一种表面具有L手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 104307053 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104307053 A (21)申请号 201410532983.3 (22)申请日 2014.10.11 A61L 31/10(2006.01) A61L 31/08(2006.01) A61L 31/16(2006.01) A61L 33/04(2006.01) (71)申请人 西南交通大学 地址 610031 四川省成都市二环路北一段 111 号西南交通大学科技处 (72)发明人 翁亚军 范永鸿 王宏 潘夏鑫 黄楠 陈俊英 王进 杨苹 冷永祥 赵安莎 景凤娟 赵元聪 (74)专利代理机构 成

2、都信博专利代理有限责任 公司 51200 代理人 张澎 (54) 发明名称 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能 生物活性涂层的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种表面具有 L- 手征性的催 化活性多功能生物活性涂层的制备方法。通过多 巴胺自聚合在基底材料上形成牢固的连接层， 然 后采用多巴胺与具有催化内源性一氧化氮供体释 放一氧化氮的末端含氨基或巯基的化合物形成催 化活性交联层， 并通过聚多巴胺层和催化活性层 的交替沉积， 在基底表面获得牢固结合的 “夹心” 形式的催化活性涂层， 再利用表面聚多巴胺层中 的氨基与促细胞粘附多肽 (L- 手征性 ) 的羧基结 合， 并通过涂层表面醌

3、基固定L-氨基酸或L-二肽 获得具有L-手征性的涂层表面。 本发明制备方法 简单， 条件温和， 制备的涂层具有与基底材料结合 牢固的优点， 通过在涂层表面引入促细胞粘附多 肽获得多功能的生物活性表面， 并通过在表面构 建 L- 手征性同时增强催化活性层催化释放一氧 化氮和促细胞生长的能力。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104307053 A CN 104307053 A 1/1 页 2 1. 一种表面具有 L- 手征性的催化活

4、性多功能生物活性涂层的制备方法， 由如下步骤 获得 ： A、 将需要改性的基底材料进行抛光、 清洗、 干燥 ； B、 将样品放置于 pH 6-9 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺， 使多巴胺的终浓度为 0.01mg/ml-10mg/ml， 在 10-30下， 反应 1-24h ； C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每次 5min， 然后用 N2干燥 ； D、 将 C 步骤所得样品置于 pH 6-9 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和具有催化内 源性一氧化氮供体释放一氧化氮的末端含氨基或巯基的化合物， 使两者分别的终浓度为 0.01mg/ml-10mg/ml， 在 10-

5、30下， 反应 1-24h ； E、 重复 C 步骤 ； F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 1 次或多次， 然后重复 B、 C 步骤 ； G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入含有羧基的促细胞粘附多肽、 NHS 和 EDC， 使多肽 中羧基量、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 1-5， 在 10-30下， 反应 1-24h， 用蒸馏水 清洗 3 次， 每次 5min ； H、 将 G 步骤所得样品置于 pH 6-9 的 Tris 缓冲溶液中， 加入 L- 型氨基酸或 L

6、- 型二 肽， 使溶液的终浓度为 0.01mg/ml-10mg/ml， 在 10-30下， 反应 1-24h， 蒸馏水清洗 3 次， 每 次 5min， 得到目标材料。 2. 如权利要求 1 所述的一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制 备方法， 其特征在于， 所述基底材料可为金属生物材料、 陶瓷生物材料、 天然和合成的高分 子生物材料、 杂化生物材料。 3. 如权利要求 1 所述的一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制 备方法， 其特征在于， 所述具有催化内源性一氧化氮供体释放一氧化氮的末端含氨基或巯 基的化合物为胱胺、 硒代胱胺、 硒代胱氨酸、 胱氨

7、酸的一种 ； 4. 如权利要求 1 所述的一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制 备方法， 其特征在于， 所述 F 步骤中重复多次的次数为 2 到 9 次。 5. 如权利要求 1 所述的一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制 备方法， 其特征在于， 所述步骤 G 中的促细胞粘附多肽为含 RGD 的多肽、 含 REDV 的多肽、 多 肽适配子中的一种。 6. 如权利要求 1 所述的一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制 备方法， 其特征在于， 所述步骤 G 中加入的 L- 型氨基酸可为 L- 甘氨酸、 L- 丙氨酸、 L- 苏氨 酸、

