一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103954716 A (43)申请公布日 2014.07.30 CN 103954716 A (21)申请号 201410168109.6 (22)申请日 2014.04.24 G01N 30/88(2006.01) G01N 30/74(2006.01) (71)申请人 上海慈瑞医药科技有限公司 地址 200240 上海市闵行区剑川路 951 号 5 幢 2 层 203 室 (72)发明人 朱益锋 陆佳丽 (74)专利代理机构 上海申汇专利代理有限公司 31001 代理人 翁若莹 (54) 发明名称 一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法 (57) 摘要 本发明提

2、供了一种香菇多糖分子量及分子量 分布测定方法， 其特征在于， 具体步骤为 ： 将待检 测的香菇多糖加入氢氧化钠溶液溶解， 加入流动 相， 再加入盐酸溶液调节 pH 值， 过滤， 利用 GPC 系 统进行分离的同时使用示差折光检测器和激光光 散射检测器进行检测， 将激光光散射检测器检测 得到的分子量数据和示差折光检测器检测得到的 浓度数据通过 GPC 软件计算得出香菇多糖的分子 量及分子量分布。 本发明能够快速、 准确的获得香 菇多糖的分子量及分子量分布， 对提高该药品的 内在品质具有积极意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家

3、知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图8页 (10)申请公布号 CN 103954716 A CN 103954716 A 1/1 页 2 1. 一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法， 其特征在于， 具体步骤包括 ： 将待检 测的香菇多糖溶解后， 加入流动相， 调节 pH 值到 9-10， 过滤， 利用 GPC 系统进行分离的同时 使用示差折光检测器和激光光散射检测器进行检测， 将激光光散射检测器检测得到的分子 量数据和示差折光检测器检测得到的浓度数据通过 GPC 软件计算得出香菇多糖的分子量 及分子量分布。 2. 如权利要求 1 所述的香菇多糖分子量及分子量分布

4、测定方法， 其特征在于， 进行分 离和检测时， 采用的流动相为超纯水、 硼酸盐缓冲溶液、 硝酸钠溶液和氯化钠溶液中的至少 一种， 分析柱为 1-4 根分离范围为 2,000， 000 1000 道尔顿的尺寸排阻色谱柱， 柱温保持 在 20 -40， 流速为 0.3ml/min0.9ml/min。 3. 如权利要求 2 所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法， 其特征在于， 进行分 离和检测时， 采用的流动相为 pH 9.0 10.0 的 0.12M 硼酸盐缓冲液。 4. 如权利要求 2 所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法， 其特征在于， 进行分 离和检测时， 采用的分析柱为二根分离范围

5、为 2,000,000-100 道尔顿的不锈钢柱串联。 5. 如权利要求 2 所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法， 其特征在于， 进行分 离和检测时， 采用的柱温为 30。 6. 如权利要求 2 所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法， 其特征在于， 进行分 离和检测时， 采用的流速保持在 0.5ml/min。 7. 如权利要求 2 所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法， 其特征在于， 所述的 GPC 系统、 示差折光检测器和激光光散射检测器的仪器常数校正时采用的标准物质为 PEG， 验证仪器常数用的标准物质为 Dextran。 8. 如权利要求 1 所述的香菇多糖分子量及分子量分

6、布测定方法， 其特征在于， 所述的 GPC 软件为 omni Sec4.7 软件。 权 利 要 求 书 CN 103954716 A 2 1/9 页 3 一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法 技术领域 0001 本发明涉及一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法， 属于生物医药领域。 背景技术 0002 香菇多糖 (lentinan) 是从香菇中提取具有生物活性的葡聚多糖， 其由主链 -(1 3) 糖苷键， 并由 -(1 6) 连接的葡萄糖基沿主链随机分布呈束状分支结构。香 菇多糖对多种肿瘤有抑制作用， 特别是对消化道类的肿瘤有显著的抑制作用， 其具有剂量 低， 疗效好， 毒副作用小等优点。

