提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102668973 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102668973 A *CN102668973A* (21)申请号 201210179528.0 (22)申请日 2012.06.04 A01H 1/02(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 广西壮族自治区农业科学院水稻研 究所 地址 530007 广西壮族自治区南宁市大学东 路 174 号 (72)发明人 郭嗣斌 高国庆 韦宇 李孝琼 刘开强 陈彩虹 (74)专利代理机构 北京君智知识产权代理事务 所 11305 代理人 向华 (54) 发明名称 提高栽培稻

2、与小粒野生稻回交一代杂种获得 率的新方法 (57) 摘要 本发明属于植物杂交育种技术领域， 涉及一 种提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率 的新方法。首先， 利用栽培稻作母本， 小粒野生稻 作父本进行杂交， 经胚拯救得到了种间杂种 F1植 株 ； 其次， 再用种间杂种 F1植株作母本， 相应的栽 培稻作父本进行回交， 采用类似于杂交稻制种的 方法， 进行直接授粉， 连续授粉 3 天， 获得大量的 远缘杂交回交一代杂种的幼胚， 最后经胚拯救得 到回交一代杂种 BC1F1植株。此方法操作简单， 成本低， 能使栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种 的获得率从现有水平的 0.02%-0.03% 稳定提高

3、到 0.32%-0.35%， 较好的解决了栽培稻与小粒野生稻 回交一代杂种 BC1F1难于获得的难题。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新方法， 包括以下步骤 ： （1） 用栽培稻做母本， 用小粒野生稻做父本进行杂交， 根据栽培稻和小粒野生稻的生 育期， 合理安排播差期， 保证它们的花期相遇， 对作为母本的所述栽培稻进行温汤去雄后 剪颖， 再以所述野生稻的花粉进行人工授粉， 获

4、得野栽交的种间杂种 F1； 待杂种幼胚发育 10-12 天后， 取出小穗中膨大的子房进行胚拯救， 获得野栽交的种间杂种 F1植株 ； （2） 对获得的野栽交的种间杂种 F1植株进行稀植， 株行距为 30cm50cm， 待 F1植株成 活后， 每隔 5-7 天施用尿素 5.0kg/ 亩促分蘖， 连续施用 3-4 次， 并进行 3 次分蔸扩繁种植， 尽可能获得较多 F1植株 ； （3） 合理安排播差期， 保证所述栽培稻和所述种间杂种F1植株的花期相遇 ； 并对栽培稻 进行 3-5 期的分期播种， 相邻两期间隔 7-10 天， 保证父本的花期在 30 天左右 ； 抽穗期， 每天从所述杂种 F1植株上

5、通过分蔸带根取出当天开始开花的穗子， 集中移植 于塑料桶中， 塑料桶中泥土深 10-15 厘米， 水深 5-7 厘米， 挂牌记载当天的日期， 并从第 2 天 开始取所述栽培稻的花粉进行人工直接授粉， 连续授粉 3 天 ； 根据塑料桶上挂牌记载的日期， 选取已授粉 10-12 天的塑料桶， 逐一取出其中的穗子， 并在日光或灯光下， 逆光查找子房膨大的小穗， 随后取出小穗中膨大的子房进行胚拯救， 获 得野栽交的回交一代杂种 BC1F1植株。 2. 根据权利要求 1 所述的提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新方法， 其 特征在于所述步骤 （1） 中对作为母本的栽培稻进行温汤去雄的方法是 ：

6、用 44 -46的温 水处理栽培稻的稻穗 4-5 分钟， 进行杀雄处理。 3. 根据权利要求 1 所述的提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新方法， 其 特征在于所述步骤 （1） 和 （3） 中胚拯救的方法包括以下步骤 ： 选取 10-12 天胚龄的膨大子房， 先用 70% 的酒精消毒 3 分钟， 再用 0.1% 的 HgCl2灭菌 10 分钟， 后用灭菌水清洗 3-5 次， 采用部分子房培养的方式接种于 1/4MS 固体培养基上 ； 在 261的条件下进行暗培养， 待发芽后移到光强为 15000Lux 的条件下进行光培 养， 培养温度为 261， 光照时间为 24 小时 / 天 ； 到