8、L- 半胱氨酸、 L- 赖氨酸， L- 胱氨酸或 L- 硒代胱氨酸、 L- 酪氨酸或含上述 L- 氨基酸的 二肽。 权 利 要 求 书 CN 104307053 A 2 1/6 页 3 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层 的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医学工程功能材料， 尤其是具有优异抗凝血和促内皮细胞粘附、 生长功能的材料制备技术领域。 背景技术 0002 心血管器械植入体内后出现的抗凝血性能不足和内皮化延迟所导致的临床失效 问题， 已成为制约其应用和发展的难题。 兼具抗凝血和促内皮细胞粘附、 生长的多功能生物 活性材料已成为血液接触材料发展的趋势。现有的

9、方法是将抗凝血和促内皮两类生物活 性分子分别固定在材料表面， 而选用的抗凝血活性分子， 通常是肝素、 水蛭素、 血栓改性蛋 白等生物单分子， 类似的方法需要材料表面具有较多的反应性位点， 但由于固体材料表面 的接枝位点有限、 生物大分子的空间位阻大等原因往往难以同时在材料表面实现这两种功 能。 0003 一氧化氮是内皮细胞分泌的信号分子， 具有抗血小板激活和聚集、 舒张血管等抗 凝血功能， 已有通过在材料表面固定胱胺、 硒代胱胺等催化内源性供体释放一氧化氮的报 道。 材料表面或内部固定催化活性分子， 类似于酶固定化技术， 催化反应要在固体上的催化 活性位点发生， 而血浆中的蛋白， 包括内源性供

10、体， 从血浆中吸附到催化活性位点的传质过 程由于受到固体材料的阻碍， 实际催化活性往往不高。现有研究表明由氨基酸形成的 L- 手 征性表面 ( 如固定 L- 半胱氨酸的表面 ) 可以促进蛋白质的表面吸附， 因而构建的 L- 手征 性表面能够加快内源性供体 ( 蛋白质 ) 从液体环境到达催化位点， 加速 NO 的释放。并且 L- 手征性表面能够吸附更多的蛋白， 将为粘附的细胞提供更多的营养， 从而促进细胞的生 长。通过 “夹心式” 的涂层设计， 除了使催化活性层不占用表面接枝位点而外， 涂层的最底 层和最外层均为聚多巴胺层。聚多巴胺层单独作为接枝生物分子的连接层， 已经有较多的 报道， 由于其卓

11、越的粘附性能， 几乎能牢固地粘附在所有材料表面， 因而这种 “夹心式” 的涂 层设计能够增加涂层的稳定性和牢固性。聚多巴胺表面主要具有两类反应性位点， 即氨基 和醌基。研究显示材料表面固定促细胞粘附肽往往只需较少的量 ( 约 fmol/cm2级别 ) 即 可， 通过最外层聚多巴胺表面的氨基与促细胞粘附多肽 (L- 手征性 ) 中的羧基反应而将其 固定在表面， 以促进内皮细胞的表面粘附。 另外， 通过聚多巴胺表面醌基固定分子量较小的 L- 氨基酸或二肽， 使材料表面具有较多的 L- 手征性。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的 制备方法

12、。以 “夹心式” 涂层中的聚多巴胺层作为中间连接层， 增强涂层粘附的牢固性 ； 以 多巴胺与催化活性分子交联形成催化释放一氧化氮层 ； 以在涂层表面固定促细胞粘附多肽 促进内皮细胞粘附 ； 以在表面接枝小分子L-氨基酸、 二肽和促细胞粘附多肽获得具有L-手 征性的表面。 说 明 书 CN 104307053 A 3 2/6 页 4 0005 本发明涉及的一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方 法， 包括如下步骤 ： 0006 A、 将需要改性的基底材料进行抛光、 清洗、 干燥 ； 0007 B、 将样品放置于 pH 6-9 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺，

13、使多巴胺的终浓 度为 0.01mg/ml-10mg/ml， 在 10-30下， 反应 1-24h ； 0008 C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每次 5min， 然后用 N2干燥 ； 0009 D、 将 C 步骤所得样品置于 pH 6-9 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和具有催化 内源性一氧化氮供体释放一氧化氮的末端含氨基或巯基的化合物， 使两者分别的终浓度为 0.01mg/ml-10mg/ml， 在 10-30下， 反应 1-24h ； 0010 E、 重复 C 步骤 ； 0011 F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 1 次或多次， 然后重复 B、 C 步骤 ； 001