7、0003 香菇多糖的分子量及分子量分布与临床抗肿瘤活性有着密切的关系。经研究发 现， 影响多糖生物活性具有多种因素如 ： 分子组成、 链接方式、 立体构型、 糖链的分支程度等 等。其中， 分子量的大小是多糖具备生物活性的必要条件。香菇多糖的重均分子量在 40 80 万道尔顿时， 表现出最强的生物活性， 此时香菇多糖抑制肿瘤、 提高人体免疫的疗效最 佳。重均分子量小于 2 万道尔顿基本上就没有生物活性， 对抑制肿瘤的治疗无作用 ； 然而， 重均分子量大于 200 300 万道尔顿时， 由于分子量大影响到了香菇多糖的正常溶解 ( 香 菇多糖的溶解度是随着分子量的变化而变化的， 分子量小的易溶解、

8、分子量大的难溶解 )， 其生物活性明显下降， 更重要的是这么大分子量的香菇多糖静脉注入人体血管内， 容易诱 发血栓， 副作用增大。 因此， 研究香菇多糖分子量的测定方法对控制香菇多糖内在质量具有 重要意义。 0004 目前， 测定高聚物多糖分子量的方法所采用的标准物质往往与被测物质的化学结 构不相同， 再有标准物质分子量范围能否全覆盖被测样品分子量范围等问题。由此建立的 为相对标准曲线， 所测结果为相对分子量。 受到上述条件的影响， 所测的结果与物质的实际 分子量有较大的误差。因此， 需要建立一种适合工业生产的香菇多糖分子量极其分布的测 定方法。 GPC-LAS联用技术兼具了GPC法和激光光散

9、射法的特点， 不需要采用标准物质做出 标准曲线而直接快速、 准确的测得香菇多糖的重均分子量及分子量分布。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种不需要采用标准物质做出标准曲线而直接快速、 准确的 测得香菇多糖的重均分子量及分子量分布的方法。 0006 为了达到上述目的， 本发明提供了一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法， 其特征在于， 具体步骤包括 ： 将待检测的香菇多糖溶解后， 加入流动相， 调节 pH 值到 9-10， 过滤， 利用 GPC 系统进行分离的同时使用示差折光检测器和激光光散射检测器进行检测， 将激光光散射检测器检测得到的分子量数据和示差折光检测器检测得到的浓度数据通过

10、GPC 软件计算得出香菇多糖的分子量及分子量分布。 0007 优选地， 进行分离和检测时， 采用的流动相为超纯水、 硼酸盐缓冲溶液、 硝酸钠溶 液和氯化钠溶液中的至少一种， 分析柱为 1-4 根分离范围为 2,000， 000 1000 道尔顿的尺 寸排阻色谱柱， 柱温保持在 20 -40， 流速为 0.3ml/min0.9ml/min。 说 明 书 CN 103954716 A 3 2/9 页 4 0008 更优选地， 进行分离和检测时， 采用的流动相为 pH 9.0 10.0 的 0.12M 硼酸盐 缓冲液。 0009 更优选地， 进行分离和检测时， 采用的分析柱为二根分离范围为2,000

11、,0001000 道尔顿的不锈钢柱串联。 0010 更优选地， 进行分离和检测时， 采用的柱温为 30。 0011 更优选地， 进行分离和检测时， 采用的流速保持在 0.5ml/min。 0012 更优选地， 所述的 GPC 系统、 示差折光检测器和激光光散射检测器的仪器常数校 正时采用的标准物质为 PEG， 验证仪器常数用的标准物质为 Dextran。 0013 优选地， 所述的 GPC 软件为 Omni Sec4.7 软件。 0014 本发明中采用的香菇多糖的分子量、 分子式、 化学结构式如下 ： 0015 1、 分子量测定 0016 利用示差折光检测仪与激光光散射仪相连接 (GPCLAS

