用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201680078606.4 (22)申请日 2016.11.18 (30)优先权数据 62/257,143 2015.11.18 US 62/265,508 2015.12.10 US 62/265,511 2015.12.10 US 62/265,513 2015.12.10 US (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2018.07.11 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2016/062739 2016.11.18 (87)PCT国际申请的公布数据 WO201

2、7/087784 EN 2017.05.26 (71)申请人 杜克大学 地址 美国北卡罗来纳州 (72)发明人 何有文 王宇 (74)专利代理机构 中原信达知识产权代理有限 责任公司 11219 代理人 金海霞 杨青 (51)Int.Cl. A01N 63/00(2006.01) A61K 38/20(2006.01) A61K 38/21(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C07H 21/02(2006.01) (54)发明名称 用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞 (57)摘要 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是被积极招募到肿 瘤部位以产

3、生针对肿瘤生长和转移的免疫应答 的白血细胞。 本公开提供了用于治疗癌症的方 法， 所述方法包括以下步骤： 从来自受试者的样 品中分离CD8+T细胞、 在白细胞介素-10存在的条 件下扩增CD8+T细胞以及将扩增的CD8+T细胞施 用于受试者。 所述治疗癌症的方法可与补体信号 传导通路的抑制剂组合使用。 权利要求书1页 说明书27页 附图30页 CN 109068658 A 2018.12.21 CN 109068658 A 1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法， 其特征在于， 所述方法包括： 从来自受试者 的样品中分离CD8+T细胞、 将所述CD8+T细胞暴露于白细胞介素-10、 将所述CD

4、8+T细胞暴露 于白细胞介素-2、 扩增所述CD8+T细胞以及向所述受试者施用所述扩增的CD8+T细胞。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在暴露于白细胞介素-10之前， 将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞介素-2。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 将所述CD8+T细胞同时暴露于白细胞介素- 2和白细胞介素-10。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 将所述CD8+T细胞暴露于白细胞介素-2和 白细胞介素-10约1小时至约24小时。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在向所述受试者施用之前， 将所述CD8+T细 胞扩增到至少106个所述CD8+T

5、细胞。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述方法还包括向所述受试者施用有效治 疗量的补体抑制剂。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述方法还包括在向所述受试者施用所述 CD8+T细胞之前， 将所述分离的CD8+T细胞暴露于补体抑制剂。 8.根据权利要求6或7中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述补体抑制剂包括C5a抑制 剂、 C5aR抑制剂、 C3抑制剂、 C3aR抑制剂、 D因子抑制剂、 B因子抑制剂、 C4抑制剂、 C1q抑制剂 中的一种或多种或其任何组合。 9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法还包括给所述受试者 施用顺铂、 奥沙

6、利铂、 激酶抑制剂、 曲妥珠单抗、 西妥昔单抗、 帕尼单抗、 兰洛单抗和纳武单 抗中的至少一种。 10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述癌症选自： 头部癌症、 颈 癌、 B细胞非霍奇金淋巴瘤、 慢性淋巴细胞性白血病、 多发性骨髓瘤、 结肠直肠癌、 非小细胞 肺癌、 实体瘤(包括晚期实体瘤)、 乳腺癌、 黑色素瘤、 前列腺癌、 肾细胞癌、 弥漫性大细胞淋 巴瘤、 晚期CD70+癌症、 CD20+非霍奇金淋巴瘤和血液恶性肿瘤。 11.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述样品是血液样品。 12.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述样品是组织样品。 13.

7、根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述样品是肿瘤样品。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109068658 A 2 用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞 0001 相关申请的交叉引用 0002 本申请要求2015年11月18日提交的美国临时申请No.62/257,143、 2015年12月10 日提交的美国临时申请No.62/265,508、 62/265,511和62/265,513的优先权， 其内容通过引 用整体并入本文。 0003 政府权益声明 0004 本发明是在美国卫生研究院授予的基金号R01AI074944-01的资助下完成的。 美国 政府对本发明享有一定的权利。 技术

8、领域 0005 本公开涉及肿瘤浸润淋巴细胞和用于治疗癌症的组合物和方法。 背景技术 0006 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是积极招募到肿瘤部位的白血细胞， 以产生针对肿瘤生 长和转移的免疫应答。 多种信号通路控制TIL的活化， 并且许多已经被作为癌症治疗的靶标 进行研究。 然而， 目前专注于激活TIL的治疗方法仅对少部分患者有效， 突出了对改进的癌 症治疗方法的需求。 发明内容 0007 在一个方面中， 本公开提供一种治疗有需要的受试者的癌症的方法， 其特征在于， 所述方法包括： 从来自受试者的样品中分离CD8+ T细胞、 将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞 介素-10、 将所述CD8+ T细胞

