双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611096883.6 (22)申请日 2016.12.02 (71)申请人 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿 生研究所 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区 独墅湖高教区若水路398号 (72)发明人 戴建武 赵燕南 陈冰 李晓然 徐白 (74)专利代理机构 南京利丰知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 32256 代理人 王锋 (51)Int.Cl. A61L 27/36(2006.01) A61L 27/38(2006.01) A61L 27/54(2006.0

2、1) (54)发明名称 双功能胶原支架材料、 其制法及在脊髓损伤 修复中的应用 (57)摘要 本申请公开了一种双功能胶原支架材料、 其 制法及在脊髓损伤修复中的应用。 所述双功能胶 原支架材料包括神经再生支架以及与所述神经 再生支架结合的CBD-EGFR-Fab抗体， 所述CBD- EGFR-Fab抗体包含胶原结合区域以及与所述胶 原结合区连接的EGFR抗体的Fab区。 本申请提供 的双功能胶原支架材料在体外可以促进外源性 神经干细胞结合以及挽救髓鞘蛋白存在时被抑 制的神经干细胞向神经元的分化， 在体内可以有 效减少外源性神经干细胞从移植部位的扩散， 以 及通过促进神经干细胞分化成功能性神经元

3、从 而重建神经元回路， 最终促进脊髓损伤后运动功 能恢复。 权利要求书1页 说明书6页 附图14页 CN 108144120 A 2018.06.12 CN 108144120 A 1.一种双功能胶原支架材料， 其特征在于包括神经再生支架以及与所述神经再生支架 结合的CBD-EGFR-Fab抗体， 所述CBD-EGFR-Fab抗体包含胶原结合区域以及与所述胶原结合 区连接的EGFR抗体的Fab区。 2.根据权利要求1所述的双功能胶原支架材料， 其特征在于： 所述神经再生支架至少来 源于生物肌肉筋膜。 3.如权利要求1所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用， 所述产品至少具有在 体外结合外源性

4、神经干细胞并促进神经干细胞向神经元分化的功能。 4.如权利要求1所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用， 所述产品至少具有在 体内促进神经干细胞富集并促进神经干细胞向神经元分化的功能。 5.如权利要求1所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用， 所述产品至少具有促 进脊髓损伤区功能性神经元和突触素产生的功能。 6.权利要求1所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用， 所述产品至少具有修复 脊髓损伤的功能。 7.如权利要求5所述的应用， 其特征在于： 所述产品还包括外源性神经干细胞。 8.如权利要求1所述双功能胶原支架材料作为修复脊髓损伤材料的应用。 9.一种双功能胶原支架材料的制法， 其特征

5、在于包括： 提供CBD-EGFR-Fab抗体， 其包含胶原结合区域以及与所述胶原结合区连接的EGFR抗体 的Fab区； 使所述CBD-EGFR-Fab抗体与神经再生支架结合， 形成所述双功能胶原支架材料。 10.根据权利要求9所述的制法， 其特征在于包括： 将线性化的pPICZ B-CBD-Fab整合进 重组毕赤酵母克隆的基因组， 之后进行表达和纯化， 获得所述CBD-EGFR-Fab抗体。 11.根据权利要求9所述的制法， 其特征在于： 所述神经再生支架至少来源于生物肌肉 筋膜。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108144120 A 2 双功能胶原支架材料、 其制法及在脊髓损伤修

6、复中的应用 技术领域 0001 本申请具体涉及一种生物支架材料， 特别涉及一种双功能胶原支架材料、 其制备 方法及在脊髓损伤修复中的应用。 背景技术 0002 脊髓损伤通常会引起损伤截面以下永久性感觉和运动功能的障碍。 近数十年来， 基于神经干细胞治疗脊髓损伤的疗法发生了巨大的进步。 神经干细胞具有向神经元、 星形 胶质细胞和少突胶质细胞分化的多向分化潜能， 并且能自我更新， 修复和替代脊髓损伤处 死亡的神经细胞。 同时， 神经干细胞是未分化的原始细胞， 不表达成熟的细胞抗原， 移植后 不会被宿主免疫系统所识别。 除此之外， 它还可以与宿主的神经组织融合良好， 并在宿主体 内长期存活。 但是移