12、) 的方法来测定香菇多糖 天然大分子高聚物分子量及其分布。测定分子量分布范围大多在 1-200 万之间。 0017 2、 分子式 0018 经微量元素分析结果表明， 分子式为 (C6H10O5） n 0019 3、 化学结构式 0020 经高碘酸氧化及 Smith 降解等化学反应结合光谱分析法， 测定香菇多糖的一级结 构式如图 1 所示， 0021 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 0022 本发明利用示差折光检测仪与光散射检测仪相连接 (GPC-LAS 法 ) 测定香菇多糖 分子量及其分布， 激光光散射检测器提供分子量的直接测量 ( 无需校准曲线 ) ； 使用示差折 光检测器采集测定

13、浓度， 双检测器采集的信息通过 GPC 软件计算出分子量及其分布信息。 本发明能够快速、 准确的获得香菇多糖的分子量及分子量分布， 对提高该药品的内在品质 具有积极意义。 0023 本发明发现香菇多糖在水中几乎不溶解， 但溶解于 2 wt 氢氧化钠溶液中。香菇 多糖分离用 GPC 柱为亲水性球型高聚物为填充剂， 该物质的 pH 耐受范围为 4 12， 通常在 中性条件下使用。本发明在实验中发现香菇多糖在氢氧化钠溶液溶解后调节 pH 至中性后， 其溶液稳定性差， 不利于分离测定。然而 pH 在 9 10 时溶液稳定分离效果佳。 附图说明 0024 图 1 为香菇多糖的一级结构式图。 0025 图

14、 2 为柱温 20时的 GPC-LAS 图谱 ； 0026 图 3 为柱温 25时的 GPC-LAS 图谱 ； 0027 图 4 为柱温 30时的 GPC-LAS 图谱 ； 0028 图 5 为柱温 40时的 GPC-LAS 图谱 ； 0029 图 6 为流速 0.3ml/min 时的 GPC-LAS 图谱 ； 0030 图 7 为流速 0.4ml/min 时的 GPC-LAS 图谱 ； 0031 图 8 为流速 0.5ml/min 时的 GPC-LAS 图谱 ； 0032 图 9 为流速 0.6ml/min 时的 GPC-LAS 图谱 ； 说 明 书 CN 103954716 A 4 3/9

15、 页 5 0033 图 10 为 0.7ml/min 时的 GPC-LAS 图谱 ； 0034 图 11 为流速 0.8ml/min 时的 GPC-LAS 图谱 ； 0035 图 12 为流速 0.9ml/min 时的 GPC-LAS 图谱 ； 0036 图 13 为进样量 50l 的 GPC-LAS 的图谱 ； 0037 图 14 为进样量 100l 的 GPC-LAS 的图谱 ； 0038 图 15 为进样量 150l 的 GPC-LAS 的图谱 ； 0039 图 16 为进样量 200l 的 GPC-LAS 的图谱。 具体实施方式 0040 下面结合实施例来进一步说明本发明。本发明所述的

16、香菇多糖采用公开号为 CN101161112、 专利号为 ZL200610116956.3 的中国专利 一种香菇多糖分离纯化的方法 实 施例中记载的方法分离纯化而得。检测所用的对照品 PEG、 Dextran、 Pulul lan 均由西格玛 奥德里奇公司生产。 0041 实施例 1 0042 (1) 仪器 ： 高效凝胶渗透色谱仪为英国马尔文公司生产的 OMINI 工作站系统， SHIMADZU RID-10A示差折光检测器， 日本岛津公司生产 ； SHIMADZU LC-20AD泵， 日本岛津公 司生产 ； SIL-10AF 自动进样器， 日本岛津公司生产 ； 270DUAL 激光光散射检测

17、器， 英国马尔 文公司生产 ； VE7510GPC 脱气机， 英国马尔文公司生产。其他具有上述配件及功能的高效液 相色谱仪器亦可。 0043 (2) 色谱条件 ： 0044 色谱柱 ： 色谱柱为 TSK-GEL G5000PWXL凝胶柱， 日本 TOSOH 公司生产 ； 0045 流动相 ： 以 0.12M pH 为 9.6 的硼酸盐缓冲溶液为流动相。 0046 流速 ： 0.5ml/min。 0047 进样量 ： 100l。 0048 精密称取待检测的香菇多糖供试品25mg， 置于25ml容量瓶中， 精密量取0.5mol/L 氢氧化钠溶液 4.0ml 加入容量瓶， 溶胀并振摇溶液 40min