7、 3 叶期后将其暴露于空气中， 加水， 室 温和日光下培养 7 天左右， 然后移栽成苗。 4. 根据权利要求 3 所述的提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新方法， 其 特征在于所述部分子房培养的方式是 ： 在无菌的条件下， 将准备培养的子房， 从中部切断胚 乳， 选取含有胚的部分进行培养。 5. 根据权利要求 3 所述的提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新方 法， 其特征在于所述 1/4MS 固体培养基按照如下方法制备 ： 每 1L 1/4MS 固体培养基由 412.6mg NH4NO3、 475.0mg KNO3、 42.5mg KH2PO4、 92.5mg MgSO47H2

8、O、 110.0mgCaCl22H2O、 1.55mg H3BO3、 5.575mg MnSO44H2O、 2.15mgZnSO47H2O、 0.0625mgNa2MoO42H2O、 0.2075mg KI、 0.00625mg CuSO45H2O、 0.00625mg CoCl26H2O、 13.9mgFeSO47H2O、 14.92mg Na2EDTA2H2O、 0.25mg 烟酸、 0.5mg 维生素 B1、 0.25mg 维生素 VB6、 1.0mg 甘氨酸、 50mg 肌醇、 20.0g 蔗糖、 3.0g 植物凝胶和水组成， 用水补足体积， 调整溶液的 PH 值为 5.8。 6. 根

9、据权利要求 1 所述的提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新方法， 其 特征在于所述栽培稻是 IR24， 农垦 58 或金 23B。 权 利 要 求 书 CN 102668973 A 2 1/6 页 3 提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新方法 技术领域 0001 本发明属于植物杂交育种技术领域， 具体涉及一种能显著提高栽培稻与小粒野生 稻回交一代杂种获得率的新方法。 背景技术 0002 稻属 （Oryza） 现有 22 个野生种， 它们分别具有 10 种不同的基因组 (AA、 BB、 BBCC、 CC、 CCDD、 EE、 FF、 GG、 HHJJ 和 HHKK)， 含有丰富的

10、遗传多样性和许多优异的性状， 是进行栽 培稻遗传改良和基因组研究的宝贵资源。染色体组型为 BBCC 的小粒野生稻是四倍体， 具有 抗稻瘟病、 白叶枯病、 纹枯病、 褐飞虱、 白背飞虱和叶蝉的特性， 是一种优异种质资源， 在水 稻育种上具有重要的利用价值。 然而， 由于小粒野生稻与栽培稻的遗传差异很大， 存在一定 程度的生殖隔离， 野栽交 （即小粒野生稻与栽培稻杂交） 表现不亲和等导致它们的交配率极 低。由于小粒野生稻是四倍体， 它与栽培稻的杂种 F1是三倍体， 所以当对杂种 F1进行回交 时， 它产生了大量的没有功能的雌配子， 且易落粒， 很难成功授粉， 因此 BC1F1幼胚的获得率 极低 ；

11、 而且回交不亲和， 杂种胚过早死亡， 极难获得 BC1F1种子， 从而导致了栽培稻与小粒野 生稻回交一代杂种获得率极低， 这也成为挖掘和利用小粒野生稻有利基因的瓶颈。 0003 Amante-Bordeus 等人 （Amante-Bordeos A,Sitch L,Nelson R,Damacio R,Oliva N,Leung H.Transfer of bacterial blight and blast resistance from the tetraploid wild riceOryza minuta to cultivated rice,Oryza sativa.Theor Ap

12、pl Genet,1992,84:345-354） 在研究栽培稻与小粒野生稻杂交时 , 他们利用得到种间杂种 F1 直接与栽培稻回交， 其回交结实率仅为 0.02%。而 Mariam 等人 （Mariam A,Zakri A,Mahani M,Normah M.Interspecific hybridization of cultivated rice,Oryza sativa L.with the wild rice,Oryzaminuta Presl.Theor.Appl.Genet,1996,93:664-671） 按照相同的方 法进行回交， 其回交结实率仅为 0.03%。因此， 本领域

