一种适于分子生物学研究的室内高密度轮虫培养采收方法.pdf

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410334047.1 (22)申请日 2014.07.11 A01K 67/033(2006.01) (73)专利权人 江苏农牧科技职业学院 地址 225300 江苏省泰州市海陵区凤凰东路 8 号 (72)发明人 封琦 王建国 熊良伟 袁圣 朱云干 陶桂庆 王权 仇海霞 CN 102978196 A,2013.03.20, CN 103409497 A,2013.11.27, CN 102428896 A,2012.05.02, JP 2013153744 A,2013.08.15, (54) 发明名称 一种适于分子生物学研究的室

2、内高密度轮虫 培养采收方法 (57) 摘要 本发明公开了一种适于分子生物学研究的室 内高密度轮虫培养采收方法， 包括如下步骤 ： 将 处于指数期的轮虫培养液， 根据浮游植物与轮虫 的几何形态、 沉降系数差异， 以 3000r/min 的离心 频率， 离心 3-5min， 达到轮虫与藻液初步分离 ； 将 离心管架置于普通日光灯下方或自然光照条件下 静置 15min， 利用轮虫趋光性原理对轮虫进行光 诱导富集 ； 借鉴人工培养细胞收集方法， 采用孔 径 0.45m 的尼龙膜， 用真空过滤泵抽滤浓缩， 去 除培养液， 收集离心管上清液 ； 本发明对以往的 操作方法进行了改进， 方便快捷， 降低了采收

3、过程 中 RNA 和蛋白提取效率造成的影响， 减少了收集 过程中的机械刺激可能会对相关基因的表达水平 的影响。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 郑冬燕 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书2页 CN 104094901 B 2016.07.06 CN 104094901 B 1.一种适于分子生物学研究的室内高密度轮虫培养采收方法， 其特征在于， 包括如下 步骤： S1、 将处于指数期的轮虫培养液， 根据浮游植物与轮虫的几何形态、 沉降系数差异， 以 3000r/min的离心频率， 离心3-5min， 达到轮虫与藻液初步分离； S2、

4、将步骤S1所得的离心管架置于普通日光灯下方或自然光照条件下静置15min， 利用 轮虫趋光性原理对轮虫进行光诱导富集； S3、 借鉴人工培养细胞收集方法， 采用孔径0.45 m的尼龙膜， 将步骤S2所得的离心管， 用真空过滤泵抽滤浓缩， 去除培养液， 收集离心管上清液； S4、 取下滤膜， 转移到冰上， 采用细胞刮刀慢慢刮取转移至1.5ml离心管中， 冰冻保存或 直接提取RNA和蛋白。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104094901 B 2 一种适于分子生物学研究的室内高密度轮虫培养采收方法 技术领域 0001 本发明涉及生物培养领域， 具体涉及一种适于分子生物学研究的室内高密度

5、轮虫 培养采收方法。 背景技术 0002 轮虫作为一种重要的水产饵料生物和性别进化研究模式生物具有极高的理论研 究和生产应用价值， 但在由宏观种群水平研究向微观分子水平研究迈进的同时， 如何方便 快捷的批量获取大量纯化的轮虫成了实验室研究的首要问题， 以往的研究中绝大部分采用 人工显微镜检的方式进行手工操作， 既费时又费力， 国内仅杨家新等提出的一种轮虫总RNA 和总蛋白提取方法中不可避免的会带入培养基液体再加上轮虫本身的含水量， 会给后续的 RNA和蛋白提取效率造成影响， 此外收集过程中的机械刺激可能会对相关基因的表达水平 造成影响。 发明内容 0003 为解决上述问题， 本发明提供了一种适

6、于分子生物学研究的室内高密度轮虫培养 采收方法， 对以往的操作方法进行了改进， 既方便快捷又将上述弊端降到最低。 0004 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为： 0005 一种适于分子生物学研究的室内高密度轮虫培养采收方法， 包括如下步骤： 0006 S1、 将处于指数期的轮虫培养液， 根据浮游植物与轮虫的几何形态、 沉降系数差 异， 以3000r/min的离心频率， 离心3-5min， 达到轮虫与藻液初步分离； 0007 S2、 将步骤S1所得的离心管架置于普通日光灯下方或自然光照条件下静置15min， 利用轮虫趋光性原理对轮虫进行光诱导富集； 0008 S3、 借鉴人工培养细胞收集方

7、法， 采用孔径0.45 m的尼龙膜， 将步骤S2所得的离心 管， 用真空过滤泵抽滤浓缩， 去除培养液， 收集离心管上清液； 0009 S4、 取下滤膜， 转移到冰上， 采用细胞刮刀慢慢刮取转移至1.5ml离心管中， 冰冻保 存或直接提取RNA和蛋白。 0010 本发明对以往的操作方法进行了改进， ， 方便快捷， 降低了采收过程中RNA和蛋白 提取效率造成的影响， 减少了收集过程中的机械刺激可能会对相关基因的表达水平的影 响。 具体实施方式 0011 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白， 以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不

8、用于限定本发 明。 0012 实施例1 0013 一种适于分子生物学研究的室内高密度轮虫培养采收方法， 包括如下步骤： 说 明 书 1/2 页 3 CN 104094901 B 3 0014 S1、 取出指数增长期的轮虫培养液， 置入50ml透明离心管也可采用更大容量透明 离心杯操作， 采用低速大容量离心机3000r/min离心3-5min； 0015 S2、 取出离心管后在日光灯垂直光源下或自然光照条件下静置15min， 对光肉眼检 测轮虫密度， 如看到大量小白点在移动即可转移上清液； 0016 S3、 采用真空抽滤机进行抽滤， 滤膜采用0.45 m孔径尼龙膜， 直到肉眼观察到大量 轮虫在滤

9、膜上形成棕褐色沉淀； 0017 S4、 取下滤膜， 转移到冰上， 采用细胞刮刀慢慢刮取转移至1.5ml离心管中， 冰冻保 存或直接提取RNA和蛋白。 0018 实施例1 0019 采用目前传统的解剖镜下肉眼观察手工挑取工作方法固然可以达到很精确的分 离效果， 为达到足够量的轮虫来提取总RNA(至少需120只成体)和总蛋白(1000只左右)， 采 用上述方法至少需两名实验员连续不停操作半天至两天左右， 不仅耗费人力， 而且由于采 样时间偏差以及操作熟练程度不同均会对后续分子试验带来影响； 而采用本方法可在半小 时内过滤浓缩510L轮虫培养液， 采集100mg轮虫， 可以达到快速分离效果。 0020 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以作出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 2/2 页 4 CN 104094901 B 4