水凝胶干燥体、玻璃质凝胶膜干燥体及它们的制造方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103168099 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103168099 A *CN103168099A* (21)申请号 201180040850.9 (22)申请日 2011.08.25 2010-188887 2010.08.25 JP C12N 5/07(2006.01) A61L 27/00(2006.01) C12M 3/00(2006.01) (71)申请人 独立行政法人农业生物资源研究所 地址 日本茨城县 申请人 竹泽俊明 关东化学株式会社 (72)发明人 竹泽俊明 押方步 黑山浩之 泽口智哉 山口宏之 (74)专利代理机构 中科专利

2、商标代理有限责任 公司 11021 代理人 张玉玲 (54) 发明名称 水凝胶干燥体、 玻璃质凝胶膜干燥体及它们 的制造方法 (57) 摘要 一种制造玻璃质凝胶膜干燥体的方法， 其包 括以下的工序 ： (1) 在配置于基板上的与所期望 形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶， 使水 凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间 隙中流出的工序 ； (2) 从基板上除去壁面铸型的 工序 ； (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制 作玻璃化的水凝胶干燥体的工序 ； (4) 将水凝胶 干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序 ； 以及 (5) 使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水， 制作玻璃化的玻璃质

3、凝胶膜干燥体的工序。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.02.22 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2011/069191 2011.08.25 (87)PCT申请的公布数据 WO2012/026531 JA 2012.03.01 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 35 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书35页 附图10页 (10)申请公布号 CN 103168099 A CN 103168099 A *CN103168099A* 1/3 页 2 1. 一种玻璃质凝胶膜

4、干燥体， 其特征在于， 不具有不定形外周缘部。 2. 根据权利要求 1 所述的玻璃质凝胶膜干燥体， 其特征在于， 附着于基板。 3. 根据权利要求 1 所述的玻璃质凝胶膜干燥体， 其特征在于， 玻璃质凝胶膜干燥体与 能够剥离的薄膜重叠化。 4. 根据权利要求 3 所述的玻璃质凝胶膜干燥体， 其特征在于， 薄膜为石蜡膜。 5. 一种水凝胶干燥体， 其特征在于， 不具有不定形外周缘部。 6. 根据权利要求 5 所述的水凝胶干燥体， 其特征在于， 附着于基板。 7. 根据权利要求 5 所述的水凝胶干燥体， 其特征在于， 水凝胶干燥体与能够剥离的薄 膜重叠化。 8. 根据权利要求 7 所述的水凝胶干燥

5、体， 其特征在于， 薄膜为石蜡膜。 9. 一种玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 其是所期望形状的玻璃质凝胶 膜干燥体的制造方法， 包括以下的工序 ： (1) 在配置于基板上的与所述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶， 使水 凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出的工序 ； (2) 从基板上除去壁面铸型的工序 ； (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序 ； (4) 对水凝胶干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序 ； 以及 (5) 使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水， 制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体的工 序。 10. 根据权利要

6、求 9 所述的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工序 (1) 中， 向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。 11. 根据权利要求 9 所述的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工序 (1) 中， 将水凝胶内的游离水减少至 1/4 3/4 左右。 12. 根据权利要求 9 所述的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工序 (5) 中， 将玻璃质凝胶膜在能够剥离玻璃质凝胶膜干燥体的薄膜上进行玻璃化。 13. 根据权利要求 12 所述的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 薄膜为石 蜡膜。 14. 一种玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于，

7、其是能够成形为所期望形状的 玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 包括以下的工序 ： (1) 在配置于铺有能够剥离玻璃质凝胶膜干燥体的薄膜的基板上的、 任意形状的壁面 铸型内部保持水凝胶， 使水凝胶内的游离水的一部分从基板上的薄膜与壁面铸型的间隙中 流出的工序 ； (2) 从基板上除去壁面铸型的工序 ； (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序 ； (4) 将水凝胶干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序 ； (5) 使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水， 制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体的工 序。 15. 根据权利要求 14 所述的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特

