一种三七总皂苷组合物及其制备方法和用途.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610163772.6 (22)申请日 2016.03.22 (71)申请人 哈尔滨珍宝制药有限公司 地址 150060 黑龙江省哈尔滨市开发区哈 平路集中区烟台一路8号 (72)发明人 方同华 项彦华 周广红 贾文娟 王博 葛一蒙 (74)专利代理机构 北京精金石专利代理事务所 (普通合伙) 11470 代理人 刘晔 (51)Int.Cl. A61K 31/704(2006.01) A61P 7/02(2006.01) (54)发明名称 一种三七总皂苷组合物及其制备方法和

2、用 途 (57)摘要 本发明提供了一种三七总皂苷组合物及其 制备方法和用途。 本发明提供的三七总皂苷组合 物， 按照重量百分数， 其含有人参皂苷Rg1 30 50、 人参皂苷Rb12540、 三七皂苷R1 7 16、 人参皂苷Re 2.78、 人参皂苷Rd 0.5 7.0、 人参皂苷Rf 0.52%、 人参皂苷Rh2 0.3 2.0、 人参皂苷Rc 13、 人参皂苷Rb3 0.3 2.5和人参皂苷Rg30.52.5%； 其中人参皂苷 Rg1、 人参皂苷Rb1和三七皂苷R1占活性成分总重 量的7095%， 且人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含 量之和不小于8倍的人参皂苷Rd的含量。 本发明 提供的

3、三七总皂苷组合物与市售血栓通和血塞 通制剂相比， 具有更明显的抗动静脉血栓效果和 低毒安全性。 权利要求书2页 说明书30页 附图2页 CN 105816471 A 2016.08.03 CN 105816471 A 1.一种三七总皂苷组合物， 其特征在于： 按照重量百分数， 其含有人参皂苷Rg1 30 50、 人参皂苷Rb12540、 三七皂苷R1 716、 人参皂苷Re 2.78、 人参皂苷Rd 0.5 7.0、 人参皂苷Rf 0.52%、 人参皂苷Rh2 0.32.0、 人参皂苷Rc 1.03、 人参皂苷Rb3 0.32.5和人参皂苷Rg30.52.5%； 其中人参皂苷Rg1、 人参皂苷

4、Rb1和三七皂苷R1占活性成 分总重量的7095%， 且人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量之和不小于8倍的人参皂苷Rd的含 量。 2.如权利要求1所述的三七总皂苷组合物， 其特征在于： 按照重量百分数， 其含有人参 皂苷Rg134.646、 人参皂苷Rb1 2738、 三七皂苷R1 815、 人参皂苷Re 36、 人 参皂苷Rd 16， 人参皂苷Rf 0.82%、 人参皂苷Rh2 0.61.8%、 人参皂苷Rc 1.2 2.6%、 人参皂苷Rb3 0.82.2和人参皂苷Rg3 0.82.4%； 其中人参皂苷Rg1、 人参皂苷Rb1和 三七皂苷R1占总重量的7590%， 且人参皂苷Rb1和三七皂

5、苷R1的含量之和不小于10倍的人 参皂苷Rd的含量。 3.如权利要求1所述的三七总皂苷组合物， 其特征在于： 按照重量百分数， 其含有含有 人参皂苷Rg1 36.543、 人参皂苷Rb1 2935、 三七皂苷R1 1014、 人参皂苷Re 3.2 5.8、 人参皂苷Rd 16， 人参皂苷Rf 1.22.0%、 人参皂苷Rh2 1.21.8%、 人参皂苷 Rc 1.22.2%、 人参皂苷Rb3 1.02.2和人参皂苷Rg31.02.4%； 其中人参皂苷Rg1、 人参皂 苷Rb1和三七皂苷R1占总重量的8590%， 且人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量之和不小于20 倍的人参皂苷Rd的含量。 4.

6、权利要求1-3中任意一项所述的三七总皂苷组合物在制备治疗或预防血栓性疾病的 药物中的应用。 5.一种治疗或预防血栓性疾病的药物组合物， 其特征在于： 所述的药物组合物包含治 疗有效量的权利要求1-3中任意一项所述的三七总皂苷组合物和任选的药学上可以接受的 辅料， 可以制成的注射液、 冻干粉针剂、 颗粒剂、 丸剂、 片剂或胶囊剂。 6.一种制备权利要求1-3中任意一项所述的三七总皂苷组合物的方法， 其特征在于： 所 述的制备方法包括以下步骤： .前处理； .提取； .大孔吸附树脂处理； .D900树脂脱 色。 7.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 所述的步骤前处理的方法为： 将三七 或

