一种对人类白血球抗原基因位点进行以测序为基础的分型系统及方法.pdf

1、10申请公布号CN104102855A43申请公布日20141015CN104102855A21申请号201310116383422申请日20130403G06F19/20201101C12Q1/6820060171申请人德必碁生物科技（厦门）有限公司地址361028福建省厦门市海沧区翁角西路2004号三号楼第四层之一72发明人许明聪吴崇楷74专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人孙皓晨54发明名称一种对人类白血球抗原基因位点进行以测序为基础的分型系统及方法57摘要本发明公开了一种对人类白血球抗原基因位点（HLALOCUS）进行以测序为基础的分型（SBT）系统，其包含

2、A用于根据一实验的设定方案而进行PCR和测序的自动化移液装置；及B用于产生该实验的设定方案的电脑装置，其通过包含以下步骤的方法产生该实验的设定方案I接收一个体于该HLA基因位点的初步分型结果；II根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及III以解开最多的步骤II所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图1页10申请公布号CN104102855ACN104102855A1/1页21一种用于对人类白血球抗原基因位点（HLA基因位点）进行以测序为基础

3、的分型（SBT）系统测序，其包含A用于根据一实验的设计方案进行PCR和测序的自动化移液装置；及B用于产生该实验的设计方案的电脑装置，其通过包含以下步骤的方法产生该实验的设计方案I接收一个体于该HLA基因位点的初步分型结果；II根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及III以解开最多的步骤II所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。2根据权利要求1的系统，其中该电脑装置选自于由电脑系统、桌上型电脑、笔记型电脑及可携式计算装置所组成的群组。3根据权利要求1的系统，其中该初步分型结果为一低分辨度至中分辨度的HLA型别。4根据权利要求1的系统，其中该步骤II包含以下步骤

4、1根据已知的HLA等位基因型，并列所有等位基因组合的序列；2比对任两组等位基因组合的联合碱基对序列；及3若该两组等位基因组合具有相同的联合碱基序列，则决定该两组等位基因组合为一不确定性组合。5一种用于对人类白血球抗原基因位点（HLA基因位点）进行以测序为基础的分型测序方法，其包含A提供来自一个体的受测样本和该个体于该HLA基因位点的初步分型结果；及B通过一方法以决定用于该受测样本的PCRSBT的一或多个引物，该方法包括以下步骤A根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及B以解开最多的步骤A所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。6根据权利要求5的方法，其中该初步分

5、型结果通过一血清学方法或一以DNA为基础的方法获得。7根据权利要求6的方法，其中该以DNA为基础的方法选自于由SSOP、RSSOP、SSP及SBT所组成的群组。8根据权利要求5的方法，其中该初步分型结果为一低分辨度至中分辨度的HLA型别。9根据权利要求5的方法，其中该步骤A包含以下步骤1根据已知的HLA等位基因型，并列所有等位基因组合的序列；2比对任两组等位基因组合的联合碱基对序列；及3若该两组等位基因组合具有相同的联合碱基序列，则决定该两组等位基因组合为一不确定性组合。权利要求书CN104102855A1/7页3一种对人类白血球抗原基因位点进行以测序为基础的分型系统及方法技术领域0001本发

6、明涉及人类白血球抗原（HLA）测序分型（SBT）的方法，本发明还涉及用于HLA测序分型的系统。背景技术0002人类白血球抗原（HLA）系统即人类的主要组织相容性复合体（MHC）。主要的HLA抗原对于免疫功能不可或缺。任何表现“非自体”HLA抗原的细胞，人体的免疫系统会视之为入侵者而导致带有这些细胞的组织被人体排斥，由于此种情况将造成移植的排斥反应，因此在涉及组织移植的情况下尤显重要。基于HLA在移植上的重要性，目前常通过血清学检验及PCR来进行HLA基因位点的分型。0003MHC的各基因位点是哺乳类动物中遗传变异性最高的基因位点之一，而人类的HLA基因位点也不例外。目前有两种HLA的命名系统第

