一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610186564.8 (22)申请日 2016.03.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105815218 A (43)申请公布日 2016.08.03 (73)专利权人 西北大学 地址 710069 陕西省西安市太白北路229号 (72)发明人 郭斌 任岩岩 何美娜 何玮 傅艳萍 尉亚辉 (74)专利代理机构 西安恒泰知识产权代理事务 所 61216 代理人 孙雅静 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (56)对比文件 CN

2、 102754595 A,2012.10.31,全文. CN 102283129 A,2011.12.21,全文. 马华升等.千层塔组织培养中外植体消毒灭 菌研究初报. 杭州农业科技 .2008, (第3期), 15-18. B. GUO et al.Effects of hypobaric growth conditions on morphogenic potential and antioxidative enzyme activities in Saussurea involucrata. BIOLOGIA PLANTARUM .2011,第55卷(第4期), 783-787. 审查员

3、 王岩 (54)发明名称 一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种提高千层塔外植体表面 灭菌效率的方法， 该方法包括在低压环境中将千 层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌， 灭菌后的千层 塔外植体在低压环境中培养； 所述的低压环境是 指压力为4060kP。 通过低压和高温结合处理的 方式， 提高千层塔外植体表面的灭菌效率； 同时， 提高了千层塔外植体的存活率。 本发明操作简 单， 在不影响千层塔后期培养的前提下， 提高对 其的灭菌效率， 可用于千层塔的组织培养。 权利要求书1页 说明书5页 CN 105815218 B 2017.09.29 CN 105815218 B

4、 1.一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 其特征在于， 该方法包括在低压环境 中将千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌， 灭菌后的千层塔外植体在低压环境中培养； 所述的低压环境是指压力为4060KPa。 2.如权利要求1所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 其特征在于， 所述的千 层塔外植体指千层塔的根、 千层塔的茎或千层塔的叶。 3.如权利要求1或2所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 其特征在于， 千层 塔外植体采用灭菌剂进行灭菌包括： 取千层塔外植体依次经流水冲洗、 体积分数为75的 乙醇溶液浸泡、 体积分数为5的NaOCl溶液浸泡及体积分数为7的过氧化氢溶液浸泡， 千 层塔

5、外植体经NaOCl溶液和过氧化氢溶液浸泡时处于低压环境。 4.如权利要求3所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 其特征在于， 千层塔外 植体在NaOCl溶液中浸泡的低压环境时间为515min， 千层塔外植体在过氧化氢溶液中浸 泡的低压环境时间为510min。 5.如权利要求1或2所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 其特征在于， 将经 过灭菌剂灭菌处理的千层塔外植体转接到MS固体培养基上于低压环境中培养， 2周后取出 千层塔外植体转移到常压培养室继续培养。 6.如权利要求5所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 其特征在于， 低压环境 中培养的光照强度为2000Lux， 低压环

6、境中培养的光周期为16h； 在常压培养室中的培养的 温度为25。 7.如权利要求5所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 其特征在于， 在所述的 MS固体培养基中添加100200mg/L的两性霉素B。 8.如权利要求5所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 其特征在于， 所述的低 压环境中培养的培养温度为3040。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105815218 B 2 一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及种一种提高千层塔(Huperzia serrata (Thunb.)Trev.)外植体表面灭菌效率的方法。 背

7、景技术 0002 千层塔(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)为石松目(Lycopodiales)石杉科 (Lycopodiaceae)石杉属(Lycopodium L.)多年生草本蕨类植物。 千层塔始载于 植物名实 图考 ， 性味辛苦、 平。 具有散瘀消肿、 解毒和止痛的功效。 1927年我国科技工作者报道了从 该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用， 之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高 效、 低毒、 可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。 现在， 被石杉碱甲及经作为治疗阿尔茨 海默病(AD， Alzheimer disease)的药物， 同时在美国被用做益智的营养保