7、植后损伤区很少的细胞停留以及很低的神经元分化效率都会影响神经 干细胞治疗脊髓损伤的疗效。 0003 传统方法是脊髓内或鞘内把神经干细胞注射进损伤部位， 但由于脑脊髓液的存 在， 移植的神经干细胞趋向于扩散至周围正常脊髓组织， 很少停留于损伤区。 并且， 由于脊 髓损伤后局部抑制性微环境的形成， 会导致残留于损伤区的神经干细胞会主要分化成胶质 细胞。 一些生物材料的支架能提供一个结构支撑来桥接脊髓损伤处的空隙， 也能用于递送 干细胞以改善或重建脊髓损伤后形成的局部抑制性微环境。 干细胞可以被包裹或黏附在支 架材料上以防移植后的快速扩散。 然而， 细胞和材料间非特异性的互作和低亲和性不能使 干细胞

8、很好地结合于材料上， 从而停留于损伤区。 此外， 一些支架材料用NT3或BDNF等生物 分子修饰后， 可用于促进神经干细胞向神经元分化。 但是细胞和功能生物分子的迅速扩散 会导致脊髓损伤部位残留的神经干细胞数量不足以及不足够的神经元的分化。 发明内容 0004 本申请的主要目的在于提供一种双功能胶原支架材料、 其制备方法及在脊髓损伤 修复中的应用， 以克服现有技术中的不足。 0005 为实现前述发明目的， 本申请采用的技术方案包括： 0006 本申请实施例提供了一种双功能胶原支架材料， 其包括神经再生支架以及与所述 神经再生支架结合的CBD-EGFR-Fab抗体， 所述CBD-EGFR-Fab

9、抗体包含胶原结合区域以及与 所述胶原结合区连接的EGFR抗体的Fab区。 0007 进一步的， 所述神经再生支架至少来源于生物肌肉筋膜。 0008 本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用， 所述产品 至少具有在体外结合外源性神经干细胞并促进神经干细胞向神经元分化的功能。 0009 本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用， 所述产品 至少具有在体内促进神经干细胞富集并促进神经干细胞向神经元分化的功能。 0010 本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用， 所述产品 至少具有促进脊髓损伤区功能性神经元和突触素产生的功能。 说 明 书

10、1/6 页 3 CN 108144120 A 3 0011 本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用， 所述产品 至少具有修复脊髓损伤的功能。 0012 进一步的， 在所述的应用中， 所述产品还包括外源性神经干细胞。 0013 本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料作为修复脊髓损伤材料的应用。 0014 本申请实施例还提供了一种双功能胶原支架材料的制备方法， 其包括： 0015 提供CBD-EGFR-Fab抗体， 其包含胶原结合区域以及与所述胶原结合区连接的EGFR 抗体的Fab区； 0016 使所述CBD-EGFR-Fab抗体与神经再生支架结合， 形成所述双功能胶原支

11、架材料。 0017 进一步的， 所述的制备方法包括： 将线性化的pPICZ B-CBD-Fab整合进重组毕赤酵 母克隆的基因组， 之后进行表达和纯化， 获得所述CBD-EGFR-Fab抗体。 0018 进一步的， 所述神经再生支架至少来源于生物肌肉筋膜。 0019 本申请的双功能胶原支架材料主要是通过将CBD-EGFR-Fab抗体吸附在神经再生 支架上而制备形成。 所述CBD-EGFR-Fab抗体是具有胶原结合区(CBD)的EGFR抗体， 它是通过 将一段CBD区融合于EGFR抗体的抗原结合片段(即Fab区)而形成。 其中表皮生长因子受体 (EGFR)是可以和表皮生长因子(EGF)结合的细胞表

12、面的受体， 可以在神经干细胞表面表达。 利用EGFR抗体和EGFR的高度亲和性可以使神经干细胞结合在支架材料上， 以及通过衰减 EGFR信号通路促进神经干细胞向神经元分化。 同时， EGFR抗体和EGFR的高度结合力会通过 阻断EGFR信号通路从而抑制肿瘤细胞的增殖。 同时， EGFR也参与了髓鞘相关抑制因子 (MAIs)调节的神经干细胞向胶质细胞分化的过程。 MAIs主要包括Nogo-A， 髓鞘相关糖蛋白 (MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)。 MAIs不仅有抑制轴突再生的特性， 也能阻碍神 经干细胞向神经元分化。 Nogo-A， MAG和OMgp可以结合共受体复合物p75/TR

