单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103087120 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103087120 A *CN103087120A* (21)申请号 201310059889.6 (22)申请日 2013.02.26 C07H 15/10(2006.01) C07H 1/00(2006.01) A61K 31/7032(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 25/16(2006.01) (71)申请人 北京四环制药有限公司 地址 101114 北京市通州区张家湾镇齐善庄

2、村东 申请人 北京澳合药物研究院有限公司 长春翔通药业有限公司 (72)发明人 黄晓霞 屈英薇 张洋 (54) 发明名称 单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其 应用 (57) 摘要 本发明涉及单唾液酸四己糖神经节苷脂的制 备方法及其应用。该方法以阳离子树脂 （优选为 Dowex50） 为介质， 在含有氯仿的酸性混合水溶液 中， 将动物脑组织来源的神经节苷脂混合物转化 为富含 GM1的混合物， 所得转化产物中 GM1的含 量由转化前的 7-10提高到 72-80， 进而减少 7-12倍的动物脑组织用量 （生产相同量的 GM1） ， 显著降低生产成本。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页

3、 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103087120 A CN 103087120 A *CN103087120A* 1/1 页 2 1. 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法， 包括下述步骤 ： (1) 将神经节苷脂混合物用乙醇、 水、 氯仿组成的混合溶剂溶解为浓度 50-150g/L 的 混合溶液， 调 pH 值 2.0-3.0， 搅拌混匀， 制得神经节苷脂混合物溶液， 其中， 所述的神经节苷 脂混合物选自牛脑神经节苷酯混合物、 猪脑神经节苷脂混合物的任一种或其组合， 所述混 合溶剂中水 ：

4、 乙醇 ： 氯仿的体积比为 60-30:8-2: 1， 优选混合溶液的浓度为 100g/L， 优选所 述混合溶液的pH值为2.4-2.8， 更优选所述混合溶剂中水 ： 乙醇 ： 氯仿的体积比为45:5:1 ； (2) 将阳离子树脂用纯净水漂洗干净， 沥干水分后， 再用 5的 HCl 溶液浸泡 3h-5h 后， 用纯净水漂洗至中性， 沥干水分， 制得酸活化处理后的阳离子树脂， 其中， 优选所述的阳离 子树脂为强酸性阳离子交换树脂， 更优选为 Dowex 50 ； (3) 以神经节苷脂混合物的质量计， 在步骤 1） 制得的神经节苷脂混合物溶液中加入 10-30的阳离子树脂， 升温至 60 -80，

5、 搅拌， 反应 1h-4h， 调节 pH 值至 7.5-9.0， 制得神 经节苷脂混合物的酸水解液， 优选神经节苷脂混合物溶液中加入 20的阳离子树脂， 更优 选升温至 65 -68 ； （4） 收集神经节苷脂混合物的酸水解液中的上清液， 将其浓缩至 400-600g/L， 在浓缩物 中加入浓缩物体积的 7-9 倍量的冷丙酮， 将浓缩物沉淀过夜， 收集沉淀， 干燥， 即得， 优选将 神经节苷脂混合物的酸水解液中的上清液的浓缩至 500g/L。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 步骤 1） 中调节 pH 值的物质选自盐酸、 硫酸、 硝酸、 醋酸、 甲酸的任一种或其组合。 3. 根据权利要

6、求 1 所述的制备方法， 步骤 3） 中调节 pH 值的物质选自氢氧化钠、 氢氧化 钾、 碳酸钠、 磷酸钠、 碳酸钾、 磷酸钾的任一种或其组合。 4. 一种高含量的单唾液酸四己糖神经节苷脂， 所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂由权 利要求 1-3 任一项所述的制备方法制备得到。 5. 根据权利要求 4 所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂， 所述单唾液酸四己糖神经节苷 脂的含量为 72%-80%。 6. 权利要求 1-3 任一项所述的制备方法制备得到单唾液酸四己糖神经节苷脂在制备 治疗血管性中枢神经系统疾病或创伤性中枢神经系统疾病药物中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 所述的血管性中枢神经