13、迫切需要解决小粒野生稻与栽培稻的 回交结实率过低的问题， 以实现小粒野生稻有利基因的转移与利用。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新方 法， 以便解决在进行小粒野生稻有利基因的转移与利用时， 它与栽培稻的回交一代杂种极 难获得的问题。 0005 本发明的技术构思是 ： 通过杂交和胚拯救得到栽培稻与小粒野生稻的杂种 F1植 株， 再用种间杂种 F1植株作母本， 用相应的栽培稻作父本进行回交， 采用类似于杂交稻制种 的方法， 进行直接授粉， 连续授粉 3 天， 获得大量的远缘杂交回交一代杂种的幼胚， 最后经 胚拯救得到了 BC1F1植株。 000

14、6 相较于现有技术， 本发明的方法主要在两个方面进行了改进 ： 一是改进了种间杂 种 F1的授粉方式， 二是改进了胚拯救中对回交一代杂种的接种方式。一方面， 栽培稻与小 粒野生稻的种间杂种 F1易落粒， 而现有技术中采用人工剪颖授粉又加剧了它的落粒性 , 所 说 明 书 CN 102668973 A 3 2/6 页 4 以当对杂种 F1进行回交时， 回交一代杂种 BC1F1幼胚的获得率极低。为了克服这一问题， 本 发明的的方法是采用直接授粉 ( 即对杂种 F1不剪颖 )， 连续授粉 3 天的授粉方式， 从而显著 减少了种间杂种 F1落粒性， 提高了授粉颖花数， 使回交一代杂种 BC1F1幼胚的

15、获得率明显提 高。 另一方面， 回交一代杂种BC1F110-12天胚龄的幼胚很小， 现有技术中采用在无菌的条件 下剥离幼胚的方式， 既易伤及幼胚又容易污染， 而且难度极大。 而本发明采用半切胚乳的方 法进行接种， 不需剥离幼胚， 只需在无菌的条件下将准备培养的子房， 从中部切断胚乳， 选 取含有胚的部分进行培养即可， 操作简单易行， 成功率高， 从而提高了杂种幼胚的发芽率。 这两方面改进的结合， 最终显著提高了栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种 BC1F1的获得率。 0007 按照以上思路， 本发明提出的提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种获得率的新 方法， 包括以下步骤 ： 0008 （1） 用栽

16、培稻做母本， 用小粒野生稻做父本进行杂交， 根据栽培稻和小粒野生稻 的生育期， 合理安排播差期， 保证它们的花期相遇， 对作为母本的所述栽培稻进行温汤去雄 后剪颖， 再以所述野生稻的花粉进行人工授粉， 获得野栽交的种间杂种 F1； 待杂种幼胚发育 10-12 天后， 取出小穗中膨大的子房进行胚拯救， 获得野栽交的种间杂种 F1植株。 0009 （2） 对获得的野栽交的种间杂种 F1植株进行稀植， 株行距为 30cm50cm， 待 F1植 株成活后， 每隔 5-7 天施用尿素 5.0kg/ 亩促分蘖， 连续施用 3-4 次， 并进行 3 次分蔸扩繁种 植， 尽可能获得较多 F1植株。 0010

17、（3） 合理安排播差期， 保证所述栽培稻和所述杂种F1植株的花期相遇 ； 并对栽培稻 进行 3-5 期的分期播种， 相邻两期间隔 7-10 天， 保证父本的花期在 30 天左右。 0011 抽穗期， 每天从所述杂种 F1植株上通过分蔸带根取出当天开始开花的穗子， 集中 移植于塑料桶中， 塑料桶中泥土深10-15厘米， 水深5-7厘米， 挂牌记载当天的日期， 并从第 2 天开始取所述栽培稻的花粉进行人工直接授粉， 连续授粉 3 天。 0012 根据塑料桶上挂牌记载的日期， 选取已授粉 10-12 天的塑料桶， 逐一取出其中的 穗子， 并在日光或灯光下， 逆光查找子房膨大的小穗， 随后取出小穗中膨