9、暴露于白细胞介素-2、 扩增所述CD8+ T细胞以及向所述受试者 施用所述扩增的CD8+ T细胞。 在一些实施例中， 可在暴露于白细胞介素-10之前， 将所述CD8 + T细胞暴露于白细胞介素-2。 在其他实施例中， 可将所述CD8+ T细胞同时暴露于白细胞介 素-2和白细胞介素-10。 在一些实施例中， 所述公开的方法还可包括向所述受试者施用有效 治疗量的补体抑制剂。 0008 附图简要说明 0009 图1显示了通过补体来调节在CD8+ T细胞中IL-10的表达。 图1A显示了IL-10+(IL- 10阳性)和IL-10-(IL-10阴性)的CD8+ T细胞中差异表达的基因的热图。 图1B显

10、示了图1A所 示差异表达的基因的通路分析。 图1C和图1D显示了IL-10+的CD8+(GFP+)和IL-10-的CD8+ (GFP-)T细胞中补体(图1C)和补体受体(图1D)的mRNA表达。 图表显示了基于基因芯片数据 的每种所示基因的mRNA相对表达水平。 所示的是由Trandem及其同事存储的数据的平均值 SEM(Journal of Immunology， 186： 3642-52)。 图1E显示了在来自野生型(WT)和C3-/-小 鼠的CD8+ TIL中IL-10的表达。 将IL-10报告子(Tiger)小鼠与C3-/-小鼠杂交并接种B16黑 素瘤细胞。 自第12天至第13天通过流

11、式细胞术分析TIL。 右图显示了6只C3-/-Tiger小鼠的 IL-10+CD8+ TIL的百分比。 误差线表示SEM。 所有图均通过Student t检验确定显著性(*， P 0.05； *， P0.01； *， P0.001)。 说 明 书 1/27 页 3 CN 109068658 A 3 0010 图2显示了通过补体抑制由T细胞介导的抗肿瘤免疫。 图2A-C显示了在C3-/-小鼠 中黑素瘤的发展。 将B16F10黑素瘤细胞(2105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠 中。 从第7天开始每天监测肿瘤生长。 图示为这些小鼠中的肿瘤体积、 大小和重量(每组n9 只小鼠)。 图

12、2D-F显示了C3-/-小鼠中乳腺癌的发展。 将E0771乳腺癌细胞(1106/小鼠)皮 下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。 从第7天开始每隔一天监测肿瘤生长。 图示为这些小 鼠中的肿瘤体积、 大小和重量(每组n9只小鼠)。 图2G-H显示了来自C3-/-小鼠的CD8+ TIL 表型。 给WT和C3-/-小鼠皮下接种B16F10细胞(2105/小鼠)。 在肿瘤接种后第12天， 通过流 式细胞术(每组n5只小鼠)分析表达IFN和TNF 的总的CD8+ TIL。 图2I显示了WT、 C3-/-、 TCR -/-和C3-/-TCR -/-小鼠(每组n6只小鼠)中B16F10肿瘤的发展。 所示

13、的所有实验代 表至少三次独立实验。 线条和误差线表示平均值SEM。 所有图均通过Student t检验确定 显著性(ns， P0.05； *， P0.05； *， P0.01； *， P0.001)。 0011 图3显示了荷瘤小鼠中的非CD8+ T细胞应答。 将B16F10黑素瘤细胞(2105/小鼠) 皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。 使用胶原酶和DNA酶处理引流淋巴结(dLNs)和肿瘤 以产生单细胞悬液。 以CD45+细胞的门控预选白细胞。 图3A显示了对来自肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)的白细胞中的CD11b和GR1表达情况的流式细胞术分析(每组n4只小鼠)。 图3B显示 了使用

14、CD4和FOXP3作为标记物(每组n4只小鼠)对来自TIL的白细胞中调节性CD4+ T细胞 群进行的流式细胞术分析。 图3C显示了使用NK1.1作为标记物(每组n4只小鼠)来对来自 TIL的白细胞中的天然杀伤细胞(NK)群体进行的流式细胞术分析。 所示的实验是三个独立 实验的代表。 线条和误差线表示平均值SEM。 所有图均通过Student t检验确定显著性 (ns， P0.05)。 0012 图4显示了IL-10在C3-/-小鼠的抗肿瘤反应中的重要作用。 图4A-C显示了在C3-/- 小鼠中黑素瘤的发展。 将B16F10黑素瘤细胞(2105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)、 IL- 10-/