7、三七剪口清洗干净后， 于90120烘干后破碎至粒度为0.55mm， 得到提取前物料A； 其 中破碎粒度优选为13mm。 8.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 所述的步骤提取的方法为： 将步骤 所得提取前物料A称重， 加入物料A重量13倍的6575%乙醇浸泡1224小时后收集乙醇， 再向药渣中加入物料A重量12倍的8095%乙醇后， 在1540浸泡1224小时后收集乙 醇， 合并两次乙醇收集液， 加热回流提取并浓缩810小时后， 对浓缩液减压浓缩至无醇味， 得到浓缩膏。 9.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 所述的步骤大孔吸附树脂处理的方法 为： 将步骤所得浓缩膏加纯化水稀释

8、至250400mg （生药） /mL， 室温水沉1224小时后， 用滤纸过滤后收集滤液， 使用12倍滤液体积的HPD300、 D101或AB-8树脂以1.21.4BV/h 的流速对滤液进行过柱吸附后， 用12倍树脂体积的纯化水冲洗树脂柱后， 用11.5倍树 脂体积的6080%乙醇浸泡树脂45分钟后， 先后用11.5倍树脂体积的5560%乙醇、 1倍树 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 105816471 A 2 脂体积的6570%乙醇和12倍树脂体积的7585%乙醇以0.81.2BV/h的流速洗脱， 得到 洗脱液； 其中大孔吸附树脂优选使用HPD300或D101； 进一步优选使用D10

9、1。 10.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 所述的步骤D900树脂脱色的方法为： 步 骤的洗脱液直接以2.05.0BV/h的流速过步骤所述的滤液体积2/3的D900树脂并收集 流出液， 待露出树脂面时， 加入12倍D900树脂体积的85%乙醇以相同流速冲洗树脂柱并收 集流出液， 合并两次流出液后， 加入步骤所得浓缩膏重量25的药用炭于4045保 温脱色40分钟， 冷却至室温后， 用滤纸过滤脱炭后的药液A， 减压浓缩至药液相对密度为 1.061.08 （605测定） 后， 于70干燥1.53.0小时后得到所述的三七总皂苷组合物； 其中药用炭的使用量优选为浓缩膏重量的4%。 权 利 要

10、 求 书 2/2 页 3 CN 105816471 A 3 一种三七总皂苷组合物及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明属于药物制剂领域， 具体涉及一种三七总皂苷组合物及其制备方法和用 途。 背景技术 0002 三七又名田七， 为伞形目五加科植物， 主要分布于云南、 广西、 江西、 四川等地。 中 药材三七是以其根部作为药用部分， 其根茎中含有多种皂苷， 具有扩张血管、 抑制血小板聚 集、 散瘀止血和消肿定痛的作用， 主治咯血， 吐血， 衄血， 便血， 崩漏， 外伤出血， 胸腹刺痛， 跌 仆肿痛。 0003 皂苷是三七主要有效活性成分之一， 也是研究的较为系统的化学物质。 现已从三 七的

11、不同部位分离得到54种单体皂苷成分， 如三七皂苷R1、 人参皂苷Rg1、 人参皂苷Re、 人参 皂苷Rb1、 人参皂苷Rd， 其次还含有20(S)-三七皂苷R2、 20(S)-人参皂苷Rg2、 20(S)-人参皂苷 Rh1等。 以三七总皂苷为主要有效成分制成的药物制剂的商品名有血塞通、 血栓通， 在临床 上具有活血祛瘀， 通脉活络的功能， 可用于治疗心脑血管系统疾病， 中风偏瘫、 瘀血阻络症， 脑栓塞， 视网膜中央静脉阻塞； 具有增加脑动脉及冠状动脉血流量， 降血脂， 降低血液粘度， 改善微循环等功效。 0004 近年来三七总皂苷的临床应用范围不断拓宽， 目前临床应用较多的三七总皂苷产 品有血

12、塞通注射液、 血塞通软胶囊、 络泰粉针、 正康脑明注射液、 血栓通注射液、 路路通注射 液等。 由于其显著的活血化瘀、 消肿定痛、 抗衰老、 抗炎以及抗肿瘤功效， 越来越多不同功效 与组成的三七总皂苷制剂被开发研究。 0005 中国专利申请CN200910175602公开了一种药物组合物， 其组分包括： 人参皂苷 Rb1、 人参皂苷Rg1、 三七皂苷R1、 人参皂苷Rd、 人参皂苷Re、 人参皂苷Rf、 人参皂苷Rc、 人参皂 苷Rh1、 人参皂苷Rb2、 人参皂苷Rg3， 上述药物组合物各组分优选的重量百分比为： 人参皂苷 Rb1 30.040.0、 人参皂苷Rg1 25.035.0、 三七