13、OY和LINGO-1。 MAIs和受体的结合会通过升高细胞内钙离子浓度激活EGFR信号通路， 从而抑制轴突再生和 神经干细胞向神经元分化。 激活EGFR信号通路会抑制神经干细胞向神经元分化， 衰减EGFR 信号可能会促进神经干细胞向神经元分化。 所述CBD-EGFR-Fab抗体同时可以促进神经干细 胞和支架材料的结合以及促进其向神经元分化。 更具体的讲， 该CBD-EGFR-Fab抗体既能通 过与神经干细胞表面的EGFR结合从而结合神经干细胞， 也能通过CBD区使EGFR-Fab抗体和 胶原支架结合。 进而， 通过将CBD-EGFR-Fab抗体吸附于神经再生支架上， 即形成了本申请的 双功能胶

14、原支架材料。 在移植进脊髓损伤部位之后， 种植于双功能胶原支架材料上的神经 干细胞能通过结合CBD-EGFR从而停留于材料上， 并且由于EGFR抗体阻断EGFR信号通路， 神 经干细胞会向神经元分化。 0020 较之现有技术， 本申请提供的双功能胶原支架材料在体外可以促进外源性神经干 细胞结合以及挽救髓鞘蛋白存在时被抑制的神经干细胞向神经元的分化， 在体内可以有效 减少外源性神经干细胞从移植部位的扩散， 以及通过促进神经干细胞分化成功能性神经元 从而重建神经元回路， 最终促进脊髓损伤后运动功能恢复。 附图说明 0021 图1A是本申请一实施方案中一种空白对照支架材料(Scaffold)的功能示

15、意图， 当 被移植进脊髓损伤处， 种植于空白对照支架材料上的神经干细胞会扩散至周围组织， 且主 要分化成胶质细胞。 说 明 书 2/6 页 4 CN 108144120 A 4 0022 图1B是本申请一实施方案中一种双功能胶原支架材料(Dual Functional Scaffold)的功能示意图， 当被移植进脊髓损伤处， 种植于双功能胶原支架材料上的神经干 细胞会结合在材料上， 停留于损伤部位， 并主要分化成神经元。 0023 图2A1图2A2是本申请一实施例中一种神经再生支架的照片和电镜照片。 0024 图2A3是本申请一实施例中一种CBD-EGFR-Fab抗体的构建示意图。 0025

16、图2A4是本申请一实施例中一种CBD-EGFR-Fab抗体的SDS-PAGE检测图。 0026 图2B是本申请一实施例中从SD乳鼠的端脑分出神经干细胞， 分别种植于空白对照 支架材料和双功能胶原支架材料上， PBS缓冲液冲洗后， 镜下计数神经干细胞细胞数量的示 意图。 0027 图2C1是本申请一实施例中神经干细胞增殖培养7天后形成的神经球的照片。 0028 图2C2是本申请一实施例中神经球进行神经干细胞标志物Nestin染色的照片。 0029 图2C3是本申请一实施例中神经球进行EGFR染色的照片。 0030 图2D1是本申请一实施例中于空白对照支架材料上的神经干细胞免疫荧光染色照 片。 0

17、031 图2D2是本申请一实施例中于双功能胶原支架材料上的神经干细胞免疫荧光染色 照片。 0032 图2D3是本申请一实施例中神经干细胞计数图。 0033 图3A是本申请一实施例中将神经干细胞分别种植于空白对照支架材料、 双功能胶 原支架材料上， 分化培养基中加入髓鞘蛋白， 7天后进行免疫荧光染色的示意图。 0034 图3B是本申请一实施例中于空白对照支架材料、 双功能胶原支架材料上的神经元 标志物Tuj-1和星形胶质细胞标志物GFAP免疫荧光染色照片。 0035 图3C1图3C2是本申请一实施例中于双功能胶原支架材料、 空白对照支架材料上 的神经元和星形胶质细胞计数图。 0036 图4A是本

18、申请一实施例中从GFP转基因大鼠端脑中分出GFP-NSC， 将其分别与两种 材料一起移植进脊髓损伤部位， 12周后取材进行免疫荧光染色， 观察神经干细胞的富集、 分 化和形成的功能性神经元的示意图。 0037 图4B是本申请一实施例中绿色荧光蛋白GFP和星形细胞标志物GFAP染色图。 0038 图4C是本申请一实施例中绿色荧光蛋白GFP和神经元标志物NF染色图。 0039 图4D1图4D4是本申请一实施例中于损伤边缘和损伤区的结合的神经干细胞的 数量和分化成神经元的比例统计图。 0040 图5A是本申请一实施例中各组损伤区5-HT， ChAT和SYP的染色图。 0041 图5B1图5B3是本申