15、-、 C3-/-和IL-10-/-C3-/-小鼠中。 从第7天开始每天监测肿瘤生长。 图示为这些小鼠中 的肿瘤体积、 大小和重量(每组n8只小鼠)。 图4D-F显示了C3-/-小鼠中乳腺癌的发展。 将 E0771乳腺癌细胞(1106/小鼠)皮下接种到野生型(WT)、 C3-/-和IL-10-/-C3-/-小鼠中。 从第7天开始每隔一天监测肿瘤生长。 图示为这些小鼠中的肿瘤体积、 大小和重量(每组n 8只小鼠)。 所示的实验是三个独立实验的代表。 线条和误差线表示平均值SEM。 在A和D中 通过Student t检验以及在C和F中通过ANOVA来确定显著性(ns， P0.05*； P0.05；

16、*， P 0.01)。 0013 图5显示了IL-10增强了来自癌症患者的TIL的功能。 图5A显示了体外扩增的来自 肺癌患者的TIL的细胞数量。 分离并在存在6,000U/mL rIL-2,100U/mL rIL-10或6,000U/mL rIL-2和100U/mLrIL-10的条件下培养TIL。 显示了计数得到的活TIL的数量(y轴)。 插入的图 显示来自3名患者的两种培养物的TIL比例。 图5B显示了体外扩增的TIL的杀伤活性。 图5A中 的经扩增的TIL经抗CD3/CD28抗体激活24小时， 并以20： 1的效应物： 靶的比率测试其杀死自 体原代肿瘤细胞的能力。 通过阻抗测定以15分钟

17、的间隔测量杀伤活性。 图5C-D显示了体外 扩增的CD8+ TILs中IFN和TNF 的表达。 在完全培养基中单独使用6,000U/mL rIL-2或将 其与100U/mL rIL-10组合使用， 以将来自肺癌的TIL扩增20天。 通过流式细胞术分析CD8+ TIL中的IFN和TNF 表达。 图5A-D中显示的结果是3至6名患者的代表数据。 图5E显示了经 IL-10处理的人肺肿瘤CD8+ TIL中差异表达的基因的热图。 图5F-J显示了在IL-10/IL-2处 说 明 书 2/27 页 4 CN 109068658 A 4 理的人CD8+ TIL中所指示的不同通路的mRNA表达。 图示为基于

18、基因芯片数据的是每种指定 基因与来自IL-2处理的细胞相比较的mRNA相对表达水平。 图示为平均值SEM。 在图5F-J中 通过ANOVA来确定显著性(*， P0.05； *， P0.01)。 0014 图6显示了通过自分泌C3抑制IL-10的生成。 图6A显示了T细胞转移至C3-/-TCR-/- 小鼠和肿瘤发展的示意图。 图6B显示了嵌合小鼠中黑素瘤的发展。 将B16F10黑素瘤细胞接 种到T细胞重建的C3-/-TCR-/-小鼠中， 并每天监测肿瘤发展(每组n5只小鼠)。 图6C显示 了来自初始小鼠的dLN的CD8+ T细胞上的C3aR和C5aR表达的荧光激活细胞分选(FACS)图 谱。 图

19、6D显示了来自dLN和黑素瘤的CD8+ T细胞上C3aR和C5aR表达的FACS图谱。 将B16F10黑 素瘤细胞(2105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)小鼠中， 并在第13天分离TIL并通过流式细 胞术分析。 图6E显示了来自乳腺癌的CD8+ T细胞上的C3aR和C5aR表达的FACS谱。 将E0771细 胞(1106/小鼠)皮下接种到WT小鼠中。 通过流式细胞术在第19天分析CD8+ TIL上的C3aR 和C5aR的表达。 图6F显示了来自图6D-E的结果。 图6G显示了来自外周血单核细胞(PBMC)和 来自肝癌的TIL(n5)的CD8+ T细胞上的C3aR和C5aR表达的FACS图谱。