13、皂苷R1 7.015.0、 人参皂 苷Rd 7.010.0、 人参皂苷Re 4.07.0、 人参皂苷Rf 0.32.0、 人参皂苷Rc 0.52.0、 人参皂苷Rh1 0.53.0、 人参皂苷Rb2 0.53.0、 人参皂苷Rg 30.52.0。 0006 中国专利申请CN200610066204公开了一种治疗心脑血管疾病的三七药物组合物， 其活性成分由三七总皂苷组成， 其中三七皂苷R1、 人身皂苷Rg1、 人身皂苷Re与人身皂苷Rb1 的总量不低于55.0%， 且人参皂苷Rd含量不得超过2.5%。 0007 中国专利申请CN201010003434公开了一种三七提取物及其制剂， 其含有三七皂

14、苷 R1 510， 人参皂苷Rg1 2536， 人参皂苷Re 2.55， 人参皂苷Rb1 3039， 人参 皂苷Rd 510， 人参皂苷Rf、 人参皂苷Rh1、 人参皂苷Rc、 人参皂苷Rb2和人参皂苷Rg3不少 于2， 且三七皂苷R1、 人参皂苷Rg1、 人参皂苷Re、 人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd 占总重量的75 95。 0008 尽管目前已经开发出众多以三七总皂苷为主要成分的药物制剂， 但以三七总皂苷 说 明 书 1/30 页 4 CN 105816471 A 4 为主的药物制剂成分复杂， 目前尚未研究清楚具体哪个成分发挥主要治疗作用， 而哪些成 分有毒副作用会导致不良反应， 各个成分之

15、间有无协同或拮抗作用以及相应作用机理也没 有全面系统的研究。 三七总皂苷制剂自临床使用以来， 存在许多不良反应记录。 0009 在江苏省人民医院2003年1月-2008年3月上报的不良反应分析报告中， 检索出由 于使用三七总皂苷所引起的不良反应共69例。 其中皮肤及附件系统损害主要表现为皮疹、 斑丘疹、 红斑疹； 全身性损害主要表现为高热、 寒战； 心外血管系统损害主要表现为静脉炎。 根据惠州市区三家医院的统计结果， 2009年-2011年共收到71份由于使用三七总皂苷制剂 而引起的不良反应发生报告， 其中注射用血塞通不良反应报告26份、 血塞通注射液不良反 应报告20份、 血栓通注射液不良反

16、应报告25份， 不良反应的临床症状主要累及皮肤及附件、 胃肠系统、 神经系统、 呼吸系统、 消化系统、 心血管系统、 血液系统以及肌肉和关节等。 对合 肥市第三人民医院656份使用三七总皂苷注射剂的完整住院病历进行调查， 共有67例不良 反应发生报告， 发生率为10.2%， 其中以皮肤和附件损害为首， 其次分别为神经系统和心血 管系统损害。 0010 本申请人长期致力于三七药物制剂的研发， 经本申请人对目前市售的多种血塞通 与血栓通制剂进行致敏性检验和综合分析， 发现不良反应发生较多。 0011 综上所述， 开发出一种不良反应发生率低、 治疗效果优异的三七总皂苷提取物， 使 包含其的药物制剂同

17、时兼具治疗有效性和低毒安全性， 是三七总皂苷药物制剂研发与实际 应用中亟待解决的问题。 发明内容 0012 本发明的目的是提供一种兼具治疗有效性和低毒安全性的三七总皂苷组合物及 其制备方法和用途。 0013 一个方面， 本发明提供了一种三七总皂苷组合物， 按照重量百分数， 其含有人参皂 苷Rg13050、 人参皂苷Rb12540、 三七皂苷R1716、 人参皂苷Re 2.78、 人参皂 苷Rd 0.57.0、 人参皂苷Rf 0.52%、 人参皂苷Rh2 0.32.0、 人参皂苷Rc 1.03、 人 参皂苷Rb3 0.32.5和人参皂苷Rg30.52.5%； 其中人参皂苷Rg1、 人参皂苷Rb1

18、和三七皂苷 R1占活性成分总重量的7095%， 且人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量之和不小于8倍的人参 皂苷Rd的含量。 0014 本发明所述的三七总皂苷组合物优选为， 按照重量百分数， 其含有人参皂苷 Rg134.646、 人参皂苷Rb12738、 三七皂苷R1815、 人参皂苷Re 36、 人参皂苷 Rd16， 人参皂苷Rf 0.82%、 人参皂苷Rh2 0.61.8%、 人参皂苷Rc 1.22.6%、 人参皂 苷Rb3 0.82.2和人参皂苷Rg3 0.82.4%； 其中人参皂苷Rg1、 人参皂苷Rb1和三七皂苷R1占 总重量的7590%， 且人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量之和不小