18、大的子房进行胚拯 救， 获得野栽交的回交一代杂种 BC1F1植株。 0013 所述步骤 （1） 中对作为母本的栽培稻进行温汤去雄的方法是 ： 用 44 -46的温 水处理栽培稻的稻穗 4-5 分钟， 进行杀雄处理。这样做还可以使栽培稻提前开花， 保证栽培 稻与小粒野生稻花时相遇， 提高杂交成功率。 0014 步骤 （1） 和 （3） 中的胚拯救的方法是 ： 0015 选取 10-12 天胚龄的膨大子房， 先用 70% 的酒精消毒 3 分钟， 再用 0.1% 的 Hgcl2 灭菌 10 分钟， 后用灭菌水清洗 3-5 次， 采用部分子房培养的方式接种于 1/4MS 固体培养基 上 ； 0016

19、在 261的条件下进行暗培养， 待发芽后移到光强为 15000Lux 的条件下进行光 培养， 培养温度为 261， 光照时间为 24 小时 / 天 ； 到 3 叶期后将其暴露于空气中， 加水， 室温和日光下培养 7 天左右， 然后移栽成苗。 0017 所述的部分子房培养的方式是 ： 在无菌的条件下， 将准备培养的子房， 从中部切断 胚乳， 选取含有胚的部分进行培养。 0018 所述的 1/4MS 固体培养基按照如下方法制备 ： 每 1L 1/4MS 固体培养基由 412.6mg NH4NO3、 475.0mg KNO3、 42.5mg KH2PO4、 92.5mg MgSO47H2O、 110

20、.0mgCaCl22H2O、 说 明 书 CN 102668973 A 4 3/6 页 5 1.55mg H3BO3、 5.575mg MnSO44H2O、 2.15mgZnSO47H2O、 0.0625mgNa2MoO42H2O、 0.2075mg KI、 0.00625mg CuSO45H2O、 0.00625mg CoCl26H2O、 13.9mgFeSO47H2O、 14.92mg Na2EDTA2H2O、 0.25mg 烟酸、 0.5mg 维生素 B1、 0.25mg 维生素 VB6、 1.0mg 甘氨酸、 50mg 肌醇、 20.0g 蔗糖、 3.0g 植物凝胶和水组成， 用水补足

21、体积， 调整溶液的 PH 值为 5.8。 0019 本发明所采用的栽培稻是 IR24， 农垦 58 或金 23B。 0020 采用本方案能体现如下优越性 ： 此方法操作简单， 技术难度小， 容易掌握 ； 二是 不需要昂贵的仪器和设备， 成本低 ； 三是广泛适用于挖掘和利用小粒野生稻有利基因进 行水稻种质资源的创新研究。只需要将水稻育种工作者平常用到的杂交技术和配套设备 进行合理调整， 就能简单易行地显著提高栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种 BC1F1的获得 率。本发明的方法能使栽培稻与小粒野生稻回交一代杂种 BC1F1的获得率从现有水平的 0.02%-0.03%提高到0.32%-0.35%， 将

22、小粒野生稻与栽培稻的回交结实率提高了15倍左右， 远远高于现有技术报道的水平， 为小粒野生稻有利基因的转移与利用奠定基础。 附图说明 0021 图 1 是显示部分子房培养杂种接种、 生根、 发芽和成苗的照片。其中， 1 ： 半切胚乳 接种 ； 2 ： 杂种发芽 ； 3 ： 杂种生根 ； 4 ： 杂种成苗。 0022 图 2 是显示种间杂种 F1田间套袋进行回交的照片。 0023 图 3 是显示小粒野生稻、 栽培稻 IR24、 野栽交 F1和回交一代杂种 BC1F1植株的照 片。其中， 1 ： 小粒野生稻 ； 2 ： 栽培稻 IR24 ； 3 ： F1； 4 ： BC1F1。 0024 图 4

23、是显示不同回交一代杂种 BC1F1的田间表现的照片。 0025 图 5 是显示 SSR 标记 （RM1208、 RM348、 RM324、 RM258、 RM32） 带型在亲本和 F1中的 表现的电泳照片。其中， 泳道 M ： Marker ； 泳道 1 ： 栽培稻金 23B ； 泳道 2 ： 小粒野生稻 ； 泳道 3 ： F1。 0026 图 6 是显示 RM5503 标记带型在小粒野生稻、 栽培稻金 23B、 F1和 27 个回交一代杂 种 BC1F1中的带型分布的电泳照片。泳道 M ： Marker ； 泳道 1 ： 栽培稻金 23B ； 泳道 2 ： 小粒野 生稻 ； 泳道 3 ： F