20、 图6H显示了肿瘤细 胞中羧肽酶N(CPN)表达对CD8+ TIL中IL-10的生成的影响。 将对照和表达CPN的B16F10细胞 (4105/小鼠)皮下接种到WT Tiger小鼠中。 在第13天测定CD8+ TIL中的IL-10-报告分子 eGFP的表达。 右图显示了5只小鼠的IL-10+CD8+ TILs的百分比。 图6I显示了C3aR和C5aR拮 抗剂对CD8+ TIL中IL-10表达的影响。 用对照或经C3aR和C5aR拮抗剂(每组n3)处理的携 带B16肿瘤的WT Tiger小鼠。 图6J显示了C3aR和C5aR拮抗剂对体外激活的CD8+ T细胞(n 4)中IL-10表达的影响。 图

21、6K显示了补体信号传导阻断对乳腺癌发展的影响。 将E0771乳腺 癌细胞(1106/小鼠)皮下接种到野生型(WT)、 C3-/-和IL-10-/-小鼠中。 对WT和IL-10-/- 小鼠， 自肿瘤植入后第9天开始每12小时用C3aR和C5aR拮抗剂或对照溶液进行处理。 每隔一 天监测肿瘤体积(每组n8只小鼠)。 对于图6B和图6K来说， 结果是三个独立实验的代表。 线 条和误差线表示平均值SEM。 在图B中用Student t检验及图6J和图6K中的方差分析 (ANOVA)来确定显著性(ns， P0.05； *， P0.05； *， P0.01； *， P0.001)。 0015 图7显示了补

22、体通过不依赖PD-1的通路抑制抗肿瘤免疫性。 将B16F10黑素瘤细胞 (2105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。 图7A显示了肿瘤植入后第12天通过 流式细胞术测得的CD8+TIL上的PD-1的表达水平。 图7B显示了在IL-10存在的条件下由抗 CD3/CD28抗体激活的CD8+ T细胞上的PD-1的表达水平。 通过与3 g/mL抗CD3/CD28抗体一起 温育48小时(有或没有500U/mL IL-10)来激活幼年小鼠淋巴结的T细胞， 并分析PD-1表达。 图7C-D显示了WT和C3-/-小鼠中发展的肿瘤细胞上的PD-L1表达。 将B16F10黑素瘤细胞(2 105/

23、小鼠)或E0771乳腺癌细胞(1106/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。 分别 在第12天和第19天通过流式细胞术测量CD45-B16肿瘤细胞(图7C)和CD45-E0771细胞(图 7D)中的PD-L1表达。 图7E显示了IL-10刺激后肿瘤细胞中的PD-L1表达。 用或不用500U/mL IL-10来培养B16F10细胞5天。 通过流式细胞术来分析PD-L1表达。 图7F显示了转导的B16F10 细胞上的PD-L1表达。 用对照病毒或单引导RNA(sgRNA)靶向PD-L1病毒来转导B16F10细胞， 并用嘌呤霉素进行选择以产生稳定的PD-L1沉默的多克隆细胞系。 图7G

24、显示了来自PD-L1沉 默的B16F10肿瘤的CD8+ TIL中的IL-10表达。 将对照或PD-L1沉默的B16F10黑素瘤细胞(4 105/小鼠)皮下接种到C3-/-和C3-/-Tiger小鼠中。 通过流式细胞术分析CD3+CD8+TIL中的 GFP表达。 右图显示了4只单独小鼠的IL-10+CD8+ TILs的百分比。 图7H显示了阻断PD-1/PD- 说 明 书 3/27 页 5 CN 109068658 A 5 L1和补体信号传导通路对肿瘤发展的影响。 将对照或PD-L1沉默的B16F10黑素瘤细胞(4 105/小鼠)皮下接种到WT和C3-/-小鼠中。 植入后第7天开始每天监测肿瘤发

25、展(分别为n 7、 7、 9和8只小鼠)。 对于图7I来说， 将B16F10黑素瘤细胞(5104/小鼠)皮下接种到WT小鼠 中。 植入后6天将小鼠随机分为4组。 每组小鼠接受对照抗体、 抗PD-1抗体、 C3aR和C5aR拮抗 剂， 或抗PD-1抗体加C3aR和C5aR拮抗剂(每组n8只小鼠)。 对于图7A-F来说， 纯灰色表示同 种型对照染色。 对于图7A-E来说， 数据代表每组6至8只小鼠的池。 通过Student t检验来测 定图7H和图7I中的显著性。 *， P0.05； *， P0.01。 0016 图8显示了通过补体来调节IL-10在CD8+ TIL中的生成。 图8A显示了GFP+