8、征在于， 在所述工 序 (5) 之后， 包括 ： 权 利 要 求 书 CN 103168099 A 2 2/3 页 3 (6) 将与薄膜重叠化的玻璃质凝胶膜干燥体切断成所期望形状的工序。 16. 根据权利要求 15 所述的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工 序 (6) 之后， 包括将玻璃质凝胶膜干燥体从薄膜剥离的工序。 17. 根据权利要求 14 所述的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 薄膜为石 蜡膜。 18. 根据权利要求 14 所述的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工 序 (1) 中， 向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。 19. 根据权利

9、要求 14 所述的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工 序 (1) 中， 将水凝胶内的游离水减少至 1/4 3/4 左右。 20. 一种水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 其是所期望形状的水凝胶干燥体的制 造方法， 包括以下的工序 ： (1) 在配置于基板上的与所述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶， 使水 凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出的工序 ； (2) 从基板上除去壁面铸型的工序 ； (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序。 21. 根据权利要求 20 所述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述

10、工序 (1) 中， 向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。 22. 根据权利要求 20 所述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工序 (1) 中， 将水凝胶内的游离水减少至 1/4 3/4 左右。 23. 根据权利要求 20 所述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工序 (3) 中， 在能够剥离水凝胶干燥体的薄膜上进行玻璃化。 24. 根据权利要求 23 所述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 薄膜为石蜡膜。 25. 一种水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 其是能够成形为所期望形状的水凝胶 干燥体的制造方法， 包括以下的工序 ： (1) 在配置于铺有能够剥离水凝胶

11、干燥体的薄膜的基板上的、 任意形状的壁面铸型内 部保持水凝胶， 使水凝胶内的游离水的一部分从基板上的薄膜与壁面铸型的间隙中流出的 工序 ； (2) 从基板上除去壁面铸型的工序 ； (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序。 26.根据权利要求25所述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工序(3)之 后， 包括 (4) 将与薄膜重叠化的水凝胶干燥体切断成所期望形状的工序。 27.根据权利要求26所述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工序(4)之 后， 包括将水凝胶干燥体从薄膜剥离的工序。 28. 根据权利要求 25 所述的水凝胶干燥体的

12、制造方法， 其特征在于， 在所述工序 (1) 中， 向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。 29. 根据权利要求 25 所述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在所述工序 (1) 中， 将水凝胶内的游离水减少至 1/4 3/4 左右。 30. 根据权利要求 25 所述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 薄膜为石蜡膜。 权 利 要 求 书 CN 103168099 A 3 3/3 页 4 31. 一种层叠体， 其特征在于， 其是权利要求 1 所述的玻璃质凝胶膜干燥体进行重叠化 并一体化而得到的。 32. 一种构成角膜的主要实质的胶原的模仿物， 该模仿物使用了如下的层叠体， 所述层叠体是重

13、叠多张将玻璃质凝胶膜干燥体进行再水化而成的玻璃质凝胶膜而得 到的， 所述玻璃质凝胶膜干燥体是权利要求 1 所述的玻璃质凝胶膜干燥体， 以胶原作为原 料。 33. 一种构成角膜的主要实质的胶原的模仿物， 所述模仿物使用了如下的玻璃质凝胶 膜， 所述玻璃质凝胶膜是将玻璃质凝胶膜干燥体重叠化并一体化的层叠体进行再水化而 得到的， 所述玻璃质凝胶膜干燥体是权利要求 1 所述的玻璃质凝胶膜干燥体， 以胶原作为原 料。 权 利 要 求 书 CN 103168099 A 4 1/35 页 5 水凝胶干燥体、 玻璃质凝胶膜干燥体及它们的制造方法 技术领域 0001 本发明涉及不具有不定形外周缘部的水凝胶干燥体