19、于10倍的人参皂苷Rd的含 量。 0015 本发明所述的三七总皂苷组合物进一步优选为， 按照重量百分数， 其含有人参皂 苷Rg136.543、 人参皂苷Rb12935、 三七皂苷R11014、 人参皂苷Re 3.25.8、 人参皂苷Rd16， 人参皂苷Rf 1.22.0%、 人参皂苷Rh2 1.21.8%、 人参皂苷Rc 1.2 2.2%、 人参皂苷Rb3 1.02.2和人参皂苷Rg31.02.4%； 其中人参皂苷Rg1、 人参皂苷Rb1和 三七皂苷R1占总重量的8590%， 且人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量之和不小于20倍的人 说 明 书 2/30 页 5 CN 105816471 A

20、5 参皂苷Rd的含量。 0016 另一个方面， 本发明还提供了上述三七总皂苷组合物的制备方法， 该制备方法包 括如下步骤： .前处理： 将三七或三七剪口清洗干净后， 于90120烘干后破碎至粒度为0.5 5mm， 得到提取前物料A； .提取： 将步骤所得提取前物料A称重， 加入物料A重量13倍的6575%乙醇浸泡 1224小时后收集乙醇， 再向药渣中加入物料A重量12倍的8095%乙醇后， 在1540 浸泡1224小时后收集乙醇， 合并两次乙醇收集液， 加热回流提取并浓缩810小时后， 对 浓缩液减压浓缩至无醇味， 得到浓缩膏； .大孔吸附树脂处理： 将步骤所得浓缩膏加纯化水稀释至250400

21、mg （生药） /mL， 室温水沉1224小时后， 用滤纸过滤后收集滤液， 使用12倍滤液体积的HPD300、 D101或 AB-8大孔吸附树脂以1.21.4BV/h的流速对滤液进行过柱吸附后， 用12倍树脂体积的纯 化水冲洗树脂柱后， 用11.5倍树脂体积的6080%乙醇浸泡树脂45分钟后， 先后用11.5 倍树脂体积的5560%乙醇、 1倍树脂体积的6570%乙醇和12倍树脂体积的7585%乙醇 以0.81.2BV/h的流速洗脱， 得到洗脱液； .D900树脂脱色： 步骤的洗脱液直接以2.05.0BV/h的流速过步骤所述的滤液 体积2/3的D900树脂并收集流出液， 待露出树脂面时， 加入

22、13倍D900树脂体积的85%乙醇 以相同流速冲洗树脂柱并收集流出液， 合并两次流出液后， 加入步骤所得浓缩膏重量2 5的药用炭于4045保温脱色3050分钟， 冷却至室温后， 用滤纸过滤脱炭后得到药液 A， 减压浓缩至药液相对密度为1.061.08 （605测定） 后， 于70干燥1.53.0小时后 得到所述的三七总皂苷组合物。 0017 本发明所述的制备方法优选包括以下步骤： .前处理： 将三七或三七剪口清洗干净后， 于90120烘干后破碎至粒度为13mm， 得到提取前物料A； .提取： 将步骤所得提取前物料A称重， 加入物料A重量12倍的6570%乙醇浸泡 1218小时后收集乙醇， 再向

23、药渣中加入物料A重量1.52倍的8090%乙醇后， 在2030 浸泡1218小时后收集乙醇， 合并两次乙醇收集液， 加热回流提取并浓缩810小时后， 对浓缩液减压浓缩至无醇味， 得到浓缩膏； .大孔吸附树脂处理： 将步骤所得浓缩膏加纯化水稀释至250300mg （生药） /mL， 室温水沉1224小时后， 用滤纸过滤后收集滤液， 使用1.52倍滤液体积的D101大孔吸附 树脂以1.21.4BV/h的流速对滤液进行过柱吸附后， 用11.5倍D101树脂体积的纯化水冲 洗树脂柱后， 用11.5倍D101树脂体积的7080%乙醇浸泡树脂45分钟后， 先后用11.5倍 D101树脂体积的5558%乙醇

24、、 1倍D101树脂体积的6568%乙醇和1.52倍D101树脂体积 的7580%乙醇以1.01.2BV/h的流速洗脱， 得到洗脱液； .D900树脂脱色： 步骤的洗脱液直接以2.05.0BV/h的流速过步骤所述的滤液 体积2/3的D900树脂并收集流出液， 待露出树脂面时， 加入12倍D900树脂体积的85%乙醇 以相同流速冲洗树脂柱并收集流出液， 合并两次流出液后， 加入步骤所得浓缩膏重量3 4的药用炭于4045保温脱色40分钟， 冷却至室温后， 用滤纸过滤脱炭后的药液A， 减压 浓缩至药液相对密度为1.061.08 （605测定） 后， 于70干燥1.53.0小时后得到所 说 明 书 3