18、， 使溶解 ； 加流动相 15ml， 摇匀， 精 密量取 0.5mol/L 的盐酸溶液 4.0ml 加入容量瓶使 pH 调节么 9， 再加流动相至容量瓶刻度， 摇匀， 过 0.22um 尼龙滤膜滤， 即得供试品溶液。 0049 吸取供试品溶液 100L， 注入液相色谱仪， 利用 GPC 系统进行分离的同时使用示 差折光检测器和激光光散射检测器进行检测， omni Sec4.7 软件工作站采集示差折光检测 器和激光光散射检测器信号， 并处理得到图谱。 0050 先后检测得到柱温为 20， 25， 30， 40时的 GPC 图谱， 如图 2-5 所示， 其中图 形以 30较好。 0051 实施例

19、2 0052 (1) 仪器 ： 高效凝胶渗透色谱仪为英国马尔文公司生产的 OMINI 工作站系统， SHIMADZU RID10A 示差折光检测器， 日本岛津公司生产 ； SHIMADZU LC-20AD 泵， 日本岛津 公司生产 ； SIL-10AF 自动进样器， 日本岛津公司生产 ； 270DUAL 激光光散射检测器， 英国马 尔文公司生产 ； VE7510GPC 脱气机， 英国马尔文公司生产。其他具有上述配件及功能的高效 液相色谱仪器亦可。 说 明 书 CN 103954716 A 5 4/9 页 6 0053 (2) 色谱条件 ： 0054 色谱柱 ： 色谱柱为 TSK-GEL G50

20、00PWXL凝胶柱， 日本 TOSOH 公司生产 ； 0055 流动相 ： 以 0.12M pH 为 9.6 的硼酸盐缓冲溶液为流动相。 0056 柱温 ： 30。 0057 进样量 ： 100l。 0058 精密称取待检测的香菇多糖供试品 25mg， 置于 25ml 容量瓶中， 精密量取 0.5mol/ L 氢氧化钠溶液 4.0ml 加入容量瓶， 溶胀并振摇溶液 40min， 使溶解 ； 加流动相 15ml， 摇匀， 精密量取 0.5mol/L 的盐酸溶液 4.0ml 加入容量瓶使 pH 调节到 10， 再加流动相至容量瓶刻 度， 摇匀， 过 0.22um 尼龙滤膜滤， 即得供试品溶液。 0

21、059 吸取供试品溶液 100L， 注入液相色谱仪， 利用 GPC 系统进行分离的同时使用示 差折光检测器和激光光散射检测器进行检测， omni Sec4.7 软件工作站采集示差折光检测 器和激光光散射检测器信号， 并处理得到图谱。 0060 先后检测得到流速为 0.3ml/min， 0.4ml/min， 0.5ml/min， 0.6ml/min， 0.7ml/min， 0.8ml/min， 0.9ml/min 时的 GPC 图谱， 如图 6-10 所示， 图形以 0.5ml/min 为优。 0061 实施例 3 0062 (1) 仪器 ： 高效凝胶渗透色谱仪为英国马尔文公司生产的 OMINI

22、 工作站系统， SHIMADZU RID-10A示差折光检测器， 日本岛津公司生产 ； SHIMADZU LC-20AD泵， 日本岛津公 司生产 ； SIL10AF 自动进样器， 日本岛津公司生产 ； 270DUAL 激光光散射检测器， 英国马尔 文公司生产 ； VE7510GPC 脱气机， 英国马尔文公司生产。其他具有上述配件及功能的高效液 相色谱仪器亦可。 0063 (2) 色谱条件 ： 0064 色谱柱 ： 色谱柱为 TSKGEL G5000PWXL凝胶柱， 日本 TOSOH 公司生产 ； 0065 流动相 ： 以 0.12M pH 为 9.6 的硼酸盐缓冲溶液为流动相。 0066 流速