7、系统疾病或创伤性中枢神经系 统疾病选自脑卒中、 脊髓损伤、 脑外伤、 各种慢性病后期的神经功能障碍、 脑萎缩、 阿尔茨海 默病、 帕金森氏病、 脑血管意外、 智力障碍的任一种或其组合。 权 利 要 求 书 CN 103087120 A 2 1/4 页 3 单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用 技术领域 0001 本发明属于医药生物技术领域， 具体涉及单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法 及其应用。 背景技术 0002 神经节苷脂 (ganglioside， Gls) 是一类含唾液酸的膜糖脂 / 鞘糖脂， 由亲水的寡 糖链和亲脂的神经酰胺两部分组成。神经节苷脂位于神经元细胞的双层结构外层，

8、为大多 数哺乳动物细胞膜的组成成分和大脑形成记忆的重要物质， 因其最早被发现于神经节细胞 而得名。 0003 单唾液酸四己糖神经节苷脂 （Monosialotetrahexosylganglioside， GM1） 为乳白 色粉末， 无味， 有吸湿性， 分子量为 1551（GM1 钠盐的分子量为 1574） ， 溶于水、 甲醇 - 水、 甲醇 - 氯仿， 不溶于甲醇、 丙酮、 氯仿、 乙醚， 熔点为 207-230， 其紫外吸收最大波长位于 205nm， 可通过氨基正相高效液相色谱和薄层色谱 （TLC） 进行纯度鉴定， 气相色谱可鉴定 GM1 分子中的糖基和神经酰胺残基。 0004 能嵌入神经

9、细胞膜， 模仿内源性神经节苷脂的某些功能， 调节膜介导的细胞功能， 并刺激中枢神经系统损伤后潜在的代替机制而阻止损害的发生， 保护未受损的神经组织， 还能影响体外培养的神经元生长及其活性， 促进其存活及生长。神经节苷酯 GM1 在神经系 统的主要生理作用包括 ： 1） 促进神经细胞的生长、 分化发育和神经再生 ； 2） 参与突触传递， 维持脑的正常机能， 参与各种记忆活动 ； 3） 在细胞与细胞、 细胞与微生物、 细胞与基质间的 相互作用中起到介导作用 ； 4） 调节细胞膜中各种蛋白质功能， 如离子通道、 表皮生长因子受 体等。 0005 能通过血脑屏障， 注射后快速在大脑和脊髓组织中分布，

10、临床治疗效果十分显著， 主要用于治疗血管性中枢神经系统疾病或创伤性中枢神经系统疾病， 如脑卒中、 脊髓损伤、 脑外伤、 各种慢性病后期的神经功能障碍、 脑萎缩、 阿尔茨海默病、 帕金森氏病、 脑血管意 外、 智力障碍等。意大利 Fidia 公司从牛脑组织中提取的 GM1 注射液 （商品名 Sygen） 已于 20 世纪 90 年代在我国销售。 0006 哺乳动物脑组织中主要包括 GM1、 GD1a、 GD1b 和 GT1b 等神经节苷脂成分。这些 成分中的寡糖链和神经酰胺部分结构一致， 主要差异在于寡糖链上唾液酸分子的位置和数 量。其中， GD1a 和 GD1b 的糖链上有两个唾液酸， 但各自

11、位置不同 ； GT1b 的糖链上有三个唾 液酸 ； GM1 的糖链上有一个唾液酸。GD1a、 GD1b 和 GT1b 寡糖链上的唾液酸基团在酸性或酶 催化条件下可降解， 进而制得 GM1。 0007 公开了单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法， 该方法使用混合溶剂 （氯仿 ： 甲 醇 ： 水的体积比为 1:2:0.75） 从哺乳动物脑组织中提取总神经节苷酯， 浓缩总神经节苷酯 提取液后再进行酸水解 （pH3.0-5.0） 以提高 GM1 含量， 浓缩水解产物经脱盐后溶解于混 合溶剂 （氯仿 ： 甲醇 ： 水的体积比为 1:2:1.4）中进行阴离子交换柱层析 （如 Q-Sepharose F.F.

