 步骤(2)中所述的将步骤(1)中获得的无菌扇蕨幼孢子囊群切成小块的大小为1mm2mm 1mm2mm1mm2mm； 步骤(3)中所述的将步骤(2)诱导获得的扇蕨绿色球状体切割成块的 大小为13mm13mm13mm； 步骤(4)中所述的将步骤(3)增殖得到的扇蕨绿色球状体 切割成块大小为13mm13mm13mm。 0019 与

16、现有技术相比， 本发明的主要创新点及有益效果： 0020 1、 本发明方法大幅度地缩短了扇蕨组培苗的繁殖时间。 0021 本发明方法直接用扇蕨无菌幼孢子囊群为外植体诱导出扇蕨绿色球状体， 仅需为 4250天， 克服了现有技术扇蕨组织培养仅仅获得无菌孢子体幼苗外植体至少需要56个 月， 繁殖周期长的缺陷， 因此， 本发明方法大幅度地缩短了扇蕨组培苗的繁殖时间。 0022 2、 本发明方法大幅度地提高了扇蕨组培繁殖效率。 本发明方法诱导出扇蕨绿色球 状体的诱导率达96100， 增殖倍数高达到6.21-7.49倍， 而现有获得无菌孢子体幼苗 外植体的诱导率仅为30左右。 0023 3、 与现有技术相

17、比， 本发明方法产生了预料不到的技术效果。 说 明 书 2/6 页 4 CN 106718878 B 4 附图说明 0024 图1是扇蕨幼孢子囊群。 图中的线段为比例尺， 表示的长度为1cm。 0025 图2是本发明方法以扇蕨无菌幼孢子囊群为外植体诱导形成扇蕨绿色球状体图。 图中线段为比例尺， 表示长度为 1mm。 0026 图3是本发明方法诱导出的扇蕨绿色球状体。 图中的线段为比例尺， 表示的长度为 1mm。 0027 具体实施方法 0028 以下的实施例便于更好地理解本发明。 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料均为市售。 以下实施例中的定量

18、试验， 均设置 三次重复实验， 结果取平均值。 0029 以下各实施例培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含 量混合后， 用pH计调pH为该培养基要求的pH值并按常规植物组织培养的培养基消毒灭菌后 即制成。 0030 实施例1本发明方法 0031 (1)扇蕨无菌幼孢子囊群外植体的获得 0032 选择长势良好且带有扇蕨幼孢子囊群的扇蕨叶片， 用柔软的细毛刷蘸1体积分 数的洗洁精水对扇蕨幼孢子囊群表面进行清洗， 除去扇蕨幼孢子囊群表面的小鳞片和杂 物， 直至可见黄绿色的扇蕨幼孢子囊， 然后用手术刀片小心的将扇蕨幼孢子囊群从叶片上 剥离， 放置于烧杯中， 流动水冲洗1小时。 然后，

19、 在无菌条件将扇蕨幼孢子囊群用5体积分 数的次氯酸钠溶液消毒12分钟， 无菌水冲洗5次， 每次冲洗5分钟， 即得扇蕨无菌幼孢子囊群 外植体。 0033 所述扇蕨幼孢子囊群是扇蕨幼孢子囊成群聚生在一起的扇蕨幼孢子囊群体。 所述 扇蕨幼孢子囊为黄绿色， 且孢子囊壁完整， 孢子囊外壁覆盖有棕褐色鳞片的扇蕨孢子囊(成 熟扇蕨孢子是从成熟扇蕨孢子囊散出的孢子。 成熟扇蕨孢子囊是黄色， 孢子囊壁开始破裂， 孢子囊外壁无棕褐色鳞片)。 0034 (2)扇蕨绿色球状体的诱导 0035 将步骤(1)中获得的扇蕨无菌幼孢子囊群切成大小为1mm2mm1mm2mm1mm 2mm的小块， 接种于绿色球状体诱导培养基上，

20、 20暗培养48小时， 然后转入光照培养， 培 养时间为40天， 得到扇蕨绿色球状体， 光照培养条件为： 20， 每天的光照时间为12小时， 光 照强度为2000lx。 所述绿色球状体诱导培养基为： 1/4MS+TDZ 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖 30.0g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80。 接种数为50个幼孢子囊群小块。 0036 经诱导培养后， 幼孢子囊表面膨胀形成绿色球状体， 绿色球状体的诱导率为 96.00。 0037 诱导率(产生绿色球状体的幼孢子囊群的块数/接种的幼孢子囊群的块数) 100 0038 (3)扇蕨绿色球状体的增殖 0039 将步骤(2)诱导获