19、请一实施例中5-HT， ChAT和SYP阳性细胞计数图。 0042 图6A是本申请一实施例中术后12周， 各组大鼠运动诱发电位波形图。 0043 图6B是本申请一实施例中的潜伏期统计图。 0044 图6C是本申请一实施例中振幅差比值统计图。 0045 图6D是本申请一实施例中BBB评分图。 0046 图6E是本申请一实施例中斜板实验图。 具体实施方式 说 明 书 3/6 页 5 CN 108144120 A 5 0047 鉴于现有技术中的不足， 本申请发明人经长期研究和大量实践， 通过将具有胶原 特异性结合能力的CBD-EGFR-Fab抗体吸附于神经再生支架上， 制备出一种双功能胶原支架 材料

20、。 该双功能胶原支架材料可以联合外源性神经干细胞移植于大鼠脊髓全横断部位。 通 过体外和体内试验证明， 该双功能胶原支架材料可以结合外源性神经干细胞， 使其停留于 损伤区， 并促进其向神经元分化。 这对脊髓损伤后神经元回路的重建以及运动功能的恢复 都起到良好效果， 可以有效解决现有技术中移植神经干细胞治疗脊髓损伤时， 外源性神经 干细胞从移植部位扩散和低效率分化成神经元等问题， 0048 以下结合附图及典型实施案例对本申请的技术方案作进一步的详细说明。 0049 1、 神经再生支架的制备 0050 神经再生支架从牛肌肉筋膜中获取。 分离出约0.5毫米的筋膜， 切成适当体积。 尽 量去除内层黏附

21、的肌肉组织和外层的脂肪组织。 冻干， 即得到本申请的神经再生支架。 0051 2、 CBD-EGFR-Fab抗体的制备 0052 2.1 CBD-EGFR-Fab表达载体构建 0053 CBD-EGFR-Fab抗体Fab段的vL,cL,vH和cH1链参考US7060808； 由苏州金维智生物 科技有限公司合成。 首先,通过overlap PCR将CBD(TKKTLRT)+vL+cL和vH+cH1拼接成两条 链， 顺序如下:CBD+linker+vL+cL； vH+cH1。 接着， 用双酶切将两条链分别插入pPICZ -B (Invitrogen)和pPIC9K(Invitrogen)两个质粒中

22、。 连接后， 转化进大肠杆菌(DH5 ),涂布LB 平板， 挑菌落， PCR筛选阳性克隆， 测序后抽提质粒备用。 0054 2.2 CBD-EGFR-Fab表达载体的转化、 筛选 0055 按照Invitrogen操作手册中的电转化方法， 分别将10 g两种连接产物用Sal 和 Bstx 进行线性化， 再将线性化的产物电转化到对数生长期的酵母菌GS115基因中。 转化后， 将转化液涂布于YPDS琼脂平板上(1yeast extract， 2peptone， 2dextrose， 1M sorbitol， 2agar， 100 g/mL Zeocin， 1-4mg/mL G418)， 30培养1

23、-2周。 克隆长出后， 使用 L和H基因片段的特异引物， 鉴定L和H是否都整合到酵母菌基因组。 其中， L和H的特异性引物 分别为: 0056 L： 0057 F： CTCGAGAAAAGAACCAAGAAGACCTTACG 0058 R： GCGGCCGCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC； 0059 H： 0060 F： GAATTCCAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGG 0061 R： GCGGCCGCGTGAGTTTTGTCACAAG。 0062 再在含有Zeocin和G418抗生素的YPDS平板上生长,PCR鉴定阳性菌落标记为:Mut +。 0063 2.3 CBD

24、-EGFR-Fab在酵母菌中表达、 纯化 0064 挑取标记为Mut+的菌落， 用50mL BMGY培养基(1yeast extract， 2peptone， 100mM potassium phosphate pH 6.0， 1.34YNB， 410-5biotin， 1glycerol),于28- 30、 250-300rpm培养,至OD600约为2-6(约培养16-18h)时,室温,1500g,离心5min,收菌。 再 用BMMY培养基(BMGY加0.5methanol代替glycerol)重悬， 培养至OD600为1.0左右(约100- 200mL)时置于1L摇瓶中,28-30、 25