8、健品。 0003 但是， 千层塔自然资源严重短缺。 千层塔生长缓慢， 野生状态下千层塔的繁殖主要 以孢子繁殖为主， 孢子萌发周期长， 萌发后属地下生配子体， 需6-15年才能成熟。 因此极大 地限制了千层塔野生资源的再生。 千层塔中的石杉碱甲含量又很低(0.007)， 再加上其全 合成石杉碱甲步骤繁琐、 价格昂贵且有副作用。 目前， 石杉碱甲的提取主要依赖于野生资 源， 提取率仅为0.006-0.1， 因而大量的市场需求、 受限的自然资源和自身生长繁殖的 限制。 因此， 不论是石杉碱甲直接或者间接获得都是以千层塔的原植物为原料， 这种自然界 有限的资源将处于灭绝的边缘。 利用植物组织培养可进行

9、珍稀和濒危药用植物的微繁殖， 建立高效和稳定培养系， 培育出脱毒的优质品种， 解决珍稀濒危药用植物人工种植存在的 种子稀少、 种苗奇缺、 种质退化等严重问题， 为千层塔的资源再生和可持续利用提供技术手 段。 0004 但是， 千层塔组织培养过程主要采用的是叶片、 茎和根。 这些外植体存在外植体灭 菌困难、 无菌外植体获得率低， 而且灭菌后大部分死亡， 不能生长、 分化和增殖等问题。 因 此， 对于千层塔的组织培养， 外植体的灭菌至关重要。 发明内容 0005 本发明的目的在于， 提供一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 该方法能 够显著千层塔外植体表面的灭菌效率， 同时提高了千层塔外植体的

10、存活率。 0006 为了实现上述任务， 本发明采取如下的技术解决方案： 0007 一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 该方法包括在低压环境中将千层塔 外植体采用灭菌剂进行灭菌， 灭菌后的千层塔外植体在低压环境中培养。 0008 具体的， 所述的低压环境是指压力为4060KP。 0009 更具体的， 所述的千层塔外植体指千层塔的根、 千层塔的茎或千层塔的叶。 0010 进一步的， 千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌包括： 取千层塔外植体依次经流水 冲洗、 体积分数为75的乙醇溶液浸泡、 体积分数为5的NaOCl溶液浸泡及体积分数为7 的过氧化氢溶液浸泡， 千层塔外植体经NaOCl溶液和过氧化氢

11、溶液浸泡时处于低压环境。 说 明 书 1/5 页 3 CN 105815218 B 3 0011 具体的， 千层塔外植体在NaOCl溶液中浸泡的低压环境时间为515min， 千层塔外 植体在过氧化氢溶液中浸泡的低压环境时间为510min。 0012 另外， 将经过灭菌剂灭菌处理的千层塔外植体转接到MS固体培养基上于低压环境 中培养， 2周后取出千层塔外植体转移到常压培养室继续培养。 0013 还有， 低压环境中培养的光照强度为2000Lux， 低压环境中培养的光周期为16h； 在 常压培养室中的培养的温度为25。 0014 进一步的， 在所述的MS固体培养基中添加100200mg/L的两性霉素

12、B。 0015 优选的， 所述的低压环境中培养的培养温度为3040。 0016 本发明的优点为： 0017 (1)本发明通过低压结合温和的灭菌剂处理， 以及灭菌后的低压和高温培养， 不仅 提高了千层塔外植体的灭菌效率， 同时还提高了千层塔的移栽成活率， 可用于千层塔的组 织培养， 为千层塔的灭菌培养提供了新思路； 0018 (2)对千层塔外植体灭菌， 最好的方案是： 灭菌时， 5NaOCl浸泡时间为10分钟， 7过氧化氢浸泡时间为8分钟， 两种灭菌剂浸泡时的压力为50KP； 灭菌后前两周培养时， MS 固体培养基中含有的两性霉素B的浓度为150mg/L， 培养的压力为50KP， 培养的温度为3

