用于合成醋酸格拉替雷的质谱内标的多肽.pdf

1、10申请公布号CN104098655A43申请公布日20141015CN104098655A21申请号201310120693322申请日20130409C07K14/00200601G01N30/0220060171申请人深圳翰宇药业股份有限公司地址518057广东省深圳市南山区高新技术工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层72发明人李国弢唐洋明覃亮政韦畅勇马亚平袁建成74专利代理机构北京北翔知识产权代理有限公司11285代理人张广育姜建成54发明名称用于合成醋酸格拉替雷的质谱内标的多肽57摘要本发明涉及用于合成醋酸格拉替雷（又称共聚物1）的质谱内标的多肽，其制备方法和用途。51INTCL权利

2、要求书2页说明书12页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书12页附图2页10申请公布号CN104098655ACN104098655A1/2页21一种用于醋酸格拉替雷合成的内标品，包括选自以下的37条多肽TV35PRAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEBNKTFAAAKTFAKTFAAYKTFAKTFAEBNAKTFAAKTFAAAEBNAAAKTFAEBNAAYEBNANET2TV45PRAKTFAKTFAYAKTFAKTFAAKTFAAEBNKTFAAKTFAKTFAAYKTFAAAEBNAKTFAKTFAAAKTFAYEBNKTFAAAAEBN

3、KTFAAAAKTFAEBNAAYEBNANET2TV56PRAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEBNKTFAAYAKTFAKTFAAEBNKTFAAAKTFAKTFAAEBNAKTFAAYKTFAAAEBNAKTFAKTFAKTFAAEBNAKTFAYKTFAAEBNAAKTFAAAAKTFAEBNAAYEBNANET2TV66PRAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEBNKTFAAYAKTFAAKTFAKTFAAEBNAKTFAAAKTFAKTFAAKTFAAEBNAKTFAKTFAYAKTFAAAKTFAAEBNKTFAKTFAEBNYAAAEBNAKTFAYKTFAAEBNAAK

4、TFAAAAKTFAEBNAAYEBNANET2TV77PRAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEBNKTFAAYAKTFAKTFAAEBNKTFAAAKTFAKTFAAEBNAKTFAAYKTFAAAEBNAKTFAKTFAKTFAAKTFAAEBNAKTFAKTFAYAKTFAAAKTFAAEBNKTFAKTFAEBNYAAAEBNAKTFAYKTFAAEBNAAKTFAAAAKTFAEBNAAYEBNANET2TV86PRAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEBNKTFAAYAKTFAKTFAAEBNKTFAAAKTFAKTFAAEBNAKTFAAYKTFAAAEBNAKTFAKTF

5、AKTFAAKTFAAEBNAKTFAKTFAYAKTFAAAKTFAAEBNKTFAKTFAEBNYAAAEBNAKTFAYKTFAAEBNAAKTFAKTFAAYKTFAAEBNAAKTFAAAAKTFAEBNAAYEBNANET2和TV109PRAKTFAKTFAYAKTFAKTFAAEBNKTFAAYAKTFAKTFAAKTFAAAKTFAEBNKTFAKTFAAYAKTFAKTFAEBNAKTFAAYKTFAAAEBNAKTFAKTFAKTFAAKTFAAEBNAKTFAKTFAYAKTFAEBNAAKTFAAKTFAKTFAEBNAYKTFAAEBNAKTFAKTFAYAKTFAA

6、AKTFAAEBNKTFAKTFAEBNYAAAEBNAKTFAKTFAAEBNAAKTFAAYKTFAAEBNAAKTFAAAAKTFAEBNAAYEBNANET2其中TFA表示三氟乙酰基，BN表示苄基，NET2表示碳端是N,N二乙基酰胺。2一种用于醋酸格拉替雷合成的内标品，包括选自以下的37条多肽TV35TFAAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEKTFAAAKTFAKTFAAYKTFAKTFAEAKTFAAKTFAAAEAAAKTFAEAAYEAOHTV45TFAAKTFAKTFAYAKTFAKTFAAKTFAAEKTFAAKTFAKTFAAYKTFAAAEAKTFAKTFAAAKTF

7、AYEKTFAAAAEKTFA权利要求书CN104098655A2/2页3AAAKTFAEAAYEAOHTV56TFAAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEKTFAAYAKTFAKTFAAEKTFAAAKTFAKTFAAEAKTFAAYKTFAAAEAKTFAKTFAKTFAAEAKTFAYKTFAAEAAKTFAAAAKTFAEAAYEAOHTV66TFAAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEKTFAAYAKTFAAKTFAKTFAAEAKTFAAAKTFAKTFAAKTFAAEAKTFAKTFAYAKTFAAAKTFAAEKTFAKTFAEYAAAEAKTFAYKTFAAEAAKTFA