25、0-300rpm培养。 每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓 说 明 书 4/6 页 6 CN 108144120 A 6 度为0.5。 表达后菌液用8000g、 4高速离心20min,收集上清,0.22 m滤膜过滤,用 Millipore Pellicon分子量10kDa超滤膜浓缩到合适体积， 透析到20mM磷酸钠缓冲液(PH 8.0)和0.5M NaCl中。 用AKTA prime plus 5.0系统利用镍柱对目的蛋白进行纯化。 SDS- PAGE电泳分析纯化后抗体的纯度。 蛋白浓缩后0.22 m滤膜过滤除菌， 分装， -80冻存。 使用 BCA试剂盒(碧云天)对测定抗体浓度。 0065

26、 3、 双功能胶原支架材料的制备 0066 将40 g CBD-EGFR-Fab抗体滴加于前述的神经再生支架上， 组合成具有结合外源 性神经干细胞及促进其向神经元分化的双功能胶原支架材料。 0067 4、 神经干细胞分离培养 0068 取新生Sprague Dawley(SD)乳鼠的端脑， 去除脑膜， 剪碎， 0.25胰酶消化20 30min， 加入血清终止消化。 加入适量基础培养基， 吹打， 用70 m滤网过滤。 500g， 离心5min， 弃上清， 用适量神经干细胞增殖培养基重悬， 装T75细胞培养瓶， 37培养箱培养7天后备 用。 0069 5、 双功能材料在脊髓损伤动物模型中的治疗效果

27、的评价 0070 、 大鼠T8脊髓全横断损伤动物模型的建立 0071 SD大鼠购买自北京维通利华有限公司， 所有动物均使用180g220g的雌性大鼠， 所有动物均提前一周订购， 在新环境下饲养一周适应环境。 0072 10水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠， 沿中线剪开皮肤和筋膜， 暴露T8-T11节段棘突， 减掉棘突， 撬开椎板， 暴露脊髓。 在T8-9部位做4mm脊髓全横断。 动物实验分成3组， 只移植空 白对照支架材料(即前述神经再生支架)， 移植空白对照支架材料加106个神经干细胞以及 移植双功能胶原支架材料加106个神经干细胞。 0073 、 双功能胶原支架材料在体外促进神经干细胞与材料结合

28、0074 从SD乳鼠的端脑中分出神经干细胞， 并将其分别种植于空白对照支架材料和双功 能胶原支架材料上， PBS冲洗后， 镜下计数两种材料上剩余神经干细胞数量。 计数结果显示 双功能胶原支架材料上剩余的神经干细胞数量更多， 表明其对神经干细胞有更好的结合力 (参阅图2A1图2D3)。 0075 、 双功能胶原支架材料在体外促进神经干细胞向神经元分化 0076 将分离出的神经干细胞分别种植于空白对照支架材料和双功能胶原支架材料上， 在分化培养基中加入髓鞘蛋白， 在体外模拟体内脊髓损伤后局部形成的抑制性微环境， 分 化培养7天后， 进行神经元标志物Tuj-1和星形细胞标志物GFAP的免疫荧光染色。

29、 染色结果 显示， 有髓鞘蛋白时， 相比于种植在空白对照支架材料上的神经干细胞， 种植于双功能胶原 支架材料上的神经干细胞更多地向神经元分化， 更少地向星形胶质细胞分化。 实验结果表 明， 双功能胶原支架材料在体外可以挽救被抑制的神经干细胞向神经元的分化(参阅图3A 图3C)。 0077 、 双功能胶原支架材料在体内促进神经干细胞的富集和分化成神经元 0078 将空白对照支架材料和双功能胶原支架材料分别与106个神经干细胞移植进大鼠 T8脊髓损伤部位， 12周后取材， 进行免疫荧光染色， 观察损伤区神经干细胞的富集， 分化以 及产生的功能性神经元。 首先， 通过对绿色荧光蛋白标志物GFP和星形

30、胶质细胞标志物GFAP 进行共染， 观察损伤区星形胶质瘢痕的形成情况。 染色结果显示， 空白对照支架材料+神经 说 明 书 5/6 页 7 CN 108144120 A 7 干细胞联合治疗组中， 移植的神经干细胞主要迁移至周围组织， 且主要分化成星形胶质细 胞。 而双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组中， 可观察到在损伤区有部分移植神经 干细胞的富集， 且没有分化成星形胶质细胞。 其次， 通过对绿色荧光蛋白标志物GFP和神经 元特有的中间丝蛋白NF进行共染， 观察损伤区神经元的形成情况。 染色结果显示， 相比于空 白对照支架材料+神经干细胞联合治疗组， 双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治