25、/30 页 6 CN 105816471 A 6 述的三七总皂苷组合物。 0018 以上制备方法中所用的乙醇浓度均指体积浓度。 0019 另一方面， 本发明还提供了一种治疗或预防血栓性疾病的药物组合物， 其包含治 疗有效量的上述三七总皂苷组合物和药学上可以接受的辅料， 可以制成的注射液、 冻干粉 针剂、 颗粒剂、 丸剂、 片剂或胶囊剂等。 0020 再一个方面， 本发明还提供所述的三七总皂苷组合物在制备治疗或预防血栓性疾 病的药物中的应用。 0021 本发明的有益效果： .本发明提供的三七总皂苷组合物的有效成分和含量比较明确， 其中人参皂苷Rg1、 人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的总含量高， 且

26、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量之和不小于8倍 的人参皂苷Rd的含量， 有效成分含量高， 杂质成分少， 质量可控性相对较高。 0022 .本发明提供的三七组合物， 其中Rb1和R1的总含量不小于8倍的Rd含量。 经毒理、 药理学实验证明， 本发明提供的三七总皂苷组合物与市售血栓通和血塞通制剂相比， 最大 耐受量与半数致死剂量均明显提高。 本发明提供的三七总皂苷组合物对ICR小鼠的半数致 死量 （LD50） 与最大耐受量 （MTD） 分别为431834mg/kg以及228329mg/kg； 市售血栓通和 血塞通制剂对ICR小鼠的MTD与半数致死量LD50分别为271354mg/kg以及1642

27、27mg/kg。 0023 .本发明提供的三七组合物， 其中Rb1和R1的总含量不小于8倍的Rd含量。 经类过 敏反应研究证明， 本发明提供的三七总皂苷组合物及其制剂与市售血栓通和血塞通制剂相 比， 引起类过敏反应的程度相对更低， 因此具有相对更低的致敏风险和相对较高的安全性。 0024 类过敏反应实验结果显示： 市售血塞通和血栓通制剂引起受试部位皮肤血管通透 性增高和组织液渗出的程度明显高于本发明提供的三七总皂苷组合物及其制剂； 市售血塞 通或血栓通制剂引起的细胞脱颗粒程度与 -氨基己糖苷酶释放明显高于本发明提供的三 七总皂苷组合物及其制剂。 0025 .本发明提供的三七组合物， 其中Rb1

28、和R1的总含量不小于8倍的Rd含量， 并且含 有现有或市售三七提取物及其制剂中不含有的Rh2和Rb3等组分。 多种血栓模型研究表明， 本 发明提供的三七总皂苷组合物及其制剂与市售血栓通和血塞通制剂相比， 具有更明显的抗 动静脉血栓作用。 0026 对血流停滞导致的静脉血栓形成的影响实验证明： 本发明提供的三七总皂苷组合 物对抗凝参数TT、 PT、 APTT均无明显影响； 并且对血栓形成的抑制率达到34.640.1%， 而市 售血栓通或血塞通制剂的抑制率为11.722.6%。 这说明本发明提供的三七总皂苷组合物 对血流停滞导致的静脉血栓形成的抑制效果相对更加优异。 0027 对下腔静脉内皮损伤诱

29、导的静脉血栓形成的影响实验证明： 本发明提供的三七总 皂苷组合物对凝血因子和抗凝系统无明显影响， 并且能够激活内源性溶栓系统， 部分通过 增加PGI2和抑制TXA2来防止血栓形成； 本发明提供的三七总皂苷组合物对血栓形成的抑制 率达到50.058.9%， 而市售血栓通或血塞通制剂的抑制率为7.426.1%。 这说明本发明提 供的三七总皂苷组合物对下腔静脉内皮损伤诱导的静脉血栓形成的抑制效果相对更加优 异。 0028 对动静脉旁路血栓形成的影响实验证明： 本发明提供的三七总皂苷组合物对血栓 形成的抑制率达到42.848.7%， 而市售血栓通或血塞通制剂的抑制率为21.131.6%。 这 说 明

30、书 4/30 页 7 CN 105816471 A 7 说明本发明提供的三七总皂苷组合物对动静脉旁路血栓形成的抑制效果相对更加优异。 0029 对颈动脉血栓形成的影响实验证明： 本发明提供的三七总皂苷组合物对血栓形成 时间的延长率为22.032.8%， 而市售血栓通或血塞通制剂对血栓形成时间的延长率为 13.620.7%。 这说明本发明提供的三七总皂苷组合物对颈动脉血栓形成的抑制效果相对 更加优异。 0030 综上所述， 本发明提供的三七总皂苷组合物成分和含量相对明确， 可控性相对较 高； 与市售血栓通和血塞通制剂相比， 具有更明显的抗动静脉血栓效果和低毒安全性。 附图说明 0031 图1为实