26、(IL-10) 和GFP-CD8+ T细胞中的IL10mRNA的相对水平。 图8B显示了与补体通路相关的基因的mRNA相 对水平。 图8A和图8B中的数据通过分析Trandem及其同事(Journal of Immunology， 186： 3642-52)的微阵列数据集(GSE25846)产生。 对于图8C来说， 将B16F10黑素瘤细胞(210 5 个/小鼠)皮下接种到WT IL-10报告分子(Tiger)小鼠和C3-/-Tiger小鼠中。 解剖来自荷瘤 小鼠的引流淋巴结(dLNs)， 并通过流式细胞术分析淋巴细胞中的GFP表达。 数据代表每组5- 6只小鼠的池。 线条和误差线表示平均值S

27、EM。 *p0.05， *p0.01， *p0.001。 成对t 检验。 0017 图9显示了荷瘤小鼠中的非CD8+ T细胞应答。 将B16F10黑素瘤细胞(2105/小鼠) 皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。 解剖引流淋巴结和肿瘤并用胶原酶和DNA酶处理以 获得单细胞悬液。 以CD45阳性细胞的门控预选白细胞。 图9A显示了通过流式细胞术分析来 自dLNs的白细胞中的CD11b和GR1表达。 图9B显示了通过使用CD4和Foxp3作为标记的流式细 胞术分析来自dLN的白细胞中的调节性CD4+T细胞群。 图9C显示了来自C3-/-小鼠的CD4+TIL 的表型。 向WT和C3-/-小鼠

28、皮下接种B16F10细胞(2105/小鼠)。 在肿瘤接种后第12天， 通过 流式细胞术(每组n4只小鼠)分析产生IFN和TNF 的CD4+TIL。 图9D显示了IL-10对人CD4 +T细胞中效应细胞因子的生成的影响。 从健康供体的PBMC中富集CD4+T细胞， 并通过体外抗 CD3/CD28抗体进行活化48小时。 然后将活化的CD4+T细胞与100U/mlrIL-2或100U/ml rIL-2 加500U/ml rIL-10一起培养48小时。 在细胞内进行IFN和TNF 染色之前， 使用细胞活化混 合物(Biolegend)将细胞激活6小时。 通过流式细胞术来分析IFN和TNF 的表达(n3

29、)。 图 9E显示了IL-10对鼠CD4+T细胞中效应细胞因子的生成的影响。 使用阴性选择试剂盒从幼年 小鼠的脾中富集小鼠CD4+T细胞， 并通过抗CD3/CD28抗体在体外进行活化48小时。 然后将活 化的CD4+T细胞与100U/ml rIL-2或100U/ml rIL-2加500U/ml rIL-10一起培养48小时。 在 细胞内进行IFN和TNF 染色之前， 使用细胞活化混合物(Biolegend)将细胞激活6小时。 通 过流式细胞术来分析IFN和TNF 的表达(n3)。 所示的数据是三个独立实验的代表。 线条 和误差线表示平均值SEM。 ns， p0.05， *p0.05， *p0.

30、01。 Student st检验。 0018 图10显示了IL-10培养后在CD8+ TIL上表达的T细胞耗竭标记物。 分离来自肺癌患 者的人TIL并在体外与IL-2或IL-2加IL-10共培养21天。 通过抗CD3/CD28抗体来活化T细胞 24小时。 通过流式细胞术分析PD-1、 LAG-3和TIM-3的表面表达。 FACS图谱是三名患者的代 表。 0019 图11显示了过敏毒素通过C3aR和C5aR来调节IL-10的生成。 图11A显示了对从幼年 小鼠处收获并用C3aR和同种型对照抗体进行染色的腹膜巨噬细胞进行的流式细胞术分析。 图11B显示了对从幼年小鼠的脾收集并用C5aR抗体进行染色

31、的脾细胞进行的流式细胞术分 说 明 书 4/27 页 6 CN 109068658 A 6 析。 图11C显示了新鲜分离的来自野生型(WT)、 C3-/-小鼠的B16肿瘤和来自WT小鼠的CPN过 表达的B16肿瘤以及来自WT小鼠的离体培养的B16肿瘤中的C3a和C5a的水平。 通过ELISA来 量化C3a和C5a。 使用培养基作为背景(每组n4只小鼠)。 对于图11D来说， 用对照或携带 CPN1的病毒来转导B16黑素瘤细胞， 用G418来选择过表达CPN1的稳定细胞系。 通过RT-PCR证 实CPN1的过表达。 用 -肌动蛋白作为内部对照。 图11E显示了用对照GFP或CPN2-GFP病毒转