23、 ： 0.5ml/min。 0067 柱温 ： 30。 0068 精密称取待检测的香菇多糖供试品25mg， 置于25ml容量瓶中， 精密量取0.5mol/L 氢氧化钠溶液 4.0ml 加入容量瓶， 溶胀并振摇溶液 40min， 使溶解 ； 加流动相 15ml， 摇匀， 精 密量取 0.5mol/L 的盐酸溶液 4.0ml 加入容量瓶使 pH 调节到 9.5， 再加流动相至容量瓶刻 度， 摇匀， 过 0.22um 尼龙滤膜滤， 即得供试品溶液。 0069 吸取供试品溶液 100L， 注入液相色谱仪， 利用 GPC 系统进行分离的同时使用示 差折光检测器和激光光散射检测器进行检测， omni Se

24、c4.7 软件工作站采集示差折光检测 器和激光光散射检测器信号， 并处理得到图谱。 0070 先后检测得到进样量为 50L、 100Cl、 150l、 200l 的 GPC 的图谱， 如图 1316 所示， 图形以 0.5ml/min 为优。 0071 实施例 4 0072 (1) 仪器 ： 高效凝胶渗透色谱仪为英国马尔文公司生产的 OMINI 工作站系统， SHIMADZU RID-10A示差折光检测器， 日本岛津公司生产 ； SHIMADZU LC-20AD泵， 日本岛津公 司生产 ； SIL-10AF 自动进样器， 日本岛津公司生产 ； 270DUAL 激光光散射检测器， 英国马尔 文公

25、司生产 ； VE7510GPC 脱气机， 英国马尔文公司生产。其他具有上述配件及功能的高效液 说 明 书 CN 103954716 A 6 5/9 页 7 相色谱仪器亦可。 0073 (2) 色谱条件 ： 0074 色谱柱 ： 选用二根分离范围为2， 000， 0001000道尔顿的不锈钢尺寸排阻色谱柱 串联， 所述的色谱柱为 TSKGEL G5000PWXL凝胶柱， 日本 TOSOH 公司生产 ； 0075 流动相 ： 以 0.12M pH 为 9.6 的硼酸盐缓冲溶液为流动相。 0076 柱温 ： 30 ； 0077 流速 ： 0.5ml/min。 0078 进样量 ： 100l。 007

26、9 (3) 实验步骤 ： 0080 步骤 a ： 精密称取 N 知分子量的 PEG(Mw22K)20mg 加流动相稀释， 并搅拌 45min， 使 其溶解制成浓度为 5mg/ml 的 PEG 溶液， 另取 Dextran(Mw670K)， 同法制成浓度为 5mg/ml 的 Dextran 溶液。 0081 步骤 b ： 取 PEG 溶液 100l， 注入液相色谱仪， 记录色谱图由英国马尔文公司生产 的 Omni Sec4.7 软件处理计算。用 PEG 溶液获得的数据校正仪器并建立方法， 取 Dextran 溶液100l， 注入液相色谱仪， 再用Dextran的数据结果复核PEG溶液数据校正仪器

27、的准确 性， 其结果应在 670k5.0。 0082 步骤 c ： 精密称取待检测的香菇多糖供试品 25mg， 置于 25ml 容量瓶中， 精密量 取 0.5mol/L 氢氧化钠溶液 4.0ml 加入容量瓶， 溶胀并振摇溶液 40min， 使溶解 ； 加流动相 15ml， 摇匀， 精密量取0.5mol/L的盐酸溶液4.0ml加入容量瓶使pH调节到9.7， 再加流动相 至容量瓶刻度， 摇匀， 过 0.22um 尼龙滤膜滤， 即得供试品溶液。 0083 步骤d ： 吸取供试品溶液100L， 注入液相色谱仪， 加入到GPC系统中， 利用GPC系 统进行分离的同时使用示差折光检测器和激光光散射检测器进