13、5。 两周后进行正常的培养。 在这样的条件下， 千层塔的叶片除菌率和存活率分别达到60和 75； 千层塔的茎除菌率和存活率达到55和78； 千层塔的根除菌率和存活率分别达到 55和58。 具体实施方式 0019 千层塔在人工组织培养中遇到的最大的问题就是外植体污染严重。 如果灭菌时间 不够， 则灭菌效率极低； 如果灭菌时间过长， 则外植体成活率极低。 严重阻碍了千层塔组织 培养的成功。 本发明的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法， 通过低压结合温和的灭菌 剂处理， 以及灭菌后的低压和高温培养， 不仅提高了千层塔外植体的灭菌效率。 此方法可用 于千层塔的组织培养。 0020 一种提高千层塔外植体

14、表面灭菌效率的方法， 按以下步骤操作： 0021 步骤一， 千层塔外植体的灭菌： 0022 取千层塔外植体(根或者茎， 或者叶片)， 用流水冲洗干净， 用体积分数75乙醇溶 液浸泡1分钟， 倒掉乙醇， 然后用体积分数5NaOCl溶液浸泡并立即放置到4060kP的压力 容器中， 515分钟后取出， 倒掉NaOCl溶液， 换用体积分数7过氧化氢溶液浸泡， 立即放置 到压力容器的低压环境中。 放置510分钟后取出， 倒掉过氧化氢溶液， 用无菌水冲洗干净； 0023 步骤二， 千层塔外植体的培养： 0024 将灭过菌的千层塔外植体转接到含有100200mg/L两性霉素B的MS固体培养基 上， 并放置到

15、4060KP的压力容器中培养， 培养温度为3040， 2周后取出， 转移到培养室 培养。 在压力容器中和在培养室中的光照条件为： 光照强度为2000Lux， 光周期16小时。 在培 养室中的培养温度为25。 2周后统计外植体的除菌率和存活率。 0025 MS培养基组成： 1.65g/L的NH4NO3、 1.9g/L的KNO3、 0.17g/L的KH2PO4、 0.37g/L的 MgSO47H2O、 0.44g/L的CaCl22H2O、 0.83mg/L的KI、 6.2mg/L的H3BO3、 22.3mg/L的MnSO44H2O、 8.6mg/L的ZnSO47H2O、 0.25mg/L的Na2M

16、oO42H2O、 0.025mg/L的CuCl25H2O、 0.025mg/L的 说 明 书 2/5 页 4 CN 105815218 B 4 CoCl26H2O、 37.3mg/L的Na2EDTA、 27.8mg/L的FeSO47H2O。 0026 这里的各成分是按照每升液体计算的， MS是组织培养中比较常规的培养基， 固体 MS培养基， 在上述成分中添加琼脂粉； 0027 除菌率是指： 经过步骤一的方法外植体灭菌后， 再经过步骤二的方法培养2周后统 计出的没有染菌的外植体数目在总共外植体中所占的百分比。 0028 存活率是指： 经过步骤一的方法外植体灭菌后， 再经过步骤二的方法培养2周后统

17、 计出的仍然是绿色(绿色部分占外植体总体积的1/3以上)且没有染菌的外植体数目在总共 没有染菌的外植体中所占的百分比。 0029 实施例1(对照1)： 0030 1、 步骤一， 千层塔外植体的灭菌： 0031 取千层塔叶片， 用流水冲洗干净， 用体积分数为75的乙醇溶液浸泡1分钟， 倒掉 乙醇， 然后用体积分数为5的NaOCl溶液浸泡15分钟后取出， 倒掉NaOCl溶液， 换用体积分 数为7的过氧化氢溶液浸泡， 放置10分钟后取出， 倒掉过氧化氢溶液， 用无菌水冲洗干净； 0032 步骤二， 千层塔外植体的培养： 0033 将灭过菌的千层塔叶片转接到含有150mg/L两性霉素B的MS固体培养基