24、1； 泳道 4-30 ： BC1F1。 0027 图 5 和图 6 所示 SSR 标记带型分析的方法如下 ： 0028 采用CTAB法提取水稻新鲜叶片的DNA样品。 实验使用了80对SSR引物进行了分析 研究， 它们均匀分布于水稻的12条染色体， 都是取自公开发布的网站。 SSR标记的顺序与公 开发布的连锁图一致。 PCR扩增采用25L的反应体系， 含20ngDNA， 50mmol/L KCl， 10mmol/ L Tris-HCl(pH 8.8)， 0.001%Gelatin， 2.5mmol/L MgCl2， 0.2mmol/L dNTP， 0.2mmol/L SSR 引物， 和 1U 的

25、 Taq DNA 聚合酶。在 PCR 仪 (PTC-100 型 ) 上进行扩增反应， 反应条件为 ： 先 进行 94下的预变性 5min ； 接着 35 个循环反应， 即 94下变性 50s， 55下复性 45s， 72 下延伸 1min ； 最后在 72下延伸 5min。PCR 产物在 6% 聚丙烯酰胺变性凝胶 (PAGE) 上进行 分离， 通过银染的带型进行 SSR 等位基因的相似性和多样性分析。 具体实施方式 0029 下面将结合具体实施例对本发明的方法做更详细的说明。 0030 野生稻和栽培稻的获得途径 ： 说 明 书 CN 102668973 A 5 4/6 页 6 0031 小粒野

26、生稻来自于国际水稻研究所 （IRRI） 国际水稻种质中心,编号为101133 ； 栽 培稻 IR24（籼稻） 、 农垦 58（粳稻） 和金 23B（籼稻） 均为本申请人向相关科研单位征集的栽 培稻品种， 公众可通过向相关科研单位征集获得。 0032 实施例 1 0033 在湖北武昌进行栽培稻籼稻 IR24 和小粒野生稻的远缘杂交。由于小粒野生稻的 感光性强， 自然条件下小粒野生稻最佳抽穗期为 9 月下旬至 10 月上旬， 在武昌作杂交需要 做短光处理。借助温室和短光处理可以将杂交安排在 9 月上旬。 0034 待栽培稻 IR24 和小粒野生稻花期相遇时， 在下午 4 ： 00 以后， 选择穗数

27、较多、 穗层 相对整齐、 当天开始开花的 IR24 的植株 5-8 株， 首先用剪刀剔除当天已经开放的颖花， 再 用 44 -46的温水处理稻穗 4-5 分钟， 进行杀雄处理， 随后进行人工剪颖 （用剪刀剪去每 个颖花上部 1/3 的部分） 和套袋 （用长 28 ， 宽 10 的硫酸钠杂交纸袋进行套袋） ， 准备授 粉 ； 第二天， 待小粒野生稻开花散粉时， 用剪刀剪取小粒野生稻的单个小穗置于已套袋准备 授粉的 IR24 的稻穗上， 用手抖动小穗进行人工授粉， 连续授粉 3 天。 0035 待杂种幼胚发育 10-12 天后， 取出小穗中膨大的子房进行胚拯救。先用 70% 的酒 精消毒 3 分钟

28、， 再用 0.1% 的 Hgcl2灭菌 10 分钟， 后用灭菌水清洗 3-5 次， 在无菌的条件下， 将准备培养的子房， 从中部切断胚乳， 选取含有胚的部分接种于 1/4MS 固体培养基上， 在 261的条件下进行暗培养， 待发芽后移到光强为 15000Lux 的条件下进行光培养 （温度 为 261、 光照时间为 24 小时 / 天） ， 到 3 叶期后将其暴露于空气中加水培养 7 天左右 （温 度为室温、 光照为日光） 后移栽成苗， 从而获得了 IR24 与小粒野生稻的种间杂种 F1。 0036 在海南崖城进行栽培稻 IR24 和小粒野生稻回交一代杂种 （BC1F1） 的获得。小粒野 生稻在