28、行检测， 将激光光散射检测 器检测得到的分子量数据和示差折光检测器检测得到的浓度数据通过omni Sec4.7软件计 算得出香菇多糖的分子量及分子量分布 ； 为考察 GPC-LAS 系统的重现性， 将一批香菇多糖 重复进样 5 次。其结果见表 1。 0084 表 11# 批香菇多糖重复 5 次的 GPCLAS 结果比较 0085 0086 实施例 5 0087 (1) 仪器 ： 高效凝胶渗透色谱仪为英国马尔文公司生产的 OMINI 工作站系统， SHIMADZU RID10A 示差折光检测器， 日本岛津公司生产 ； SHIMADZU LC-20AD 泵， 日本岛津 公司生产 ； SIL10AF

29、 自动进样器， 日本岛津公司生产 ； 270DUAL 激光光散射检测器， 英国马 尔文公司生产 ； VE7510GPC 脱气机， 英国马尔文公司生产。其他具有上述配件及功能的高效 液相色谱仪器亦可。 0088 (2) 色谱条件 ： 说 明 书 CN 103954716 A 7 6/9 页 8 0089 色谱柱 ： 选用 TSKGEL G5000PWLX 和 TSK-GEL G4000PWLX 凝胶柱串联 ； 0090 流动相 ： 0.12M pH 为 9.6 的硼酸盐缓冲溶液为流动相。 0091 柱温 ： 30 ； 0092 流速 ： 0.5ml/min。 0093 进样量 ： 100l。 0

30、094 (3) 实验步骤 ： 0095 步骤 a ： 精密称取已知分子量的 PEG(Mw22K)20mg 加流动相稀释， 并搅拌 45min， 使 其溶解制成浓度为 5mg/ml 的 PEG 溶液， 另取 Dextran(Mw670K)， 同法制成浓度为 5mg/ml 的 Dextran 溶液。 0096 步骤 b ： 取 PEG 溶液 100l， 注入液相色谱仪， 记录色谱图由英国马尔文公司生产 的 Omni Sec4.7 软件处理计算。用 PEG 溶液获得的数据校正仪器并建立方法， 取 Dextran 溶液100l， 注入液相色谱仪， 再用Dextran的数据结果复核PEG溶液数据校正仪器

31、的准确 性， 其结果应在 670k10.0。 0097 步骤 c ： 精密称取待检测的香菇多糖供试品 25mg， 置于 25ml 容量瓶中， 精密量 取 0.5mol/L 氢氧化钠溶液 4.0ml 加入容量瓶， 溶胀并振摇溶液 40min， 使溶解 ； 加流动相 15ml， 摇匀， 精密量取0.5mol/L的盐酸溶液4.0ml加入容量瓶使pH调节到9.3， 再加流动相 至容量瓶刻度， 摇匀， 过 0.22um 尼龙滤膜滤， 即得供试品溶液。 0098 步骤d ： 吸取供试品溶液100L， 注入液相色谱仪， 加入到GPC系统中， 利用GPC系 统进行分离的同时使用示差折光检测器和激光光散射检测器

32、进行检测， 将激光光散射检测 器检测得到的分子量数据和示差折光检测器检测得到的浓度数据通过(omni Sec4.7)软件 计算得出香菇多糖的分子量及分子量分布 ； 测定三份不同批次 ( 批号 ) 香菇多糖的 GPC LAS 图谱， 数据见表 2。 0099 表 2 ： 0100 0101 实施例 6 0102 几种分子量测定方法比较如下 ： 0103 一、 本发明方法 (6PC-LAS 法 ) ： 0104 仪器和色谱条件与实施例 2 相同， 检测步骤如下 ： 0105 步骤 a ： 精密称取已知分子量的 PEG(Mw22K)20mg 加流动相稀释， 并搅拌 45min， 使 其溶解制成浓度为

33、 5mg/ml 的 PEG 溶液， 另取 Dextran(Mw670K)， 同法制成浓度为 5mg/ml 的 Dextran 溶液。 0106 步骤 b ： 取 PEG 溶液 100l， 注入液相色谱仪， 记录色谱图由英国马尔文公司生产 的 Omni Sec4.7 软件处理计算。用 PEG 溶液获得的数据校正仪器并建立方法， 取 Dextran 溶液100l， 注入液相色谱仪， 再用Dextran的数据结果复核PEG溶液数据校正仪器的准确 说 明 书 CN 103954716 A 8 7/9 页 9 性， 其结果应在 670k5.0。 0107 步骤 c ： 精密称取待检测的香菇多糖供试品 2