12、 或 DEAE- Sepharose） ， 其中， 脑组织与混合溶剂的体积比为 1 ： 20， 收集含 GM1 的洗脱 说 明 书 CN 103087120 A 3 2/4 页 4 峰， 浓缩后再进行反相柱层析 （SourcRPC30） ， 所得 GM1 于冷丙酮中沉淀， 收集沉淀， 干燥， 即 得。该文献报道的 GM1 纯度大于 98%， 但存在操作复杂、 制造成本高， 难于工业化生产等缺 陷。 0008 目前， GM1 主要来源于动物脑组织， 从动物脑组织中提取总神经节苷酯混合物的方 法业已成熟稳定， GM1 产率的增加关键在于提高神经节苷脂混合物中其他神经节苷脂转化 为 GM1 的转化率

13、。多采用微生物转化法和无机酸转化法来提高神经节苷脂 GM1 的产率。微 生物转化法是从土壤中筛选培养具备降解唾液酸活性的微生物菌落， 使其与神经节苷脂混 合物共同发酵培养， 微生物在代谢过程中表达一种具备唾液酸降解活性的蛋白酶， 专一高 效地实现神经节苷脂的转化。 然而， 天然微生物在与神经节苷脂共同孵化培育过程中， 会产 生大量的菌体异源蛋白质和异源DNA， 进而导致严重的用药安全隐患。 无机酸转化法则在神 经节苷脂混合物溶液中加入盐酸、 硫酸或磷酸， 调节pH值至3.0-5.0， 保温反应， 即可。 该方 法操作简单， 所用化学试剂安全可靠， 普遍用于 GM1 的生产。然而， 该方法存在由

14、神经节苷 脂转化为 GM1 的效率不理想， 实际转化率仅有理论转化率的 60左右， 约有 40的 GM1 被 过度酸化为脱唾液酸神经节苷脂 GA1。 0009 公开了一种转化神经节苷脂 GM1 的方法， 该方法将神经节苷脂混合物用 pH 值 3.0-5.0、 浓度为 10-50mmol/L 的乙酸 - 乙酸钠缓冲溶液溶解为 50-150g/L 的溶液， 以神经 节苷酯质量计， 在神经节苷脂混合物水溶液中加入 30-50% 经酸活化处理的阳离子树脂， 再 在 55-75低速搅拌 0.5-2.0 小时， 抽滤， 浓缩， 冷丙酮沉淀， 收集沉淀， 干燥， 即得。该方法 将神经节苷脂混合物中 GM1

15、的含量由 7-10提高到 30-35。 0010 目前， 通过化学合成手段制备神经节苷脂 GM1 存在难以克服的实际困难。因此， 研 究安全高效地将神经节苷脂混合物转化为 GM1 的制备方法具有十分重要的现实意义。 发明内容 0011 本发明的目的在于提供一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法， 包括下述步 骤 ： (1) 将神经节苷脂混合物用乙醇、 水、 氯仿组成的混合溶剂溶解为浓度 50-150g/L 的 混合溶液， 调 pH 值 2.0-3.0， 搅拌混匀， 制得神经节苷脂混合物溶液， 其中， 所述的神经节苷 脂混合物选自牛脑神经节苷酯混合物、 猪脑神经节苷脂混合物的任一种或其组合， 所

16、述混 合溶剂中水 ： 乙醇 ： 氯仿的体积比为 60-30:8-2: 1 ； (2) 将阳离子树脂用纯净水漂洗干净， 沥干水分后， 再用 5的 HCl 溶液浸泡 3h-5h 后， 用纯净水漂洗至中性， 沥干水分， 制得酸活化处理后的阳离子树脂， 其中， 优选所述的阳离 子树脂为强酸性阳离子交换树脂， 更优选为 Dowex 50 ； (3) 以神经节苷脂混合物的质量计， 在步骤 1） 制得的神经节苷脂混合物溶液中加入 10-30的阳离子树脂， 升温至 60 -80， 搅拌， 反应 1h-4h， 调节 pH 值至 7.5-9.0， 制得神 经节苷脂混合物的酸水解液 ； （4） 收集神经节苷脂混合物