14、2 G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 0013 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入含有羧基的促细胞粘附多肽、 NHS 和 EDC， 使 多肽中羧基量、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 1-5， 在 10-30下， 反应 1-24h， 用蒸 馏水清洗 3 次， 每次 5min ； 0014 H、 将G步骤所得样品置于pH6-9的Tris缓冲溶液中， 加入L-型氨基酸或L-型 二肽， 使溶液的终浓度为 0.01mg/ml-10mg/ml， 在 10-30下， 反应 1-24h， 蒸馏水清洗 3 次， 每次 5

15、min， 得到目标材料。 0015 采用本发明方法制备的一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂 层， 具有优异的催化人体内源性供体释放 NO 的能力， 有效地抑制血小板在材料表面的激活 和聚集， 同时具有较好地促进内皮细胞粘附和生长功能。本发明制备的催化活性层处于涂 层内部， 而涂层表面接枝的是空间位阻相对较小的氨基酸、 二肽或多肽， 能够克服固体表面 反应性位点有限的缺陷。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益之处在于 ： 0017 1) 目前报道的兼具抗凝血和促内皮功能化表面的制备通常采用在材料表面同时 固定抗凝血和促内皮的两种生物分子， 由于材料表面反应性官能团相对较少

16、和空间位阻的 存在， 类似方法很难实现。本发明将具有催化内源性供体释放 NO 的交联层负载在涂层内 部， 不占据表面反应性位点 ； 0018 2) 催化活性层中的催化活性二硫或二硒位点在催化反应过程中会涉及二硫或二 硒键的断裂和复原， 如果仅仅通过催化活性分子与多巴胺交联构建催化活性层， 可能会存 在稳定性不好的缺陷， 本发明并将具有较好粘附性的聚多巴胺层引入并形成 “夹心” 式， 大 大提高了涂层与基底材料以及涂层内部的稳定性 ； 0019 3) 已有在材料表面固定无手性催化活性分子， 如胱胺和硒代胱胺构建催化活性层 的报道， 由于催化反应需要在固体上的催化活性位点处进行， 内源性供体从液相

17、到固相的 传质受阻， 催化效率低。本发明在表面固定小分子的 L- 氨基酸或 L- 二肽制备 L- 手征性表 面， 加快传质过程， 催化效率高 ； 0020 4)已有在材料表面固定促细胞粘附多肽， 如RGD或REDV的报道。 然而细胞粘附多 肽只促进细胞粘附， 细胞在材料表面的生长需要蛋白质的支持， 研究表明 L 手征性表面有 利于蛋白质的表面吸附， 细胞生长状态更好。 说 明 书 CN 104307053 A 4 3/6 页 5 0021 下面结合附图和实施例， 对本发明作进一步详细的说明。 附图说明 0022 图 1 为胶原激活剂存在条件下， 按实施例 1 方法制备的表面具有 L- 手征性的

18、催化 活性多功能生物活性涂层表面血小板粘附的荧光照片 ； 0023 图 2 为胶原激活剂存在条件下， 按实施例 1 方法 A-G 步制备的催化活性多层膜表 面血小板粘附的荧光照片。 具体实施方式 0024 以下实施例中的试剂， 除特别注明的外， 生化试剂均为生物纯， 化学试剂均为分析 纯。 0025 实施例 1 0026 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方法， 由如下步 骤获得 ： 0027 A、 将需要改性的基底材料进行抛光、 清洗、 干燥 ； 0028 B、 将样品放置于 pH 8 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺， 使多巴胺的终浓度 为 0.5mg/

19、ml， 在 30下， 反应 8h ； 0029 C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每次 5min， 然后用 N2干燥 ； 0030 D、 将 C 步骤所得样品置于 pH 8 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和胱胺， 使两者 分别的终浓度为 2mg/ml 和 1mg/ml， 在 30下， 反应 8h ； 0031 E、 重复 C 步骤 ； 0032 F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 3 次， 然后重复 B、 C 步骤 ； 0033 G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 0034 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入

20、RGDS、 NHS 和 EDC， 使 RGDS 中羧基量、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 3， 在 30下， 反应 12h， 用蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min ； 0035 H、 将 G 步骤所得样品置于 pH 8 的 Tris 缓冲溶液中， 加入 L- 半胱氨酸， 使溶液 的终浓度为 0.5mg/ml， 在 10-30下， 反应 1-24h， 蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min， 得到目标材 料。 0036 实施例 2 0037 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方法， 由如下步 骤获得 ： 0038 A、 将需要改性的基底材料进行