7、一种也是最早的命名系统，是基于血清（抗体）的辩识系统，在此系统中，白血球抗原最后以字母或数字命名（例如，HLAB27）；另外也发展出一种可以更精确定义各等位基因型（ALLELES）的命名系统，在此系统中，以“HLA”与“”及四码或更多码的数字连接，作为某一HLA基因位点的特定等位基因型的命名（例如，HLAB0812及HLAA2401）。0004基因测序可提供最可靠和准确的基因DNA序列资讯，因此，在决定HLA的基因多态性的完整内容和复杂度上特别重要。过去数年，HLA基因的以测序为基础的分型（SEQUENCINGBASEDTYPINGSBT）有明显的进展，使得HLA分型的PCRSBT于常规应用得

8、以实现。然而，如果分型的结果具有不确定性时，那么使用现有的PCRSBT方法及系统（例如，PROTRANS公司所提供的软体及EPPENDORF公司所提供的自动化移液装置）即无法主动和自动地解开这些不确定性，而操作者就必须进一步再通过使用其他供应商的系统来检测样本以获得答案。因此，目前仍需要更佳的PCRSBT方法或系统来解决该问题。发明内容0005因此，在一方面，本发明提供一种对人类白血球抗原基因位点（HLALOCUS）进行以测序为基础的分型（SBT）方法，其包含A提供来自一个体的受测样本和该个体于该人类白血球抗原基因位点的初步分型结果；及B通过一方法以决定用于该受测样本的PCRSBT的一或多个引

9、物，该方法包括以下步骤A根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及B以解开最多的步骤A所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。0006该初步分型结果可通过血清学方法或以DNA为基础的方法（例如，SSOP、RSSOP、SSP及SBT）取得。0007另一方面，本发明提供一种对人类白血球抗原基因位点（HLALOCUS）进行以测序为基础的分型（SBT）系统，其包含A用于根据一实验的设定方案进行PCR和测序的自动说明书CN104102855A2/7页4化移液装置；及B用于产生该实验的设定方案的电脑装置，其通过包含以下步骤的方法产生该实验的设定方案I接收一个体于该人类白血球抗

10、原基因位点的初步分型结果；II根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及III以解开最多步骤II所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。0008无须进一步的阐述，相信本发明所属领域的技术人员基于前述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，可以理解以下的说明仅仅是作为例示说明之用，而非以任何方式限制其余的揭露内容。附图说明0009图1是先前技术中典型的HLA的PCRSBT系统的流程图。0010图2是根据本发明的一具体实施例的HLA测序分型的系统所绘制的流程图。具体实施方式0011除非另有指明，所有在此处使用的技术性和科学性术语具有如同本发明所属技术领域的技术人员一般所

11、了解的意义。0012本文所使用的“一”一词，如未特别指明，是指至少一个（一个或一个以上）的数量。0013本文所使用的“个体（ASUBJECT）一词”，是指接受HLA分型的动物，较佳为哺乳动物，更佳为人。0014在一方面，本发明提供一种对人类白血球抗原（HLA）基因位点进行以测序为基础的分型（SEQUENCINGBASEDTYPING,SBT）方法，其包含A提供来自一个体的受测样本和该个体于该人类白血球抗原基因位点的初步分型结果；及B通过一方法以决定用于该受测样本的PCRSBT的一或多个引物，该方法包括以下步骤A根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及B以解开最多的步

12、骤A所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。0015HLA是人类染色体中最具多态性的基因之一，而已知的HLA等位基因型的总数从1999年4月到2012年4月增加了8倍。根据安东尼诺兰研究所（ANTHONYNOLANINSTITUTE）（与欧洲生物资讯研究所合作）的线上公共资料库（HTTP/WWWEBIACUK/IMGT/HLA/STATSHTML），目前世界上已知有8,496个HLA等位基因型。为了解决因为不断增加的HLA等位基因型而造成的测序不确定性，目前供应商通过增加用于解开等位基因型不确定性的“群组特定的测序引物”（GROUPSPECIFICSEQUENCINGPRIMERS；GSS