31、验例1中小鼠注射部位的蓝染情况照片。 0032 图2为实验例1中小鼠皮肤组织浸出液吸光度测定结果的柱状图。 0033 图3为实验例2中RBL-2H3细胞脱颗粒情况的显微照片， 图中未发生脱颗粒的细胞 未被着色， 发生脱颗粒的细胞则着色较深。 0034 图4为实验例2中RBL-2H3细胞 -氨基己糖苷酶释放率的柱状图。 具体实施方式 0035 以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。 应当指出， 对 于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行 若干改进和修饰， 这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。 对所公开的实施 例的下述说明

32、， 使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对这些实施例的多种修改 对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的， 本文中所定义的一般原理可以在不脱离本 发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。 因此， 本发明将不会被限制于本文所示 的这些实施例中， 而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范 围。 0036 除非另外定义， 本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的 普通技术人员通常理解的相同意义。 0037 术语： C48/80： Compound48/80， 是N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物， 能够促 进肥大细胞脱颗粒， 是常用的

33、肥大细胞活化剂。 0038 如无特殊说明， 本发明中所述的溶液配制所使用的溶剂均为超纯水； 如无特殊说 明， 本发明中所述的生理盐水均为质量浓度为0.9%的生理盐水。 0039 高效液相色谱仪购自Agilent公司， 型号为 1100； 气相测谱仪购自山东鲁创公司， 型号为AHS-6890； 酶标仪购自BioTek公司， 型号为Synergy H1； 凝血因子分析仪购自北京世 帝科学仪器公司， 型号为LG-PABER； 血小板聚集仪购自美国CHRONO-LOG 公司， 型号为 540VS； 实验性体内血栓形成测定仪购自包头医学院心血管研究室， 型号为BT87-2； 电子分 析天平购自北京赛多利

34、斯天平有限公司， 型号为Sartorius BT 125D； 离心机购自北京医用 离心机厂， 型号为LD5-2A -氨基己糖苷酶活性检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司， 货号为 GMS50273.1； 二磷酸腺苷二钠盐(ADP)购自美国Sigma 公司， 批号116H810； 花生四烯酸钠 说 明 书 5/30 页 8 CN 105816471 A 8 (AA)购自美国Sigma 公司， 批号041M5204V； 胶原(CG)购自美国Sigma 公司， 批号3422； 角叉 菜胶( I 型)购自美国Sigma 公司， 批号46H0910； 活化部分凝血酶时间 (Activated Pa

35、rtial Thrombopastin Time, APTT)测定试剂盒购自美德太平洋科技有限公司产品， 批 号021408A； 凝血酶原时间(Prothrombin Time, PT) 测定试剂盒购自美德太平洋科技有限 公司， 批号0114038； 凝血酶时间(Thrombin Time, TT) 测定试剂盒购自美德太平洋科技有 限公司， 批号031404A； 蛋白定量测试试剂盒购自南京建成生物技术有限公司， 批号 20141021； 大鼠内皮素(ET)酶联免疫分析试剂盒购自Bio-Swamp公司， 批号201412； 大鼠组 织纤溶酶原激活物(tPA)酶联免疫分析试剂盒购自Bio-Swam

36、p 公司， 批号201412； 大鼠组织 纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)酶联免疫分析试剂盒购自Bio-Swamp， 批号201412； 纤维 蛋白原(FIB)测定试剂盒购自美德太平洋科技有限公司， 批号： 041403C； 兔凝血因子a(F a)酶联免疫分析试剂盒购自上海通蔚实业有限公司， 批号201502； 兔凝血因子a(Fa) 酶联免疫分析试剂盒购自上海通蔚实业有限公司， 批号201501； 兔凝血因子a(Fa)酶联 免疫分析试剂盒购自上海通蔚实业有限公司， 批号201501； 兔抗凝血酶(AT)酶联免疫 分析试剂盒购自上海通蔚实业有限公司， 批号201501； 兔凝血酶-抗凝血酶