34、5mg， 置于 25ml 容量瓶中， 精密量 取 0.5mol/L 氢氧化钠溶液 4.0ml 加入容量瓶， 溶胀并振摇溶液 40min， 使溶解 ； 加流动相 15ml， 摇匀， 精密量取0.5mol/L的盐酸溶液4.0ml加入容量瓶使pH调节到9.8， 再加流动相 至容量瓶刻度， 摇匀， 过 0.22um 尼龙滤膜滤， 即得供试品溶液。 0108 步骤d ： 吸取供试品溶液100L， 注入液相色谱仪， 加入到GPC系统中， 利用GPC系 统进行分离的同时使用示差折光检测器和激光光散射检测器进行检测， 将激光光散射检测 器检测得到的分子量数据和示差折光检测器检测得到的浓度数据通过omni Se

35、c4.7软件计 算得出香菇多糖的分子量及分子量分布 ； 测定结果见表 3 ； 0109 二、 传统GPC方法采用RID10A示差折光检测器 ： 取重均分子量(Mw)分别为1.2、 5.0、 27.0、 41.0、 67.0、 110.0 万道尔顿的 Dextran 各 10mg 加流动相溶解， 得到浓度为 1mg/ ml 的溶液， 分别注入 GPC 系统， 色谱条件与本发明方法相同， 数据处理绘制成分子量标准曲 线。精密称定重均分子量 (Mw) 为 41.0 万道尔顿的 Dextran 和重均分子量 (Mw) 为 110.0 万道尔顿的 Dextran 各 10mg 分别加流动相溶解， 得到浓

36、度为 1mg/ml 的 Dextran 溶液， 精密 称定重均分子量 (Mw) 为 39.3 万道尔顿和重均分子量 (Mw) 为 80.5 万道尔顿的 GPC 标准样 品 Pulullan 各 10mg， 分别加流动相溶解， 得到浓度为 1mg/ml 的 Pulullan 溶液， 将批号 1# 的香菇多糖样品作为香菇多糖供试品， 精密称取待检测的香菇多糖供试品 25mg， 置于 25ml 容量瓶中， 精密量取 0.5mol/L 氢氧化钠溶液 4.0ml 加入容量瓶， 溶胀并振摇溶液 40min， 使 溶解 ； 加流动相 15ml， 摇匀， 精密量取 0.5mol/L 的盐酸溶液 4.0ml 加

37、入容量瓶， 再加流动相 至容量瓶刻度， 摇匀， 过 0.22um 尼龙滤膜滤， 即得供试品溶液。将不同分子量的 Dextran 溶 液， 不同分子量的 Pulullan 溶液， 以及香菇多糖溶液分别进行检测， 测定结果见表 3 ； 0110 三、 传统 GPC 方法采用 RID-10A 示差折光检测器 ： 取重均分子量 (Mw) 分别为 1.0、 4.88、 21.0、 39.3、 80.5 万道尔顿的 GPC 标准样品 Pulullan 各 10mg 加流动相溶解， 得到浓 度为1mg/ml的溶液， 分别注入GPC系统， 色谱条件与本发明方法相同， 数据处理绘制成分子 量标准曲线。精密称定重

38、均分子量 (Mw) 为 41.0 万道尔顿的 Dextran 和重均分子量 (Mw) 为 110.0 万道尔顿的 Dextran 各 10mg 分别加流动相溶解， 得到浓度为 1mg/ml 的 Dextran 溶液， 精密称定重均分子量 (Mw) 为 39.3 万道尔顿和重均分子量 (Mw) 为 80.5 万道尔顿的 GPC 标准样品 Pulullan 各 10mg， 分别加流动相溶解， 得到浓度为 1mg/ml 的 Pulullan 溶液， 将批号1#的香菇多糖样品作为供试品， 精密称取待检测的香菇多糖供试品25mg， 置于25ml 容量瓶中， 精密量取 0.5mol/L 氢氧化钠溶液 4.