13、P）或“群组特定的扩增引物”（GROUPSPECIFICAMPLIFICATIONPRIMERS；GSA）的数目来解决这个问题。0016本发明的方法是利用欲分型的HLA的一初步分型结果，在进行PCRSBT之前，计算所有可能的不确定性组合，以主动和自动解决该不确定性，简化使用者操作上的程序并减少获得分型结果的时间。另外，本发明以计算所有可能的不确定性组合为前提，选择一或多个引物执行PCRSBT，相较于使用目前供应商提供的方法，可降低实验材料不必要的浪费。0017该初步分型结果提供该HLA基因位点的初步（或粗略）HLA型别。根据本发明，该初步分型结果提供低分辨度至中分辨度的HLA型别（例如，A02

14、为一低分辨度的HLA型别，A020102为一中分辨度的HLA型别），该初步分型的结果可通过一血清学方法或一以DNA说明书CN104102855A3/7页5为基础的方法（DNABASEDMETHOD）获得。0018在本发明的特定具体实施例中，该初步分型结果是通过选自于由序列特异的寡核苷酸探针法（SEQUENCESPECIFICOLIGONUCLEOTIDEPROBE；SSOP）、反向序列特异的寡核苷酸探针法（REVERSESEQUENCESPECIFICOLIGONUCLEOTIDEPROBE；RSSOP）、序列特异的引物法（SEQUENCESPECIFICPRIMER；SSP）及测序分型法（S

15、EQUENCINGBASEDTYPING；SBT）的一以DNA为基础的方法而获得。0019本文所使用的“不确定性组合”（AMBIGUITYCOMBINATION）是指两组或两组以上等位基因组合在基因测序后发现其联合碱基序列相同而具有不确定性（AMBIGUITY），因此，无法确定受测样本在欲测序的基因位点的确切等位基因序列组合。0020本文所使用的“联合碱基序列”（COMBINEDBASEPAIRSEQUENCE）是以单一碱基序列来表示一组等位基因组合在基因测序的结果，除各碱基的代号，例如，A、T、C及G，本领域亦使用如下表的代号，可用于表示等位基因组合在基因测序的结果0021表1碱基代号表00

16、22R嘌呤（A或G）Y嘧啶（C或T）N任何碱基W弱碱基（A或T）S强碱基（G或C）M氨碱基（A或C）K酮碱基（G或T）B非A（G或C或T）H非G（A或C或T）D非C（A或G或T）V非T（A或G或C）0023基于该初步分型结果和可获得自公共资料库（例如，欧洲生物资讯研究所的IMGT/HLA资料库HTTP/WWWEBIACUK/IMGT/HLA/STATSHTML）的已知HLA等位基因型资讯，可以计算该初步分型结果的可能的不确定性组合，此亦即为来自该个体的受测样本在PCRSBT中可能产生的不确定性组合。在本发明的较佳具体实施例中，可能的不确定性组合通过包含下列步骤的方法计算I根据已知的HLA等位基

17、因型，并列（ALIGNING）所有等位基因组合的序列（基于该初步分型结果）；II比对任两组等位基因组合的联合碱基对序列（COMBINEDBASEPAIRSEQUENCE）；及III若该两组等位基因组合具有相同的联合碱基序说明书CN104102855A4/7页6列，则决定该两组等位基因组合为一不确定性组合。0024由于超过90的人在每一个HLA基因位点皆为异型的（HETEROZYGOUS），要将HLA分型至等位基因的层次，只证实特定序列的存在是不足够的，必须进一步证明这些特定序列在两个单倍体上是如何组合（连接）的，也就是个别的单倍体上的特定片段序列究竟为何。同理，为了决定任两组等位基因组合在测序

18、上是否具有不确定性，则须定义与比较每一等位基因组合的联合碱基对序列。由于联合碱基对序列指的是一等位基因组合中代表两个单倍体序列的一般碱基对。因此，如果两组等位基因组合具有相同的联合碱基序列，它们在测序上即具有不确定性。0025在初步分型结果的所有可能的不确定性组合，被加以计算和决定后，即能于解开最多不确定性组合的前提下，针对该不确定性组合的群组设计或选择特定的引物，以进行该受测样本的PCRSBT。根据本发明，能决定特定个体使用PCRSBT分型方法的“最佳”引物，因此可在在使用最少的实验材料和时间下主动的解开这些不确定性。0026另一方面，本发明提供一种对人类白血球抗原基因位点（HLALOCUS