21、抛光、 清洗、 干燥 ； 0039 B、 将样品放置于 pH 7 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺， 使多巴胺的终浓度 为 0.3mg/ml， 在 25下， 反应 12h ； 0040 C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每次 5min， 然后用 N2 干燥 ； 0041 D、 将 C 步骤所得样品置于 pH 7 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和硒代胱胺， 使 两者分别的终浓度为 0.5mg/ml 和 0.1mg/ml， 在 25下， 反应 12h ； 0042 E、 重复 C 步骤 ； 0043 F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 1 次， 然后重复 B、 C 步

22、骤 ； 说 明 书 CN 104307053 A 5 4/6 页 6 0044 G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 0045 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入 REDV、 NHS 和 EDC， 使 REDV 中羧基量、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 4， 在 25下， 反应 12h， 用蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min ； 0046 H、 将 G 步骤所得样品置于 pH 7 的 Tris 缓冲溶液中， 加入 L- 甘氨酸， 使溶液的 终浓度为 0.5mg/ml， 在 25下， 反应 12h， 蒸馏水

23、清洗 3 次， 每次 5min， 得到目标材料。 0047 实施例 3 0048 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方法， 由如下步 骤获得 ： 0049 A、 将需要改性的基底材料进行抛光、 清洗、 干燥 ； 0050 B、 将样品放置于 pH 7.5 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺， 使多巴胺的终浓 度为 1mg/ml， 在 25下， 反应 18h ； 0051 C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每次 5min， 然后用 N2干燥 ； 0052 D、 将 C 步骤所得样品置于 pH 7.5 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和硒代胱胺， 使

24、两者分别的终浓度为 1mg/ml 和 0.3mg/ml， 在 25下， 反应 18h ； 0053 E、 重复 C 步骤 ； 0054 F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 3 次， 然后重复 B、 C 步骤 ； 0055 G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 0056 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入 REDV、 NHS 和 EDC， 使 REDV 中羧基量、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 5， 在 25下， 反应 12h， 用蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min ； 0057 H、 将 G 步骤所得

25、样品置于 pH 7.5 的 Tris 缓冲溶液中， 加入 L- 苏氨酸， 使溶液 的终浓度为 0.2mg/ml， 在 25下， 反应 12h， 蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min， 得到目标材料。 0058 实施例 4 0059 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方法， 由如下步 骤获得 ： 0060 A、 将需要改性的基底材料进行抛光、 清洗、 干燥 ； 0061 B、 将样品放置于 pH 8.5 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺， 使多巴胺的终浓 度为 2mg/ml， 在 30下， 反应 8h ； 0062 C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每

26、次 5min， 然后用 N2干燥 ； 0063 D、 将 C 步骤所得样品置于 pH 8.5 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和胱胺， 使两 者分别的终浓度为 1.5mg/ml 和 0.5mg/ml， 在 30下， 反应 8h ； 0064 E、 重复 C 步骤 ； 0065 F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 2 次， 然后重复 B、 C 步骤 ； 0066 G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 0067 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入多肽适配子 TPSLEQRTVYAK、 NHS 和 EDC， 使 多肽适配子中羧基

27、量、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 5， 在 25下， 反应 12h， 用蒸馏 水清洗 3 次， 每次 5min ； 0068 H、 将 G 步骤所得样品置于 pH 8.5 的 Tris 缓冲溶液中， 加入 L- 丝氨酸， 使溶液 的终浓度为 0.15mg/ml， 在 25下， 反应 18h， 蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min， 得到目标材料。 0069 实施例 5 说 明 书 CN 104307053 A 6 5/6 页 7 0070 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方法， 由如下步 骤获得 ： 0071 A、 将需要改性的基底材料进

28、行抛光、 清洗、 干燥 ； 0072 B、 将样品放置于 pH 9 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺， 使多巴胺的终浓度 为 1.2mg/ml， 在 30下， 反应 24h ； 0073 C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每次 5min， 然后用 N2干燥 ； 0074 D、 将 C 步骤所得样品置于 pH 9 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和胱胺， 使两者 分别的终浓度为 1.2mg/ml 和 0.3mg/ml， 在 30下， 反应 24h ； 0075 E、 重复 C 步骤 ； 0076 F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 5 次， 然后重复 B、 C 步骤