8、AAAKTFAEAAYEAOHTV77TFAAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEKTFAAYAKTFAKTFAAEKTFAAAKTFAKTFAAEAKTFAAYKTFAAAEAKTFAKTFAKTFAAKTFAAEAKTFAKTFAYAKTFAAAKTFAAEKTFAKTFAEYAAAEAKTFAYKTFAAEAAKTFAAAAKTFAEAAYEAOHTV86TFAAKTFAKTFAYAKTFAKTFAEKTFAAYAKTFAKTFAAEKTFAAAKTFAKTFAAEAKTFAAYKTFAAAEAKTFAKTFAKTFAAKTFAAEAKTFAKTFAYAKTFAAAKTFAAEKTFA

9、KTFAEYAAAEAKTFAYKTFAAEAAKTFAKTFAAYKTFAAEAAKTFAAAAKTFAEAAYEAOH和TV109TFAAKTFAKTFAYAKTFAKTFAAEKTFAAYAKTFAKTFAAKTFAAAKTFAEKTFAKTFAAYAKTFAKTFAEAKTFAAYKTFAAAEAKTFAKTFAKTFAAKTFAAEAKTFAKTFAYAKTFAEAAKTFAAKTFAKTFAEAYKTFAAEAKTFAKTFAYAKTFAAAKTFAAEKTFAKTFAEYAAAEAKTFAKTFAAEAAKTFAAYKTFAAEAAKTFAAAAKTFAEAAYEAOH。3权利要

10、求1所述的内标品，其中所述多肽全部由L氨基酸组成或全部由D氨基酸组成。4权利要求2所述的内标品，其中所述多肽全部由L氨基酸组成或全部由D氨基酸组成组成。5权利要求1或3所述的内标品用作在醋酸格拉替雷合成过程中测量保护的醋酸格拉替雷的平均分子量和分子量分布的内标的用途。6权利要求2或4所述的内标品用作在醋酸格拉替雷合成过程中测量三氟乙酰基醋酸格拉替雷的平均分子量和分子量分布的内标的用途。7一种用于在醋酸格拉替雷合成过程测量保护的醋酸格拉替雷的平均分子量和分子量分布的方法，其中使用权利要求1或3所述的内标品作为内标。8一种用于在醋酸格拉替雷合成过程测量三氟乙酰基醋酸格拉替雷的平均分子量和分子量分布

11、的方法，其中使用权利要求2或4所述的内标品作为内标。9权利要求5或6所述的用途，其中所述分子量是使用柱色谱法测定的。10权利要求7所述的方法，其中所述分子量是使用柱色谱法测定的。权利要求书CN104098655A1/12页4用于合成醋酸格拉替雷的质谱内标的多肽技术领域0001本发明涉及用于合成醋酸格拉替雷（又称共聚物1）的质谱内标的多肽，其制备方法和用途。具体而言，本发明涉及用于在醋酸格拉替雷合成过程中，作为中间体分子量测定的内标的多肽，其制备方法和用途。背景技术0002自身免疫类疾病是指，生物机体的免疫系统将一些机体本身的组织当作“外来物”进行攻击的现象。通常这种疾病可以通过阻碍生物机体T细

12、胞和B细胞对机体自身组织的反应，得到缓解。这些早期的免疫反应是通过抗原结合到主要组织相容性抗原复合物（MHC）分子上促进的，并通过T细胞表达出来。自身免疫类疾病就是机体本身的组织和蛋白质被当作“自抗原”，被机体免疫系统攻击。例如多发性硬化症，就是免疫系统攻击隔离和保护神经的髓鞘的疾病。这种疾病发展到失去髓鞘，就会带来神经元和运动神经功能丧失。0003很多药物开发出来用于治疗自身免疫类疾病，包括多发性硬化症。醋酸格拉替雷是一个由丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸组成的多肽的混合物。它的氨基酸摩尔比大约是03920462012901530300037400860100，平均分子量大约50009000道

13、尔顿。US5800808中描述了共聚物1和其三元共聚物（丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸中任意三种组成的多肽的混合物）的平均分子量最佳范围和合成工艺。0004最早，TEITELBAUM等在EURJIMMUN,1,242,1971中描述了合成共聚物1的方法是由溶于1,4二氧六环的L丙氨酸的N羧酸酐、L酪氨酸的N羧酸酐、谷氨酸苄酯的N羧酸酐和三氟乙酰基赖氨酸的N羧酸酐制备保护的醋酸格拉替雷（保护的共聚物1）。然后用33溴化氢的乙酸溶液除去谷氨酸残基上的苄基保护基，同时部分的切断多肽的肽链，得到三氟乙酰基醋酸格拉替雷（三氟乙酰基共聚物1）。然后用哌啶水溶液除去赖氨酸残基上的三氟乙酰基保护基，得到粗共聚