37、复合物(TAT)酶 联免疫分析试剂盒购自上海通蔚实业有限公司， 批号201501； 兔活化蛋白C(APC)酶联免疫 分析试剂盒购自上海通蔚实业有限公司， 批号201501； 兔纤溶酶原(PLG)酶联免疫分析试剂 盒购自上海通蔚实业有限公司， 批号201501； 兔尿激酶原(proUK)酶联免疫分析试剂盒购自 上海通蔚实业有限公司， 批号201501； 兔胰蛋白酶(trypsin)酶联免疫分析试剂盒购自上海 通蔚实业有限公司， 批号201501； 兔组织型纤维溶酶激活剂(t-PA)酶联免疫分析试剂盒购 自上海通蔚实业有限公司， 批号201503； 组织纤溶酶原激活物(t-PA)活性测定试剂盒购自

38、 美国Assaypro 公司， 批号05691410； 兔血栓素B2(TXB2)酶联免疫分析试剂盒购自上海通蔚 实业有限公司， 批号201503； 兔6-酮前列腺素F1 (6-keto-PGF1 )酶联免疫分析试剂盒购自 上海通蔚实业有限公司， 批号201503； 超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物技术 有限公司， 批号20150610； 丙二醛(MDA)测试盒购自南京建成生物技术有限公司， 批号 20150609。 其余化学试剂均购自美国Sigma 公司。 0040 实验用家兔由北京隆安实验动物养殖中心提供， 动物生产许可证号SCXK(京) 2009-0005； 实验用C57BL

39、/6小鼠和ICR小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供， 动 物生产许可证号SCXK(京)2012-0001； 实验用Wistar大鼠由北京维通利华实验动物技术有 限公司提供， 动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001。 0041 实施例1一种三七总皂苷组合物 一、 制备方法， 包括以下步骤： .前处理： 将三七剪口拣选去杂后于洗药机中， 用纯化水清洗干净后， 于120进行烘 干， 将烘干后的三七剪口进行破碎， 至破碎粒度为3mm， 得到提取前物料A； .提取： 将步骤所得提取前物料A称重， 加入物料A重量1倍的65%乙醇浸泡12小时后 收集乙醇， 再向药渣中加入物料A重量1.5倍

40、的80%乙醇后， 在30浸泡12小时后收集乙醇， 合并两次乙醇收集液， 加热回流提取并浓缩8小时后， 将浓缩液转移到单效外循环浓缩蒸发 器减压浓缩至无醇味， 得到浓缩膏； .大孔吸附树脂处理： 将步骤所得浓缩膏加纯化水稀释至400mg （生药） /mL， 室温水 沉12小时后， 用滤纸过滤后收集滤液， 使用2倍滤液体积的D101大孔吸附树脂以1.2BV/h的 说 明 书 6/30 页 9 CN 105816471 A 9 流速对滤液进行过柱吸附后， 用1倍D101树脂体积的纯化水冲洗树脂柱后， 用1倍D101树脂 体积的60%乙醇浸泡树脂45分钟后， 先后用1倍D101树脂体积的55%乙醇、

41、1倍D101树脂体积 的65%乙醇和1倍D101树脂体积的75%乙醇以1.0BV/h的流速洗脱， 得到洗脱液； .D900树脂脱色： 步骤的洗脱液直接以2.0BV/h的流速过步骤所述的滤液体积2/ 3的D900树脂并收集流出液， 待露出树脂面时， 加入1倍D900树脂体积的85%乙醇以相同流速 冲洗树脂柱并收集流出液， 合并两次流出液后， 加入步骤所得浓缩膏重量4的药用炭于 40保温脱色40分钟， 冷却至室温后， 用滤纸过滤脱炭后得要药液A， 减压浓缩至药液相对 密度为1.06 （605测定） 后， 于70干燥1.5小时后得到本发明所述的三七总皂苷组合 物。 0042 二、 三七总皂苷组合物中

42、的有效成分及含量检测方法： 使用高效液相色谱作为检测系统， 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以流动相A： 乙 腈， 流动相B： 水， 按下表进行梯度洗脱； 流速每分钟为1.5mL （色谱柱规格： 4.6250mm， 5 m） ； 检测波长为203nm； 柱温25。 0043 表1 梯度洗脱表 经检测， 本实施例的三七总皂苷组合物中的成分及含量为： 按照重量百分数， 其含有人 参皂苷Rg1 30.02、 人参皂苷Rb1 39.95、 三七皂苷R115.98、 人参皂苷Re 2.71、 人参 皂苷Rd 5.15， 人参皂苷Rf0.52%、 人参皂苷Rh2 1.76%、 人参皂苷Rc1.11%、

43、人参皂苷Rb3 0.34%和人参皂苷Rg30.52%； 其中人参皂苷Rg1、 人参皂苷Rb1和三七皂苷R1占总重量的 85.95%， 且人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量之和为人参皂苷Rd的含量的10.86倍。 说 明 书 7/30 页 10 CN 105816471 A 10 0044 三、 三七总皂苷组合物的其他性状检测： .外观检查： 检查方法： 目测。 0045 检查结果： 类白色粉末。 0046 .颜色检查： 检查方法： 将本实施例的三七总皂苷组合物制成每1mL中含三七总皂苷25mg的溶液， 照 溶液颜色检查法 （ 中国药典 一部附录XI A) 检查， 与黄色4号标准比色液比较。 0