31、疗组中 损伤区可观察到明显存在移植神经干细胞， 并且部分分化成神经元。 染色结果表明， 双功能 胶原支架材料对神经干细胞有一定结合作用并且可以阻止其分化成星形胶质细胞， 并促进 其向神经元分化(参阅图4A图4D4)。 0079 、 双功能胶原支架材料在脊髓损伤部位诱导功能性神经元的产生及突触的形成 0080 通过对运动相关神经递质5羟色胺(5-HT)， 乙酰胆碱能神经元(ChAT)和突触素 (SYP)的染色， 观察损伤区5羟色胺能阳性神经元， 乙酰胆碱能阳性神经元和突触素阳性神 经元的形成。 实验结果显示， 双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组中， 损伤区有5羟 色胺能阳性神经元， 乙酰胆

32、碱能阳性神经元和突触素阳性神经元的产生。 实验结果表明， 双 功能胶原支架材料能促进脊髓损伤区功能性神经元和突触素的产生(参阅图5A图5B3)。 0081 、 双功能胶原支架材料促进脊髓损伤后电生理和运动功能的恢复 0082 电生理结果显示， 各组大鼠术后12周都能检测出运动诱发电位(MEP)波形， 但相比 另外两组， 双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组的波形更接近于正常波形。 对各组 大鼠MEP潜伏期和振幅差的比值进行检测， 结果显示， 双功能胶原支架材料+神经干细胞联 合治疗组的潜伏期显著短于其余各组， 而振幅差的比值显著高于其余各组。 结果表明， 双功 能胶原支架材料+神经干细胞联

33、合治疗组大鼠电生理恢复优于另外两组。 0083 接着对各组大鼠进行行为学检测， 包括BBB评分和斜板实验， 通过观察各组大鼠术 后12周后肢肌力的恢复， 从而评价运动功能的恢复。 BBB评分结果显示， 前4周， 各组大鼠运 动功能恢复提高较快， 约从第7周开始， 各组大鼠恢复进入平台期。 但双功能胶原支架材料+ 神经干细胞联合治疗组的大鼠， 约一半的时间点BBB评分显著高于另外两组。 斜板实验结果 显示， 双功能胶原材料+神经干细胞联合治疗组的大鼠相比于另外两组大鼠， 可以在更大角 度的斜板上停留5s以上。 行为学评分结果表明， 双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗 组大鼠运动功能恢复显著优

34、于另外两组(参阅图6A图6E)。 0084 综合分析以上结果， 本发明制备的一种双功能胶原支架材料， 即一种连接有CBD- EGFR-Fab抗体的神经再生支架不仅具有结合外源性神经干细胞的能力， 同时能促进神经干 细胞分化成神经元。 进一步的动物试验结果表明， 双功能胶原支架材料在体内可以更好地 富集和结合移植的神经干细胞， 使其停留于损伤部位， 并且可以促进其向神经元分化。 0085 应当理解， 上述实施例仅为说明本申请的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此 项技术的人士能够了解本申请的内容并据以实施， 并不能以此限制本申请的保护范围。 凡 根据本申请精神实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖

35、在本申请的保护范围之内。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108144120 A 8 图1A 说 明 书 附 图 1/14 页 9 CN 108144120 A 9 图1B 图2A1图2A2 说 明 书 附 图 2/14 页 10 CN 108144120 A 10 图2A3 图2A4 图2B 图2C1 图2C2 说 明 书 附 图 3/14 页 11 CN 108144120 A 11 图2C3 图2D1 图2D2 图2D3 说 明 书 附 图 4/14 页 12 CN 108144120 A 12 图3A 图3B 说 明 书 附 图 5/14 页 13 CN 108144120 A 13

36、 图3C1 图3C2 图4A 说 明 书 附 图 6/14 页 14 CN 108144120 A 14 图4B 说 明 书 附 图 7/14 页 15 CN 108144120 A 15 图4C 图4D1 图4D2 图4D3 图4D4 说 明 书 附 图 8/14 页 16 CN 108144120 A 16 图5A 说 明 书 附 图 9/14 页 17 CN 108144120 A 17 图5B1 图5B2 图5B3 说 明 书 附 图 10/14 页 18 CN 108144120 A 18 图6A 说 明 书 附 图 11/14 页 19 CN 108144120 A 19 图6B 图6C 说 明 书 附 图 12/14 页 20 CN 108144120 A 20 图6D 说 明 书 附 图 13/14 页 21 CN 108144120 A 21 图6E 说 明 书 附 图 14/14 页 22 CN 108144120 A 22