21、得的扇蕨绿色球状体切割成大小为13mm13mm13mm的 块， 接种于绿色球状体增殖培养基上， 培养时间为30天， 得到增殖的扇蕨绿色球状体， 培养 说 明 书 3/6 页 5 CN 106718878 B 5 条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同。 所述绿色球状体增殖培养基为： 1/2MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80。 该2mm的扇蕨绿色球状体鲜重为 7mg， 接种数为50个。 0040 扇蕨绿色球状体增殖培养30天后， 鲜重增加为52.30mg， 增殖倍数为7.47倍。 增殖 培养的次数可根据生产上需要的组培苗数

22、量确定。 0041 (4)扇蕨绿色球状体的分化 0042 将步骤(3)增殖得到的扇蕨绿色球状体切割成大小为13mm13mm13mm的 块， 接种于绿色球状体分化培养基上， 培养时间为30天， 得到分化幼苗， 培养条件与步骤(2) 中所述的光照培养条件相同。 所述绿色球状体分化培养基为： 1/4MS+KT 0.1mg/L+水解酪蛋 白 100mg/L+活性炭1g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80。 该2mm的绿色球状体鲜重约为 7mg， 接种数为50个。 0043 扇蕨绿色球状体分化培养30天后， 分化率为100.00。 0044 分化率(发生分化的扇蕨绿色球状体数量/接种

23、的扇蕨绿色球状体的数量) 100。 0045 (5)扇蕨组培苗的培养和生根 0046 将步骤(4)得到的分化幼苗接种于组培苗培养和生根培养基上， 培养时间为60天， 每30天更换一次组培苗培养和生根培养基， 得到植株高度为1.5cm以上的生根组培苗， 培养 条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同。 所述组培苗培养和生根培养基为： 1/2MS+NAA 0.2mg/L+活性炭1g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L， pH为5.80。 接种的分化幼苗数为50株。 0047 经过60天的培养， 扇蕨组培苗的平均株高为1.8cm， 生根率100， 57根/株， 所培 养的苗根多、 苗壮。 0048

24、 实施例2和实施例3均为本发明方法 0049 实施例2和实施例3除表1所列措施不同外， 其余措施均与实施例1相同， 不再赘述。 0050 表1实施例2-实施例3各步骤与实施例1的区别 说 明 书 4/6 页 6 CN 106718878 B 6 0051 0052 0053 实施例1-3的繁殖效果见表2。 0054 表2实施例1-实施例3的繁殖效果 说 明 书 5/6 页 7 CN 106718878 B 7 0055 0056 以上各实施例中一个2mm的扇蕨绿色球状体一次分化可以得到1520株扇蕨组培 苗， 其扇蕨组培苗繁殖率特别高。 0057 上述实施例1至实施例3表明： 本发明直接以扇蕨

25、无菌幼孢子囊群为外植体， 诱导 出扇蕨绿色绿色球状体仅需42天50天， 省略了现有技术以扇蕨无菌孢子体为外植体， 需 先从成熟孢子萌发形成原叶体原叶体增殖原叶体诱导获得无菌孢子体幼苗为外植体 的步骤， 并节省了现有技术从成熟孢子萌发形成原叶体原叶体增殖原叶体诱导获得无 菌孢子体幼苗为外植体至少需要56个月的时间， 克服了现有技术扇蕨组培繁殖周期长的 缺陷， 本发明整个扇蕨组培繁殖时间仅需162天170天， 大幅度地缩短了扇蕨组培苗的繁 殖时间。 同时， 大幅度地提高了扇蕨组培繁殖效率， 本发明方法诱导出扇蕨绿色球状体的诱 导率达96100， 增殖倍数高达到6.217.49倍， 绿色球状体的分化率100， 生根率 100， 而现有技术扇蕨组培繁殖效率低， 获得无菌孢子体幼苗外植体的诱导率仅为30左 右， 与现有技术相比， 本发明方法产生了预料不到的技术效果。 说 明 书 6/6 页 8 CN 106718878 B 8 图1 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 106718878 B 9 图2 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 106718878 B 10 图3 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 106718878 B 11