18、上， 然后放 于培养室中培养。 培培养条件为： 温度为25,光照强度2000Lux， 光周期16小时。 2周后统计 外植体的除菌率和存活率分别为26和43。 0034 实施例2(对照2)： 0035 将实施例1中外植体换成茎， 则除菌率和存活率分别为30和52。 0036 实施例3(对照3)： 0037 将实施例1中外植体换成根， 则除菌率和存活率分别为47和25。 0038 实施例4： 0039 步骤一， 千层塔外植体的灭菌： 0040 取千层塔叶片， 用流水冲洗干净， 用体积分数为75的乙醇溶液浸泡1分钟， 倒掉 乙醇， 然后用体积分数为5的NaOCl溶液浸泡并立即放置到40KP的压力容器

19、中， 5分钟后取 出， 倒掉NaOCl溶液， 换用体积分数7的过氧化氢溶液浸泡， 立即放置到压力容器的低压环 境中。 放置5分钟后取出， 倒掉过氧化氢溶液， 用无菌水冲洗干净； 0041 步骤二， 千层塔外植体的培养： 0042 将灭过菌的千层塔叶片转接到含有100mg/L两性霉素B的MS固体培养基上， 并放置 到40kP的压力容器中培养， 培养温度为30， 2周后取出， 转移到培养室培养。 在压力容器中 和在培养室中的光照条件为： 光照强度为2000Lux， 光周期16小时。 在培养室中的培养温度 为25。 2周后统计外植体的除菌率和存活率分别为42和73。 0043 实施例5： 0044

20、步骤一， 千层塔外植体的灭菌： 0045 取千层塔叶片， 用流水冲洗干净， 用体积分数为75的乙醇溶液浸泡1分钟， 倒掉 乙醇， 然后用体积分数为5的NaOCl溶液浸泡并立即放置到50KP的压力容器中， 10分钟后 取出， 倒掉NaOCl溶液， 换用体积分数为7的过氧化氢溶液浸泡， 立即放置到压力容器的低 压环境中。 放置8分钟后取出， 倒掉过氧化氢溶液， 用无菌水冲洗干净； 0046 步骤二， 千层塔外植体的培养： 说 明 书 3/5 页 5 CN 105815218 B 5 0047 将灭过菌的千层塔叶片转接到含有150mg/L两性霉素B的MS固体培养基上， 并放置 到50kP的压力容器中

21、培养， 培养温度为35， 2周后取出， 转移到培养室培养。 在压力容器中 和在培养室中的光照条件为： 光照强度为2000Lux， 光周期16小时。 在培养室中的培养温度 为25。 2周后统计外植体的除菌率和存活率分别为60和75。 0048 实施例6： 0049 步骤一， 千层塔外植体的灭菌： 0050 取千层塔叶片， 用流水冲洗干净， 用体积分数为75的乙醇溶液浸泡1分钟， 倒掉 乙醇， 然后用体积分数为5的NaOCl溶液浸泡并立即放置到50KP的压力容器中， 15分钟后 取出， 倒掉NaOCl溶液， 换用体积分数为7的过氧化氢溶液浸泡， 立即放置到压力容器的低 压环境中。 放置10分钟后取

22、出， 倒掉过氧化氢， 用无菌水冲洗干净； 0051 步骤二， 千层塔外植体的培养： 0052 将灭过菌的千层塔叶片转接到含有200mg/L两性霉素B的MS固体培养基上， 并放置 到60kP的压力容器中培养， 培养温度为40， 2周后取出， 转移到培养室培养。 在压力容器中 和在培养室中的光照条件为： 光照强度为2000Lux， 光周期16小时。 在培养室中的培养温度 为25。 2周后统计外植体的除菌率和存活率分别为49和52。 0053 实施例7： 0054 步骤一， 千层塔外植体的灭菌： 0055 取千层塔茎， 用流水冲洗干净， 用体积分数为75的乙醇溶液浸泡1分钟， 倒掉乙 醇， 然后用体