29、； 0077 G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 0078 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入 REDV、 NHS 和 EDC， 使 REDV 中羧基量、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 4， 在 30下， 反应 24h， 用蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min ； 0079 H、 将 G 步骤所得样品置于 pH 9 的 Tris 缓冲溶液中， 加入 L- 赖氨酸， 使溶液的 终浓度为 0.1mg/ml， 在 25下， 反应 12h， 蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min， 得到目标材料。 0080 实施例

30、 6 0081 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方法， 由如下步 骤获得 ： 0082 A、 将需要改性的基底材料进行抛光、 清洗、 干燥 ； 0083 B、 将样品放置于 pH 6.5 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺， 使多巴胺的终浓 度为 0.1mg/ml， 在 30下， 反应 10h ； 0084 C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每次 5min， 然后用 N2干燥 ； 0085 D、 将 C 步骤所得样品置于 pH 6.5 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和胱胺， 使两 者分别的终浓度为 0.5mg/ml 和 0.05mg/ml，

31、在 30下， 反应 10h ； 0086 E、 重复 C 步骤 ； 0087 F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 7 次， 然后重复 B、 C 步骤 ； 0088 G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 0089 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入 RGD、 NHS 和 EDC， 使 RGD 中羧基量、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 5， 在 25下， 反应 12h， 用蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min ； 0090 H、 将 G 步骤所得样品置于 pH 8.5 的 Tris 缓冲溶液中， 加入 L-

32、 酪氨酸， 使溶液 的终浓度为 0.15mg/ml， 在 25下， 反应 18h， 蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min， 得到目标材料。 0091 实施例 7 0092 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方法， 由如下步 骤获得 ： 0093 A、 将需要改性的基底材料进行抛光、 清洗、 干燥 ； 0094 B、 将样品放置于 pH 8 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺， 使多巴胺的终浓度 为 0.2mg/ml， 在 20下， 反应 12h ； 0095 C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每次 5min， 然后用 N2干燥 ； 0096 D、 将

33、C 步骤所得样品置于 pH 8 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和胱胺， 使两者 说 明 书 CN 104307053 A 7 6/6 页 8 分别的终浓度为 1mg/ml 和 0.3mg/ml， 在 20下， 反应 12h ； 0097 E、 重复 C 步骤 ； 0098 F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 1 次， 然后重复 B、 C 步骤 ； 0099 G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 0100 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入多肽适配子 SYQTLKQHLPYG、 NHS 和 EDC， 使 多肽适配子中羧基量

34、、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 3.5， 在 30下， 反应 12h， 用蒸 馏水清洗 3 次， 每次 5min ； 0101 H、 将 G 步骤所得样品置于 pH 8 的 Tris 缓冲溶液中， 加入 L- 胱氨酸钠， 使溶液 的终浓度为 0.1mg/ml， 在 25下， 反应 18h， 蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min， 得到目标材料。 0102 实施例 8 0103 一种表面具有 L- 手征性的催化活性多功能生物活性涂层的制备方法， 由如下步 骤获得 ： 0104 A、 将需要改性的基底材料进行抛光、 清洗、 干燥 ； 0105 B、 将样品放置于 pH

35、8.5 的 Tris 缓冲溶液中， 然后加入多巴胺， 使多巴胺的终浓 度为 1mg/ml， 在 20下， 反应 10h ； 0106 C、 将样品用去离子水超声清洗 3 次， 每次 5min， 然后用 N2干燥 ； 0107 D、 将 C 步骤所得样品置于 pH 8.5 的 Tris 缓冲溶液中， 加入多巴胺和硒代胱胺， 使两者分别的终浓度为 0.5mg/ml 和 0.03mg/ml， 在 20下， 反应 12h ； 0108 E、 重复 C 步骤 ； 0109 F、 重复 B、 C、 D、 C 步骤 2 次， 然后重复 B、 C 步骤 ； 0110 G、 通过 EDC/NHS 将含有羧基的促

36、细胞粘附多肽固定在步骤 F 制备的样品上 ： 0111 在浓度为 50mM 的 MES 溶液中依次加入 RGDS、 NHS 和 EDC， 使 RGDS 中羧基量、 NHS 和 EDC 三种物质的量的比为 1 ： 1 ： 2， 在 30下， 反应 12h， 用蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min ； 0112 将G步骤所得样品置于pH8.5的Tris缓冲溶液中， 加入L-硒代胱氨酸钠， 使溶 液的终浓度为 0.2mg/ml， 在 30下， 反应 16h， 蒸馏水清洗 3 次， 每次 5min， 得到目标材料。 说 明 书 CN 104307053 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104307053 A 9