32、 导的CPN1-过度表达的B16黑素瘤细胞的流式细胞术分析。 对于图11F-G来说， 通过使用板结 合的抗CD3/CD28抗体对CD8+ T细胞进行活化3天。 在第3天通过流式细胞术确定补体受体 C3aR和C5aR的表达(图11F)。 然后将活化的CD8+ T细胞在没有抗CD3/CD28抗体的新鲜培养 基中再培养3天。 通过流式细胞术来测定C3aR和C5aR的表达(图11G)。 结果代表三只小鼠的 平均值。 图11H显示了补体信号传导阻断对乳腺癌发展的影响。 将E0771乳腺癌细胞(1 106/小鼠)皮下接种到野生型(WT)小鼠中。 将小鼠随机分为两组， 并在肿瘤接种后的第7天 开始每12小时

33、用C3aR拮抗剂或对照溶液进行处理。 每隔一天监测肿瘤体积(每组n6只小 鼠)。 ns， p0.05。 0020 图12显示了Bach2对IL-10的转录抑制作用。 图12A显示了IL-10启动子中的预测 Bach2结合位点。 图12B显示了对WT和C3-/-小鼠中发展的B16黑素瘤的C3aR+C5aR+CD8+ TILS进行bach2定位的共聚焦成像。 数据代表每组8-10只小鼠的池。 右图显示了总数为156 个细胞的WT细胞和总数为192个细胞的C3-/-小鼠中的核点数百分比。 图12C显示了Bach2表 达对CD8+ T细胞中IL-19生成的影响。 通过CD3/CD28抗体对T细胞进行活

34、化24小时， 接着用 对照或含有逆转录病毒转导的Bach2， 然后与100u/ml IL-2共培养5-6天。 通过流式细胞术 来监测GFP表达。 图12D显示了对照和如图12C所述的Bach2表达CD8+ T细胞中对IL-10进行 的细胞内染色。 在流式细胞术分析之前， 用PMA和伊屋诺霉素来刺激感染的T细胞4-6小时。 图12E显示了Bach2表达的CD8+ T细胞中的IL10mRNA水平。 通过流式细胞术来分选图12D所 示的Bach2表达的CD8+ T细胞和对照CD8+ T细胞， 并通过实时RT-PCR来确定IL-10的mRNA表 达。 基于18s rRNA进行数据标准化。 图12C-E

35、显示了三次重复的代表。 误差条表示SEM。 *p .01。 0021 图13显示了Bach2过表达的CD8+ T细胞中的mRNA表达。 通过CD3/CD28抗体对T细胞 进行活化24小时， 接着用对照或含有Bach2的逆转录病毒转导， 然后用100U/ml IL-2共培养 5-6天。 通过流式细胞术来分选BFP阳性CD8+ T细胞， 并提取RNA用于实时PCR测定。 具体实施方式 0022 本公开涉及用于治疗癌症的组合物和方法。 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是被招募到 肿瘤部位并涉及肿瘤细胞杀伤的单核免疫细胞。 TIL包括不同类型细胞(包括T细胞、 B细胞、 自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞)的混

36、合物， T细胞是其中丰度最高的细胞类型。 0023 白细胞介素10(IL-10)被广泛认为是免疫抑制性细胞因子， 因为它抑制包括CD4+T 细胞、 树突细胞和巨噬细胞在内的许多不同细胞类型的活化。 与其对许多类型的细胞的抑 制作用相反， IL-10活化CD8+TIL并增强其抗肿瘤活性。 然而， CD8+ TIL在正常情况下不表达 IL-10。 因此， 需要能够活化IL-10从而提高CD8+ TIL抗肿瘤活性的癌症治疗方法。 0024 本公开还提供了用于治疗癌症的方法， 所述方法包括以下步骤： 从来自受试者的 样品中分离CD8+ T细胞、 在白细胞介素-10存在的条件下扩增CD8+ T细胞以及将