44、047 检查结果： 供试品管呈现的颜色不深于黄色4号标准比色液。 0048 .有害元素检查： 检查方法： 取本实施例的三七总皂苷组合物0.1g， 用1mL的70乙醇和2硝酸混合溶 液溶解， 超声30min， 取1mL溶解后样品， 用2硝酸水溶液9mL稀释， 超声10min， 备用。 以7 乙醇和2硝酸混合溶液分别配制0、 1、 10和100ppb的混合元素标准； 使用70乙醇和2硝 酸混合溶液校准工作基线； 电感耦合等离子体质谱仪进行检查。 0049 检查结果： 18 种重金属及有害元素的总量为0.69mg/kg。 0050 .有机残留物检查： 检查方法： 按照残留溶剂测定法(中国药典2005

45、年版二部附录VIIIP第二法)测定。 色谱条件与系 统适用性试验以键合/交联聚乙二醇为固定相， 采用弹性石英毛细管柱(30m0.25mm 0.25 m)； 氢火焰离子化检测器， 柱温， 程序升温， 起始温度为60， 维持16 分钟， 再以每分 钟20升温至200， 维持2 分钟； 检测器温度300， 进样口温度240； 载气为氮气， 流速 为每分钟1.0mL。 顶空进样， 顶空瓶平衡温度为90， 平衡时间为30分钟。 0051 对照品溶液的制备： 精密称取正己烷、 苯、 甲苯、 对二甲苯、 邻二甲苯、 苯乙烯、 1,2- 二乙基苯和二乙烯苯对照品适量， 加N,N-二甲基乙酰胺制成每1mL中分别

46、含20 g、 4 g、 20 g、 20 g、 20 g、 20 g、 20 g、 20 g的溶液， 作为对照品储备液。 精密吸取上述储备液2mL， 置 50mL容量瓶中， 加25N,N-二甲基乙酰胺溶液稀释至刻度摇匀后， 精密量取5mL置于20mL顶 空瓶中， 密封瓶口， 制得对照品溶液。 0052 供试品溶液的制备： 精密称取本实施例的三七总皂苷组合物0.1g， 置于20mL顶空 瓶中， 加入25N,N-二甲基乙酰胺溶液5mL， 密封瓶口， 摇匀， 制得供试品溶液。 0053 测定方法： 精密量取顶空气体1mL， 注入气相色谱仪， 记录色谱图， 按外标法以峰面 积计算有机残留物含量。 00

47、54 检查结果： 苯、 正己烷、 甲苯、 对二甲苯、 邻二甲苯、 苯乙烯、 1,2-二乙基苯和二乙烯 苯均未检出。 0055 实施例2一种三七总皂苷组合物 一、 制备方法， 包括以下步骤： .前处理： 将三七拣选去杂后于洗药机中， 用纯化水清洗干净后， 于90进行烘干， 将 烘干后的三七剪口进行破碎， 至破碎粒度0.5mm， 得到提取前物料A； .提取： 将步骤所得提取前物料A称重， 加入物料A重量2倍的75%乙醇浸泡24小时后 收集乙醇， 再向药渣中加入物料A重量1倍的95%乙醇后， 在15浸泡24小时后收集乙醇， 合 并两次乙醇收集液， 加热回流提取并浓缩10小时后， 将浓缩液转移到单效外

48、循环浓缩蒸发 说 明 书 8/30 页 11 CN 105816471 A 11 器减压浓缩至无醇味， 得到浓缩膏； .大孔吸附树脂处理： 将步骤所得浓缩膏加纯化水稀释至300mg （生药） /mL， 室温水 沉24小时后， 用滤纸过滤后收集滤液， 使用1.5倍滤液体积的HPD300树脂以1.4BV/h的流速 对滤液进行过柱吸附后， 用1.5倍HPD300树脂体积的纯化水冲洗树脂柱后， 用1.5倍HPD300 树脂体积的80%乙醇浸泡树脂45分钟后， 先后用1.5倍HPD300树脂体积的60%乙醇、 1倍 HPD300树脂体积的70%乙醇和1.5倍HPD300树脂体积的85%乙醇以0.8BV/h的流速洗脱， 得到 洗脱液； .D900树脂脱色： 步骤的洗脱液直接以5.0BV/h的流速过步骤所述的滤液体积2/ 3的D900树脂并收集流出液， 待露出树脂面时， 加入