17、的酸水解液中的上清液， 将其浓缩至 400-600g/L， 在浓缩液 中加入浓缩液体积量 7-9 倍的冷丙酮， 搅拌， 静置过夜， 收集沉淀， 干燥， 即得。 0012 本发明的优选技术方案中， 步骤 1） 中混合溶液的浓度为 100g/L。 0013 本发明的优选技术方案中， 步骤 1） 中所述混合溶剂中水 ： 乙醇 ： 氯仿的体积比为 说 明 书 CN 103087120 A 4 3/4 页 5 45:5:1。 0014 本发明的优选技术方案中， 步骤 1） 中调节 pH 值的物质选自盐酸、 硫酸、 硝酸、 醋 酸、 甲酸的任一种或其组合。 0015 本发明的优选技术方案中， 步骤 1）

18、中所述混合溶液的 pH 值优选为 2.4-2.8。 0016 本发明的优选技术方案中， 以神经节苷脂混合物的质量计， 在步骤 3） 制得的神经 节苷脂混合物溶液中加入 20的阳离子树脂。 0017 本发明的优选技术方案中， 步骤 3） 中的温度为 65 -68。 0018 本发明的优选技术方案中， 步骤 3） 中调节 pH 值的物质选自氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钠、 磷酸钠、 碳酸钾、 磷酸钾的任一种或其组合。 0019 本发明的优选技术方案中， 步骤 4） 中将神经节苷脂混合物的酸水解液中的上清液 的浓缩至 500g/L。 0020 本发明的另一目的在于提供单唾液酸四己糖神经节苷脂， 所述

19、的单唾液酸四己糖 神经节苷脂由本发明所述的制备方法制备得到， 其中， 单唾液酸四己糖神经节苷脂的含量 为 72%-80%。 0021 本发明的另一目的在于提供单唾液酸四己糖神经节苷脂在制备治疗血管性中枢 神经系统疾病或创伤性中枢神经系统疾病药物中的应用。 0022 本发明的优选技术方案中， 所述的血管性中枢神经系统疾病或创伤性中枢神经系 统疾病选自脑卒中、 脊髓损伤、 脑外伤、 各种慢性病后期的神经功能障碍、 脑萎缩、 阿尔茨海 默病、 帕金森氏病、 脑血管意外、 智力障碍的任一种或其组合。 0023 为了清楚地表述本发明的保护范围， 本发明对术语进行如下界定 ： 本发明用正相氨基柱检测法 (

20、 参见文献 ： 郑永彪等 . 离子对高效液相色谱法分离测定 单唾液酸神经节苷脂的含量 J. 药物分析杂志， 2004， (2).) 检测单唾液酸四己糖神经节 苷脂的含量。 0024 本发明所述的神经节苷脂混合物是指通过常规技术手段从动物脑组织主要是牛 脑组织或猪脑组织获取的神经节苷脂混合物。神经节苷脂混合物成分主要为 GM1、 GD1b、 GD1a 和 GT1b， 其中 GM1 的含量占神经节苷脂混合物总量的 7 10， GD1b、 GD1a 和 GT1b 的 总量占神经节苷脂混合物总量的 80-87%。 0025 本发明所述的阳离子树脂是指本领域常用的可用于催化酸水解反应的阳离子树 脂， 优

21、选所述的阳离子树脂为强酸性阳离子交换树脂， 更优选为 Dowex 50 型阳离子树脂。 0026 除非另有说明， 本发明涉及液体与液体之间的百分比时， 所述的百分比为体积 / 体积百分比 ； 本发明涉及液体与固体之间的百分比时， 所述百分比为体积 / 重量百分比 ； 本 发明涉及固体与液体之间的百分比时， 所述百分比为重量/体积百分比 ； 其余为重量/重量 百分比。 0027 与现有技术相比， 本发明具有下述有益技术效果 ： 1、 本发明改进单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法， 以阳离子树脂 （优选为 Dowex 50） 为介质， 在含有氯仿的酸性混合水溶液中， 将动物脑组织来源的神经节苷脂混