37、扩增的CD8 说 明 书 5/27 页 7 CN 109068658 A 7 + T细胞施用于受试者。 0025 补体的信号传导表现出对抗肿瘤免疫的多因子抑制。 补体抑制CD8+ TIL中IL-10 的产生， 降低它们的抗肿瘤活性。 补体还招募免疫抑制性骨髓衍生的抑制性细胞(MDSC)， 并 防止各种肿瘤模型中自然杀伤(NK)细胞的激活。 在另一个方面中， 本公开说明了通过抑制 补体信号传导来活化CD8+ TIL的方法。 一些实施方案可包括治疗癌症的方法， 所述方法包 括施用在白细胞介素-10存在的条件下体外扩增的CD8+ T细胞并抑制补体信号传导。 0026 1.定义 0027 除非另外定义

38、， 本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人 员通常所理解的相同的含义。 在有冲突的情况下， 以本文件(包括本文的任何定义)为准。 以 下说明了优选的方法和材料， 但是与在此描述的那些相似或等同的方法和材料也可用于实 践或测试所公开的实施例。 本文提及的所有出版物、 专利申请、 专利和其他参考文献通过引 用以其全文并入本文。 本公开的材料、 方法和实例仅是说明性的并不旨在是限制性的。 0028 这里使用的术语 “包括(comprise)” ，“包含(include)” ，“具有(having)” ，“具有 (has)” ，“可以(can)” ，“包含(contain)” 等及其

39、变体旨在是开放式的过渡短语、 术语或不排 除其他行为或结构的可能性的词语。 除非上下文另外明确指出， 单数形式 “一” 、“一个” 和 “所述” 也包括复数形式。 无论是否明确阐述， 本公开还设想了其他 “包括” 、“包含” 和 “基本 上包含” 这些所展示的实施例或元素的实施例。 0029 用于与数量连用的修饰语 “大约” 包含设定值并具有上下文所叙述的意思(例如， 它至少包括与特定量的测量相关的误差程度)。 修饰语 “约” 也应该被认为是公开了由两个 端点的绝对值定义的范围。 例如， 表述 “从约2到约4” 也公开了 “从2到4” 的范围。 术语 “约” 可 以指所指数字的正负10。 例如

40、，“约10” 可指示9至11的范围，“约1” 可指0.9-1.1。 “约” 的其他含义可以根据上下文明显看出， 例如四舍五入， 因此， 例如 “约1” 也可以表示从 0.5到1.4。 0030 对于本文所述的数字范围， 具有相同精确度的每个中间数字也明确考虑在内。 例 如， 对于6-9的范围， 除了6和9以外， 还考虑数字7和8； 对于6.0-7.0的范围， 数字6.0、 6.1、 6.2、 6.3、 6.4、 6.5、 6.6、 6.7、 6.8、 6.9和7.0被明确考虑。 0031 本文中所使用的术语 “施用” (administration/administrating)是指通过任何适

41、 当的途径提供、 接触和/或递送以实现期望的效果。 所公开的组合物可以本领域普通技术人 员熟悉的许多方式施用于受试者， 包括例如局部施用或全身施用， 其可通过例如口服施用、 皮下注射、 静脉内注射、 局部施用或植入。 0032 “亲和力成熟的抗体” 在本文中用于指代在一个或多个CDR中具有一个或多个改变 的抗体， 其导致抗体对靶抗原的亲和力(即KD， kd或ka)与不具有改变的亲本抗体相比发生改 善。 示例性亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。 本领域已知用 于生产亲和力成熟抗体的多种方法， 包括对使用生物展示制备的组合抗体文库进行筛选。 例如， Marks等人， BioT

42、echnology， 10： 779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域重配对进行 亲和力成熟。 Barbas等人， Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)； Schier等人， Gene,169： 147-155(1995)； Yelton等人,J.Immunol.,155:1994-2004(1995)； Jackson等人, J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)； 以及Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896 (1992)描述了CDR和/或框架残基的随机诱变。 美国专利No.6,9

43、14,128B1描述了在选择的诱 说 明 书 6/27 页 8 CN 109068658 A 8 变位置和在接触区或超突变位置处， 用活性增强氨基酸残基进行选择性突变。 0033 本文所用的 “抗体” 是指单克隆抗体， 多特异性抗体、 人抗体、 人源化抗体(完全或 部分人源化)， 源自动物例如但不限于鸟(例如， 鸭子或鹅)、 鲨鱼、 鲸鱼和哺乳动物， 包括非 灵长类动物(例如， 牛、 猪、 骆驼、 美洲驼、 马、 山羊、 兔、 绵羊、 仓鼠、 豚鼠、 猫、 狗、 大鼠、 小鼠 等)或非人灵长类动物(例如猴， 黑猩猩等)的抗体。“抗体” 还包括重组抗体、 单克隆抗体、 亲 和力成熟抗体、 双特异