19、）进行以测序为基础的分型（SBT）系统，其包含A用于根据一实验的设定方案（EXPERIMENTALSETUPPROTOCOL）进行PCR和测序的自动化移液装置；及B用于产生该实验的设定方案的电脑装置，其通过包含以下步骤之方法产生该实验的设定方案I接收一个体于该HLA基因位点的初步分型结果；II根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及III以解开最多的步骤II所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。0027用于PCR和测序的自动化移液装置（AUTOMATEDPIPETTINGDEVICE）可经由商业渠道获得，例如，TEXASBIOGENE的DXAPIPETTOR系

20、统。0028该自动化移液装置根据一实验的设定方案（EXPERIMENTALSETUPPROTOCOL）进行自动化PCR和测序程序，该实验的设定方案可由一操作者输入或设定。在先前技术中，该实验的设定方案仅指示该自动化移液装置使用一组预设或常规的引物进行PCR和测序。在本发明中，利用一电脑装置（ACOMPUTERMEANS）来决定针对特定受测个体的“最佳”引物组，再依此产生实验的设定方案，以指示该自动化移液装置使用该“最佳”引物组进行PCR和测序，能主动解决不确定性的问题、节省实验时间并降低实验材料不必要的浪费。0029根据本发明，该电脑装置通过包含下列步骤的方法产生该实验的设定方案I接收一个体于

21、该人类白血球抗原基因位点的初步分型结果；II根据已知的HLA等位基因型，计算该初步分型结果的所有不确定性组合；及III以解开最多的步骤II所得的不确定性组合为前提，选择一或多个引物。该电脑装置可选自于，例如，由电脑系统、桌上型电脑、笔记型电脑及可携式计算装置所组成的群组。0030该初步分型结果可由操作者手动输入。该初步分型结果提供该HLA基因位点的一初步（或粗略）HLA型别。根据本发明，该初步分型结果提供低分辨度至中分辨度的HLA型别，其可通过一血清学方法或一以DNA为基础的方法而获得。在本发明的特定具体实施例中，该初步分型结果是通过选自于由序列特异的寡核苷酸探针法（SEQUENCESPECI

22、FICOLIGONUCLEOTIDEPROBE；SSOP）、反向序列特异的寡核苷酸探针法（REVERSESEQUENCESPECIFICOLIGONUCLEOTIDEPROBE；RSSOP）、序列特异的引物法（SEQUENCESPECIFICPRIMER；SSP）及测序分型法（SEQUENCINGBASEDTYPING；SBT）的一以DNA为基础的方法而获得。说明书CN104102855A5/7页70031基于该初步分型结果和可自公共资料库（例如，欧洲生物资讯研究所的IMGT/HLA资料库HTTP/WWWEBIACUK/IMGT/HLA/STATSHTML）获得的已知HLA等位基因型资讯，可以

23、计算该初步分型结果的可能的不确定性组合，此亦即为来自该受测样本在PCRSBT中所可能产生的不确定性组合。0032在本发明的较佳具体实施例中，可能的不确定性组合通过包含下列步骤的方法计算1根据已知的HLA等位基因型，并列（ALIGNING）所有等位基因组合的序列（基于该初步分型结果）；2比对任两组等位基因组合的联合碱基对序列（COMBINEDBASEPAIRSEQUENCE）；及3若该两组等位基因组合具有相同的联合碱基序列，则决定该两组等位基因组合为一不确定性组合。0033在该初步分型结果的所有可能的不确定性组合被计算和决定后，可以在解开最多该不确定性组合的前提下，选择群组特定的引物，然后该电脑