14、物1。最后，经过透析，将溶液冻干，即得到共聚物1原料药。0005为了能够确保得到的共聚物1或三元共聚物具有药效，就必须准确的知道多肽混合物在合成过程中的平均分子量分布和变化。已有常规方法可以得到共聚物1的平均分子量，但是就整个工艺的过程控制而言，这类方法不适合。因为保护的共聚物和三氟乙酰基共聚物都不溶于水，而共聚物1易溶于水，常规方法也是在水体系中测量共聚物1的平均分子量。而且通常用于测定分子量的柱色谱法还会因待测产物的结构、组成等不同而存在一定误差。0006因此，本领域中仍然需要更加准确地在共聚物1合成过程中测量中间体的分子量，尤其是保护的共聚物和三氟乙酰基共聚物的分子量，正确得到共聚物1合

15、成过程中平均分子量和分子量分布变化的规律，从而加强对共聚物1合成过程中的中间体质量控制。发明内容0007本发明就是为了在合成共聚物1的过程中，加强工艺控制，找到保护的共聚说明书CN104098655A2/12页5物1、三氟乙酰基共聚物1和共聚物1的分子量之间的关系和变化规律。所以，准确的测量保护的共聚物和三氟乙酰基共聚物的平均分子量和分子量分布就尤为重要了。本发明中利用了两个系列的合成多肽的作为内标，确定了色谱柱的校正系数，得到了比较准确的分子量，为找到保护的共聚物、三氟乙酰基共聚物和共聚物1的分子量之间的关系和变化规律提供了可靠的数据支持。0008在一个实施方案中，本发明提供了一种用于醋酸格

16、拉替雷合成的内标品1，包括选自以下的37条多肽0009表1内标肽系列（其中TFA表示三氟乙酰基，BN表示苄基，NET2表示碳端是N,N二乙基酰胺）00100011说明书CN104098655A3/12页60012在一个实施方案中，本发明提供了一种用于醋酸格拉替雷合成的内标品2，包括选自以下的37条多肽0013表2内标肽系列二（其中TFA表示三氟乙酰基）说明书CN104098655A4/12页700140015在一个实施方案中，所述内标肽全部由L氨基酸组成。0016在一个实施方案中，所述内标肽全部由D氨基酸组成。0017在一个实施方案中，本发明提供了所述内标品1用作在共聚物1合成过程中测量保护的

17、共聚物1的平均分子量和分子量分布的内标的用途。说明书CN104098655A5/12页80018在一个实施方案中，本发明提供了所述内标品2用作在共聚物1合成过程中测量三氟乙酰基共聚物1的平均分子量和分子量分布的内标的用途。0019在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在共聚物1合成过程测量保护的共聚物1的平均分子量和分子量分布的方法，其中使用前述的内标品1作为内标。0020在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在共聚物1合成过程测量三氟乙酰基共聚物1的平均分子量和分子量分布的方法，其中使用前述的内标品2作为内标。0021在一个实施方案中，所述分子量是使用柱色谱法测定的。附图说明0022图1内标

18、品1的分子量的对数与保留时间线性图（横轴是RT,纵轴是分子量的对数）0023图2内标品1分子量的对数与相对保留时间线性图（横轴是分子量的对数,纵轴是RRT）0024图3内标品2分子量的对数与保留时间线性图（横轴是RT,纵轴是分子量的对数）0025图4内标品2分子量的对数与相对保留时间线性图（横轴是分子量的对数,纵轴是RRT）具体实施方式0026实施例1内标品1的内标肽的固相合成0027七条分子量从540017000道尔顿的分子量内标肽由深圳翰宇药业股份有限公司客户肽服务部合成（见表3和4）。这些内标肽编号为TVPR，其中为氨基酸残基数目（例如TV35PR就是含有35个氨基酸残基的肽链）。氨基酸

19、的组成与共聚物1的特征值相符，即丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸组成的氨基酸摩尔比为03920462012901530300037400860100，平均分子量大约50009000道尔顿。0028TV35PR合成方法采用替代度05MMOL/G2CTC树脂20G，放入固相反应柱，DMF溶胀30分钟，抽掉DMF；称取FMOCALAOH62G，用30MLDMF溶解，加入69MLDIPEA活化3分钟，加入反应柱，反应2小时，加入50ML20哌啶/DMF溶液，脱除FMOC保护基，DMF洗涤6次，茚三酮检测有颜色。0029称取FMOCGLU（BN）OH93G、HOBT297G,用30MLDMF溶解，加入34