29、崖城的最佳抽穗期为 2 月下旬至 3 月上旬， 而 IR24 在崖城如果在 11 月下旬播种， 它 的最佳抽穗期为 3 月上、 中旬， 因此， 将回交安排在 2 月下旬至 3 月上旬进行。 0037 将所获得的野栽交 （即小粒野生稻与栽培稻杂交） 的种间杂种 F1植株进行稀植， 株 行距为30cm50cm， 待F1植株成活后， 每隔5-7天施用尿素5.0kg/亩促分蘖， 连续施用3-4 次， 并进行 3 次分蔸扩繁种植， 尽可能获得较多 F1植株。将栽培稻 IR24 分 4 期进行播种， 各播种期分别为 ： 10 月 25、 11 月 3 号、 11 月 13 号、 11 月 21 号。 00

30、38 待栽培稻 IR24 和野栽交的种间杂种 F1花期相遇时， 每天从 F1植株上通过分蔸带 根取出当天开始开花的穗子， 集中移植于塑料桶中， 塑料桶中泥土深 10-15 厘米， 水深 5-7 厘米， 挂牌记载当天的日期， 并从第2天开始取栽培稻IR24的花粉进行人工直接授粉， 连续 授粉 3 天。 0039 根据塑料桶上挂牌记载的日期， 选取已授粉 10-12 天的塑料桶， 逐一取出其中的 穗子， 并在日光或灯光下， 逆光查找子房膨大的小穗。 0040 取出小穗中膨大的子房进行胚拯救， 先用 70% 的酒精消毒 3 分钟， 再用 0.1% 的 Hgcl2灭菌10分钟， 后用灭菌水清洗3-5次

31、， 在无菌的条件下， 将准备培养的子房， 从中部切 断胚乳， 选取含有胚的部分接种于 1/4MS 固体培养基上。 0041 在 261的条件下进行暗培养， 待发芽后移到光强为 15000Lux 的条件下进行光 培养， 培养温度为 261， 光照时间为 24 小时 / 天 ； 到 3 叶期后将其暴露于空气中， 加水， 室温和日光下培养 7 天左右， 然后移栽成苗， 从而获得了 IR24 与小粒野生稻的回交一代杂 种 （BC1F1） 植株。 说 明 书 CN 102668973 A 6 5/6 页 7 0042 统计表明 ： IR24 与小粒野生稻回交一代杂种的获得率是 0.32%。 0043 表

32、 1 是在武昌地区栽培时， 亲本、 种间杂种 F1和回交一代杂种 BC1F1的 7 个表型性 状的表现情况。 0044 表 1 0045 0046 表 1 列出了 IR24、 小粒野生稻、 F1和 BC1F17 个性状的表现值。由此可以看出 , 在 回交后代中所有性状的变化幅度都较大,并都出现了极端的表型变异;其中每穗颖花数的 变化幅度最大 , 而一次枝梗数的变化幅度最小。 0047 实施例 2 0048 在湖北武昌进行栽培稻粳稻农垦 58 和小粒野生稻的远缘杂交。由于小粒野生稻 的感光性强， 自然条件下小粒野生稻最佳抽穗期为 9 月下旬至 10 月上旬， 在武昌作杂交需 要做短光处理。借助温

33、室和短光处理可以将杂交安排在 9 月上旬。 0049 待栽培稻农垦 58 和小粒野生稻花期相遇时， 对小粒野生稻与栽培稻农垦 58 进行 杂交， 杂交的方式方法与实施例 1 相同。 0050 待杂种幼胚发育 10-12 天后， 取出小穗中膨大的子房进行胚拯救。胚拯救的方法 与实施例 1 相同。 0051 在海南崖城进行栽培稻农垦 58 和小粒野生稻回交一代杂种 （BC1F1） 的获得。小粒 野生稻在崖城的最佳抽穗期为 2 月下旬至 3 月上旬， 而农垦 58 在崖城如果在 11 月下旬播 种， 它的最佳抽穗期为 2 月下旬至 3 月上旬， 因此， 将回交安排在 2 月下旬至 3 月上旬进行。