23、积分数为5的NaOCl溶液浸泡并立即放置到40kP的压力容器中， 5分钟后取 出， 倒掉NaOCl溶液， 换用体积分数为7过氧化氢溶液浸泡， 立即放置到压力容器的低压环 境中。 放置5分钟后取出， 倒掉过氧化氢， 用无菌水冲洗干净； 0056 步骤二， 千层塔外植体的培养： 0057 将灭过菌的千层塔茎转接到含有200mg/L两性霉素B的MS固体培养基上， 并放置到 60kP的压力容器中培养， 培养温度为30， 2周后取出， 转移到培养室培养。 在压力容器中和 在培养室中的光照条件为： 光照强度为2000Lux， 光周期16小时。 在培养室中的培养温度为 25。 2周后统计外植体的除菌率和存活

24、率分别为28和33。 0058 实施例8： 0059 将实施例5中外植体换成茎， 则除菌率和存活率分别为55和78。 0060 实施例9： 0061 步骤一， 千层塔外植体的灭菌： 0062 取千层塔茎， 用流水冲洗干净， 用体积分数为75的乙醇溶液浸泡1分钟， 倒掉乙 醇， 然后用体积分数为5的NaOCl溶液浸泡并立即放置到60KP的压力容器中， 15分钟后取 出， 倒掉NaOCl溶液， 换用体积分数为7的过氧化氢溶液浸泡， 立即放置到压力容器的低压 环境中。 放置10分钟后取出， 倒掉过氧化氢， 用无菌水冲洗干净； 0063 步骤二， 千层塔外植体的培养： 0064 将灭过菌的千层塔茎转接

25、到含有100mg/L两性霉素B的MS固体培养基上， 并放置到 40kP的压力容器中培养， 培养温度为40， 2周后取出， 转移到培养室培养。 在压力容器中和 在培养室中的光照条件为： 光照强度为2000Lux， 光周期16小时。 在培养室中的培养温度为 25。 2周后统计外植体的除菌率和存活率分别为50和45。 说 明 书 4/5 页 6 CN 105815218 B 6 0065 实施例10： 0066 步骤一， 千层塔外植体的灭菌： 0067 取千层塔根， 用流水冲洗干净， 用体积分数为75的乙醇溶液浸泡1分钟， 倒掉乙 醇， 然后用体积分数为5的NaOCl溶液浸泡并立即放置到60KP的压

26、力容器中， 5分钟后取 出， 倒掉NaOCl溶液， 换用体积分数为7的过氧化氢溶液浸泡， 立即放置到压力容器的低压 环境中。 放置10分钟后取出， 倒掉过氧化氢溶液， 用无菌水冲洗干净； 0068 步骤二， 千层塔外植体的培养： 0069 将灭过菌的千层塔根转接到含有100mg/L两性霉素B的MS固体培养基上， 并放置到 40kP的压力容器中培养， 培养温度为30， 2周后取出， 转移到培养室培养。 在压力容器中和 在培养室中的光照条件为： 光照强度为2000Lux， 光周期16小时。 在培养室中的培养温度为 25。 2周后统计外植体的除菌率和存活率分别为36和39。 0070 实施例11：

27、0071 将实施例5中外植体换成根， 则除菌率和存活率分别为55和58。 0072 实施例12： 0073 步骤一， 千层塔外植体的灭菌： 0074 取千层塔根， 用流水冲洗干净， 用体积分数为75的乙醇溶液浸泡1分钟， 倒掉乙 醇， 然后用体积分数为5的NaOCl溶液浸泡并立即放置到60KP的压力容器中， 10分钟后取 出， 倒掉NaOCl溶液， 换用体积分数为7的过氧化氢溶液浸泡， 立即放置到压力容器的低压 环境中。 放置10分钟后取出， 倒掉过氧化氢溶液， 用无菌水冲洗干净； 0075 步骤二， 千层塔外植体的培养： 0076 将灭过菌的千层塔根转接到含有200mg/L两性霉素B的MS固体培养基上， 并放置到 60KP的压力容器中培养， 培养温度为40， 2周后取出， 转移到培养室培养。 在压力容器中和 在培养室中的光照条件为： 光照强度为2000Lux， 光周期16小时。 在培养室中的培养温度为 25。 2周后统计外植体的除菌率和存活率分别为53和26。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105815218 B 7