22、合物转化 为富含 GM1 的混合物， 所得转化产物中 GM1 的含量由转化前的 7-10提高到 72-80， 进而 减少 7-12 倍的动物脑组织用量 （生产相同量的 GM1） ， 显著降低生产成本。 0028 、 本发明使用成本低廉的酸 （如盐酸、 硫酸、 硝酸、 醋酸、 甲酸的任一种或其组合） 进 说 明 书 CN 103087120 A 5 4/4 页 6 行酸水解， 且降低了阳离子树脂的使用量， 提高了产率 （提高 35-50%） ， 降低了成本 （成本下 降 35-60%） 。 0029 、 本发明的制备方法具有工艺简便， 适于工业化生产等优点。 具体实施方式 0030 以下将结合实

23、施例具体说明本发明， 本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方 案， 并非限定本发明的实质。 0031 实施例 1 猪脑神经节苷酯混合物的制备 猪脑神经节苷脂混合物的制备方法， 包括如下步骤 ： 1） 将新鲜猪脑组织经 5000rpm 离心去除游离水， 用胶体磨粉碎后， 3000r/min 高速匀浆 30min， 成乳胶状后， 注入提取罐中并加入 10 倍体积的甲醇 ： 水的体积比为 2 ： 0.8 的甲醇水 溶液， 2搅拌 12h， 制得提取液 ； 2） 将提取液过滤， 收集滤液经大孔吸附树脂 D-101 层析柱分离纯化， 用甲醇 ： 水的体积 比为 1 ： 2 的甲醇水溶液洗除杂质， 再用无

24、水甲醇洗脱， 收集含有神经节苷脂混合物的洗脱 液 ； 3） 将神经节苷脂混合物的洗脱液在 40真空浓缩， 并经 -20冷冻干燥后， 按照本发 明所述的检测方法， 制得 GM1 含量为 7-10% 的神经节苷酯混合物。 0032 实施例 2 单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法 单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法， 包括下述步骤 ： （1） 取实施例 1 制得的神经节苷脂混合物 1000 克， 将其溶解于 10 升由水、 乙醇和氯仿 组成的混合溶剂， 用盐酸调节 pH 值 2.5， 搅拌混匀， 制得神经节苷脂混合物溶液， 其中， 所述 混合溶剂中水 ： 乙醇 ： 氯仿的体积比为 45:5:1 ；

25、（2） 将阳离子树脂 （Dowex 50） 用纯净水漂洗干净， 沥干水分， 用5的HCl溶液浸泡3h， 再用纯净水漂洗至中性， 沥干水分， 制得酸活化处理后的阳离子树脂 （Dowex 50） ； （3） 称取 200 克酸活化处理后的阳离子树脂 （Dowex 50） ， 将其加入到步骤 （1） 中制得 的神经节苷脂混合溶液中 ； 水浴升温至75， 搅拌反应2h， 用8mol/LNaOH溶液调节pH值至 9.0， 制得神经节苷酯混合物转化液 ； （4） 抽滤步骤 （3） 制得的神经节苷酯混合物转化液， 滤渣用纯净水淋洗， 合并滤液， 将滤 液在 85真空减压浓缩至 500g/L， 待浓缩液冷却至

26、室温后， 加入浓缩液体积 8 倍量的冷丙 酮， 搅拌， 静置过夜， 滤过， 收集沉淀， 70鼓风干燥 8h， 得干品 950 克， 收率为 95%。 0033 采用本发明所述的正相氨基柱检测法测定所得产品中 GM1 的纯度为 79.6。 0034 实施例 3-5 单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法 实施例 3-5 制备 GM1 的方法和步骤基本同实施例 2， 不同之处见表 1。 0035 表 1 实施例 3 实施例 4 实施例 5 乙醇、 水、 氯仿的体积比30:8:160:2:150:3:1 步骤 （1） 中反应液 pH 值2.42.82.6 产品收率 （）95%93%96% 所得产品中 GM1 纯度 ( )73.172.178.4 说 明 书 CN 103087120 A 6