24、装置即可根据所选择的群组特定引物产生该实验的设计方案。0034本发明以下列实例做进一步阐明，但发明范围不受于此限。0035实施例1HLA的PCRSBT方法流程0036图1是先前技术中典型的HLA的PCRSBT系统的流程图。如图1所示，在输入受测样本的ID及欲进行的SBT试验后，先前技术中的SBT系统将直接输出实验的设计方案至自动化系统并开始执行PCRSBT。如果试验的结果包含不确定性，必须人工以其他供应商的系统进行额外的试验。0037图2是根据本发明的一具体实施例的HLA测序分型的系统所绘制的流程图。如图2所示，本发明的PCRSBT系统会先根据先前的分型资讯（初步分型结果）检验是否有不确定性的

25、存在，并通过决定所有可能的不确定性组合后选择能够解开不确定性的最佳引物或引物组合。因为本发明是针对特定个体决定和使用“最佳”引物于PCRSBT试验，因此可在使用最少的实验材料和时间下主动解开该不确定性。0038实施例2联合碱基对序列的比对及引物的选择10039在一个体于HLAA位点的初步分型结果为A02/A04的情况下，A020101/A040101和A020201/A040201是已知的HLA等位基因组合的其中之二（可见于公共资料库）。上述两组等位基因组合的联合碱基对的比对例示说明如下0040POSAPOSB0041A020101ACGGTCC0042A040101AGGGGCC0043联合

26、碱基对ASGGKCC0044POSAPOSB0045A020201ACGGGCC0046A040201AGGGTCC0047联合碱基对ASGGKCC0048上述两组等位基因组合的联合碱基对是相同的，代表在测序上将具不确定性，因此它们构成一组不确定性组合。若要确定哪一组等位基因组合是真实的基因序列，可设计或选择仅可结合到POSA的C或G其中之一的引物，然后测序确认POSB的碱基。0049实施例3联合碱基对序列之比对及引物之选择2说明书CN104102855A6/7页80050在一个体于HLAA位点的初步分型结果为A01/A01的情况下，A01010101/A0120和A0102/A0166是已知

27、的HLA等位基因组合的其中之二（可见于公共资料库）。上述两组等位基因组合的联合碱基对的比对例示说明如下0051POS127POS3550052A0120AAGAT0053A01010101GAAAT0054联合碱基对RARAT0055POS127POS3550056A0102AAAAT0057A0166GAGAT0058联合碱基对RARAT0059上述两组等位基因组合的联合碱基对是相同的，代表在测序上将具不确定性，因此它们构成一组不确定性组合。然而，若设计可结合至序列107127且在3端的碱基为A的引物，则此引物可与A01010101和A0166的序列结合。接着朝向POS355测序，若POS3

28、55为“A”，则正确的组合为A01010101/A0120；若POS355为“G”，则正确的组合为A0102/A0166。0060实施例4不确定性组合及引物的选择0061在一个体于HLAA位点的初步分型结果为A02/A04的情况下，可能的不确定性组合可以是如下表的形式0062表2A02/A04可能的不确定性组合0063A020101/A040101VSA020201/A040201A020102/A040101VSA020102/A040208A020104/A040101VSA020107/A042201A020106/A040101VSA020101/A040301A020108/A040

29、101VSA023201/A040501A020201/A040101VSA020501/A0406010064可使用的群组特定的引物（能够解开A02/A04的不确定性组合者）可以是如下表的形式0065表3可使用的群组特定的引物0066引物代号能够解开的不确定性组合Z1A020101/A040101VSA020201/A040201说明书CN104102855A7/7页9Z1A020102/A040101VSA020102/A040208Z1A040102/A040101VSA080102/A040208Z2A020104/A040101VSA020107/A042201Z3A240102/A

30、040101VSA020102/A040208Z4A020108/A040101VSA023201/A040501Z5A110108/A040101VSA020401/A040501Z6A240108/A040101VSA020301/A040501Z7A020102/A040101VSA020102/A0402080067因此，可选择如下表的引物0068表4选择用于PCRSBT的引物0069引物代号能够解开的不确定性组合Z1A020101/A040101VSA020201/A040201Z1A020102/A040101VSA020102/A040208Z2A020104/A040101VSA020107/A042201Z7A020102/A040101VSA020102/A040208Z4A020108/A040101VSA023201/A040501（无）A020201/A040101VSA020501/A0406010070当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。说明书CN104102855A1/1页10图1图2说明书附图CN104102855A10