34、0052 将所获得的野栽交 （即小粒野生稻与栽培稻杂交） 的杂种 F1植株进行稀植 （株行距 为30cm50cm） ， 待F1植株成活后， 每隔5-7天施用尿素5.0kg/亩促分蘖， 连续施用3-4次， 并进行 3 次分蔸扩繁种植， 尽可能获得较多 F1植株。将栽培稻农垦 58 分 3 期进行播种， 各 播种期分别为 ： 11 月 3 号、 11 月 13 号、 11 月 21 号。 0053 待栽培稻农垦 58 和野栽交的种间杂种 F1花期相遇时， 取栽培稻农垦 58 的花粉与 野栽交的种间杂种 F1进行回交授粉， 授粉的方法与实施例 1 相同。 0054 根据塑料桶上挂牌记载的日期， 选取

35、已授粉 10-12 天的塑料桶， 逐一取出其中的 穗子， 并在日光或灯光下， 逆光查找子房膨大的小穗。 0055 取出小穗中膨大的子房进行胚拯救， 胚拯救的方法与实施例 1 相同。 0056 统计表明 ： 农垦 58 与小粒野生稻回交一代杂种的获得率是 0.34%。 0057 实施例 3 0058 在湖北武昌进行栽培稻籼稻金 23B 和小粒野生稻的远缘杂交。由于小粒野生稻的 感光性强， 自然条件下小粒野生稻最佳抽穗期为 9 月下旬至 10 月上旬， 在武昌作杂交需要 做短光处理。借助温室和短光处理可以将杂交安排在 9 月上旬。 说 明 书 CN 102668973 A 7 6/6 页 8 00

36、59 待栽培稻金 23B 和小粒野生稻花期相遇时， 对小粒野生稻与栽培稻金 23B 进行杂 交， 杂交的方式方法与实施例 1 相同。 0060 待杂种幼胚发育 10-12 天后， 取出小穗中膨大的子房进行胚拯救， 胚拯救的方法 与实施例 1 相同。 0061 在海南陵水进行栽培稻金 23B 和小粒野生稻回交一代杂种 （BC1F1） 的获得。小粒 野生稻在陵水的最佳抽穗期为 3 月上旬， 而金 23B 在陵水如果在 12 月上旬播种， 它的最佳 抽穗期为 3 月上旬， 因此， 将回交安排在 3 月上旬进行。 0062 将所获得的野栽交 （即小粒野生稻与栽培稻杂交） 的杂种 F1植株进行稀植 （株

37、行 距为 30cm50cm） ， 待 F1植株成活后， 每隔 5-7 天施用尿素 5.0kg/ 亩促分蘖， 连续施用 3-4 次， 并进行 3 次分蔸扩繁种植， 尽可能获得较多 F1植株。将栽培稻金 23B 分 3 期进行播种， 各播种期分别为 ： 12 月 5 号、 12 月 12 号、 12 月 18 号。 0063 待栽培稻金 23B 和野栽交的种间杂种 F1花期相遇时， 取栽培稻金 23B 的花粉与野 栽交的种间杂种 F1进行回交授粉， 授粉的方法与实施例 1 相同。 0064 根据塑料桶上挂牌记载的日期， 选取已授粉 10-12 天的塑料桶， 逐一取出其中的 穗子， 并在日光或灯光下

38、， 逆光查找子房膨大的小穗。 0065 取出小穗中膨大的子房进行胚拯救， 胚拯救的方法与实施例 1 相同。 0066 统计表明 ： 金 23B 与小粒野生稻回交一代杂种的获得率是 0.35%。 0067 表 2 是在南宁地区栽培时， 金 23B、 小粒野生稻、 F1和回交一代杂种 BC1F1的 7 个表 型性状的表现情况。 0068 表 2 0069 0070 表 2 列出了金 23B、 小粒野生稻、 F1和回交一代杂种 BC1F17 个性状的表现值。由此 可以看出， 在回交后代中所有性状的变化幅度都较大， 并都出现了极端的表型变异 ； 其中每 穗颖花数的变化幅度最大， 而剑叶长的变化幅度最小。 说 明 书 CN 102668973 A 8 1/3 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102668973 A 9 2/3 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102668973 A 10 3/3 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102668973 A 11