44、性抗体(bispecific antibody)、 双重特异性抗体(dual specific antibody)、 抗体衍生物、 嵌合抗体、 单链Fv( “scFv” )、 单链抗体、 单结构域抗体， 如衍生自骆 驼科家族动物的的可变重链结构域( “VHH” ； 也称为 “VHH片段” )(VHH及其制备方法在 Gottlin等人， Journal of Biomolecular Screening， 14： 77-85(2009)中描述)以及VNAR片 段、 Fab片段、 F(ab )片段、 F(ab )2片段、 二硫键连接的Fvs( “sdFv” )和抗独特型( “抗-Id” ) 抗体、

45、 双重结构域抗体、 双重可变结构域(DVD)或三重可变结构域(TVD)抗体(双重可变结构 域免疫球蛋白及其制备方法在Wu， C.等人， Nature Biotechnology， 25(11)： 1290-1297 (2007)和PCT国际申请WO 2001/058956中描述， 其中每一个的内容通过引用并入本申请)和 上述任何的功能活性表位结合片段。 具体而言， 抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分 子的免疫学活性片段， 即含有分析物结合位点的分子。 免疫球蛋白分子可以是任何类型(例 如IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA和IgY)， 类别(例如， IgG1、 IgG2、 IgG3

46、、 IgG4、 IgA1和IgA2)或亚类。 术语 “抗体” 还包括任何抗体片段， 其在本发明中用于指代包含抗原结合位点或可变区的完 整抗体的一部分。 该部分不需要包括完整抗体的Fc区的重链恒定结构域(即CH2、 CH3或CH4， 取决于抗体同种型)。 抗体片段的示例包括但不限于Fab片段、 Fab 片段、 Fab -SH片段、 F (ab )2片段、 Fd片段、 Fv片段、 双抗体、 单链Fv(scFv)分子、 仅含有一个轻链可变区的单链多 肽、 含有轻链可变区的三个CDR的单链多肽、 仅含有一个重链可变区的单链多肽、 含有重链 可变区的三个CDR的单链多肽和VHH。 0034 本文中所使用

47、的术语 “抗癌分子” 是指有效治疗受试者中的癌症的任何分子。 在一 些实施例中， 抗癌分子包括抗体。 合适的抗癌分子包括但不限于抗PD-L1(例如BMS-936559， MPDL3280A等)、 抗CD40(例如， CP-870 ,893等)、 抗TIM3、 CTLA4(例如， 伊匹单抗、 tremelimumab等)、 抗PD-1(例如， MK-3475、 nivolumab等)、 抗4-1BB(抗CD137)(例如， BMS663513、 PF-05082566、 抗-CD94(例如， IPH2201等)、 抗-LAG3(例如， IMP321、 LAG525、 BMS- 986016等)、

48、 抗-CD134(例如MED16469等)、 抗-CD70(例如， ARGX-110等)、 抗CD27(例如， Varlilumab等)、 抗糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)(例如， TRX-518、 MK-4166等)、 CD278、 anto-GARP(例如， ARGX-115等)、 T细胞活化的免疫球蛋白抑制V型结构域(VISTA)及其组合。 在一些实施例中， 抗癌分子包括适体。 0035 本文中的 “适体” 是指能够与其靶标特异性非共价结合的寡核酸或肽分子。 适体可 包括肽、 DNA或RNA序列。 适体可靶向PD-L1、 CD40、 TIM3、 CTLA4、 PD-1、 4-1B

49、B(CD137)、 CD94、 LAG3、 CD134、 CD70、 CD27、 糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、 CD278、 GARP、 T细胞活化的免疫 球蛋白抑制V型结构域(VISTA)及其组合。 适体与其靶标的结合可能导致靶标活性的改变。 适体与其靶标的结合可能抑制靶标活性。 适体与其靶标的结合可能提高靶标活性。 0036 本文所用的 “结合蛋白” 是指与结合配偶体(例如多肽、 抗原、 化合物或其他分子或 任何种类的基质)结合并与其形成复合物的单体或多聚体蛋白质。 结合蛋白与结合配偶体 特异性结合。 结合蛋白包括抗体及其抗原结合片段和本领域已知的以及下文所述的其他各 说 明 书 7/27 页