39、0ml 加入容量瓶， 溶胀并振摇溶液 40min， 使 溶解 ； 加流动相 15ml， 摇匀， 精密量取 0.5mol/L 的盐酸溶液 4.0ml 加入容量瓶， 再加流动相 至容量瓶刻度， 摇匀， 过 0.22um 尼龙滤膜滤， 即得供试品溶液。将不同分子量的 Dextran 溶 液， 不同分子量的 Pulullan 溶液， 以及香菇多糖溶液分别进行检测， 0111 测定结果见表 3 ； 0112 表 3 0113 说 明 书 CN 103954716 A 9 8/9 页 10 0114 0115 根据上述结果可以看出 ： 本发明 GPCLAS 法测定出的标准样品数值与其报告标 定数值误差 5

40、.0， 满足 GPC 方法对分析检测精度的要求 ； 传统 GPC 方法 (Dextran 校正 曲线 ) 在测定与自身相同的 Dextran 样品时， 其测定数值与其报告标定数值误差 5.0， 精度较高， 但在测定 Pulullan 标准样品时结果与标准样品标定值误差大于 17 ； 传统 GPC 方法 (Pulullan 校正曲线 ) 存在同样的情况 ： 在测定与自身相同的 Pulullan 样品时， 其测 定数值与其报告标定数值误差 5.0， 精度较高， 但在测定 Dextran 标准样品时结果与标 准样品标定值误差 25 ： 0116 这些测定结果的偏差是由于这些不同的多糖对照样品与测定样

41、品之间结构差异 所造成的。高分子多糖均有较长的主链或侧链构成。由于对照品与样品的结果不同， 造成 的了在相同的色谱条件下， 其在溶液中的主链或侧链舒展状态差异较大。同等分子量的情 况下， 由于溶液中舒展状态的不同造成了体积的不同。根据 GPC 分离原理 - 尺寸排阻， 即 样品溶液进入色谱柱后根据分子体积大小， 分子量大物质的先分离流出， 分子量小的后分 离流出。分子量的大小确定是根据标准样品的保留时间或体积 ( 分离时分子先后流出的时 间或体积 ) 绘制成得分子量标准曲线与检测样品来对比保留时间或体积来计算。Pulullan 与 Dextran 两种多糖， 在标定分子量相同的情况下， 由于在

42、溶液中的分子舒展状态差异， 造 成了体积的差异， 继而在分离时产生了流出时间或体积的不同， 从而造成测定结果较大的 说 明 书 CN 103954716 A 10 9/9 页 11 差异。再有， 高分子多糖均来源于自然界， 上未有化学合成品， 其每一批产品均会有不同程 度的微小差异， 这也是批间检测结果差异较大的原因。 0117 再有， 上述的传统 GPC 方法 (Pulullan 校正曲线 ) 在测定样品 Dextran Mw110.0 万道尔顿时， 其自身的标准曲线覆盖范围最大为 Mw80.5 万道尔顿。其已经超出了绘制的分 子量标准曲线的范围， 此时得到的结果仅仅是 GPC 软件根据现有

43、的这根标准曲线趋势推导 的结果， 误差之大是在情理之中的。 0118 总之， 从上述的测定结果可以发现本发明的检测方法， 克服了传统 GPC 的这些缺 点， 测定结果准确可靠。香菇多糖在没有香菇多糖标准品做对照品的时候， 本发明能快速、 准确地测定其分子量。 说 明 书 CN 103954716 A 11 1/8 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103954716 A 12 2/8 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103954716 A 13 3/8 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103954716 A 14 4/8 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103954716 A 15 5/8 页 16 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103954716 A 16 6/8 页 17 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 103954716 A 17 7/8 页 18 图 13 图 14 说 明 书 附 图 CN 103954716 A 18 8/8 页 19 图 15 图 16 说 明 书 附 图 CN 103954716 A 19