20、MLDIC活化3分钟，加入反应柱，反应2小时，茚三酮检测无色透明。按照TV35PR肽序，逐个偶联，得到TV35PR肽树脂648G，得到的肽树脂采用三氟乙醇二氯甲烷14（VV）650ML裂解3小时，过滤掉树脂，加入乙醚沉淀，离心，干燥得到TV35PR去氨保护肽441G。0030将得到的全保护肽44G加入到2L烧瓶中，用200ML四氢呋喃溶解，加入200ML20二乙胺四氢呋喃溶液，反应5小时，浓缩，HPLC纯化得到TV35PR。0031其他几个内标采用同样的方法。0032表3内标肽的肽序及分子量0033说明书CN104098655A6/12页90034说明书CN104098655A7/12页100

21、035说明书CN104098655A108/12页110036说明书CN104098655A119/12页120037表4作用内标品1的各内标肽氨基酸组成00380039实施例2使用内标品1校正色谱柱0040采用TSKGELHHR（783000MM，5M）以N,N二甲基甲酰胺为流动相，流速说明书CN104098655A1210/12页1305ML/MIN，波长275NM，进样浓度为10MG/ML，进样量为20UL，进行内标这七个内标肽的校正。这些内标肽与保护的共聚物的保留时间与其对应分子量的对数呈一定的相关性。其公式为0041LOGMWABRT或者MW10（ABRT）0042其中MW为分子量，

22、RT为保留时间，A和B分别为截距和斜率。为了更准确的计算各组分的分子量，我们采用了丙酮作为内标的相对保留时间进行计算，其中丙酮的保留时间为398分钟。0043表5内标品1的色谱柱校正结果（图1、2）00440045RRTRT/RT丙酮；0046用公式LOGMWABRT计算结果；0047用公式RRTB1B2LOGMW计算结果；0048实施例3内标品2的内标肽的固相合成0049七条分子量从490015400道尔顿的分子量内标肽由深圳翰宇药业股份有限公司客户肽服务部合成（见表3和5）。这些内标肽编号为TVTFA，其中为氨基酸残基数目（例如TV35TFA就是含有35个氨基酸残基的肽链）。氨基酸的组成与

23、共聚物1的特征值相符。0050TV35TFA合成方法采用替代度05MMOL/G2CTC树脂20G，放入固相反应柱，DMF溶胀30分钟，抽掉DMF；称取FMOCALAOH62G，用30MLDMF溶解，加入69MLDIPEA活化说明书CN104098655A1311/12页143分钟，加入反应柱，反应2小时，加入50ML20哌啶/DMF溶液，脱除FMOC保护基，DMF洗涤6次，茚三酮检测有颜色。0051称取FMOCGLU（BN）OH93G、HOBT297G,用30MLDMF溶解，加入34MLDIC活化3分钟，加入反应柱，反应2小时，茚三酮检测无色透明。按照TV35TFA肽序，逐个偶联，得到TV35

24、TFA肽树脂648G，得到的肽树脂采用三氟乙醇二氯甲烷14（VV）650ML裂解3小时，过滤掉树脂，加入乙醚沉淀，离心，干燥得到TV35TFA去氨保护肽441G。0052其他几个内标采用同样的方法。0053表6用作内标品2的各内标肽氨基酸组成00540055实施例4使用内标品2校正色谱柱0056采用TSKGELHHR（783000MM，5M），以N,N二甲基甲酰胺为流动相，流速05ML/MIN，波长275NM，进样浓度为10MG/ML，进样量为20UL，进行内标这七个内标肽的校正。这些内标肽与保护的共聚物的保留时间与其对应分子量的对数呈一定的相关性。其公式为0057LOGMWABRT或者MW10（ABRT）0058其中MW为分子量，RT为保留时间，A和B分别为截距和斜率。为了更准确的计算各组分的分子量，我们采用了丙酮作为内标的相对保留时间进行计算。0059表7内标品2的色谱柱校正结果（图3、4）0060说明书CN104098655A1412/12页150061RRTRT/RT丙酮；0062用公式LOGMWABRT计算结果；0063用公式RRTB1B2LOGMW计算结果。说明书CN104098655A151/2页16图1图2说明书附图CN104098655A162/2页17图3图4说明书附图CN104098655A17