14、、 玻璃质凝胶膜干燥体及它们 的制造方法。 背景技术 0002 在制药的研究中， 长久以来要求开发能够简便地构筑使用各种机能细胞来反映生 物体的 3 维培养模型的培养系统。特别是将胶原凝胶用于细胞的培养载体的 3 维培养技 术对于再构筑血管新生模型、 癌浸润模型、 上皮间充质模型等是有用的， 但还未达到广泛普 及。 0003 作为其理由， 认为以往的胶原凝胶由于由低密度的纤维构成所以柔软而难以处 理， 此外， 由于为不透明所以培养细胞的相位差显微镜观察不一定容易等。 0004 为了解决这样的问题， 本发明者确立了以下技术 ： 通过在低温下将赋予最适于凝 胶化 (gelation) 的盐浓度和氢

15、离子浓度 (pH) 的胶原的溶胶注入到培养皿内， 并进一步保 温在最适的温度而将胶原的溶胶凝胶化后， 通过在低温下使其充分干燥而不仅除去游离水 还慢慢地除去结合水而玻璃化 (vitrification)， 进一步进行再水化 (rehydration)， 从而 将胶原凝胶的物性以良好的再现性转换成强度和透明性优异的薄膜 ( 专利文献 1)。 0005 并且， 若为水凝胶则即使是胶原以外的成分的凝胶， 通过在玻璃化后进行再水化， 也能够将凝胶变换成稳定的新的物性状态， 所以将经由该玻璃化工序而制作的新的物性状 态的凝胶命名为玻璃质凝胶 (vitrigel)( 非专利文献 1)。 0006 特别是迄

16、今为止开发的胶原玻璃质凝胶薄膜具有以下特征 ： 其是与生物体内的结 缔组织相匹配的高密度的胶原纤维彼此缠绕而成的厚度数十微米的透明的薄的膜， 具有优 异的蛋白质透过性及强度。 此外， 由于能够在制作工序的胶原溶胶中添加各种物质， 所以能 够使胶原玻璃质凝胶薄膜反映出所添加的物质的特性。进而， 例如包埋有环状尼龙膜支撑 体的胶原玻璃质凝胶薄膜能够以镊子容易地进行处理。 0007 并且， 本发明者将关于该胶原玻璃质凝胶薄膜的技术进一步发展， 还提出了用于 提高胶原玻璃质凝胶薄膜的透明性、 制作再现性的技术 ( 专利文献 2)、 将胶原玻璃质凝胶 制作成丝状或管状的形状而非膜形状的技术 ( 专利文献

17、 3) 等。 0008 现有技术文献 0009 专利文献 0010 专利文献 1 ： 日本特开平 8-228768 号公报 0011 专利文献 2 ： WO2005/014774 0012 专利文献 3 ： 日本特开 2007-204881 号公报 0013 非专利文献 0014 非专利文献 1 ： Takezawa T， et al.， Cell Transplant.13 ： 463-473， 2004 0015 非专利文献 2 ： Takezawa T， et al.， Cells Tissues Organs185 ： 237-241， 2007 0016 非专利文献 3 ： Take

18、zawa T， et al.， J.Biotechnol.131 ： 76-83， 2007 说 明 书 CN 103168099 A 5 2/35 页 6 0017 然而， 在以往的胶原玻璃质凝胶薄膜的制造方法中， 例如如图 3 中例示的那样， 通 过按照胶原玻璃质凝胶薄膜达到任意的厚度的方式， 在塑料制的培养皿中注入规定量的胶 原溶胶而凝胶化， 并进行利用干燥的玻璃化及再水化来制造。 0018 因此， 通过干燥而玻璃化的胶原凝胶干燥体仅能够以附着在培养皿的底面和壁面 上的状态来制作。因此， 在进行再水化时， 存在伴随来自壁面的胶原玻璃质凝胶薄膜的问 题。 在伴随来自壁面的胶原玻璃质凝胶薄膜

19、的情况下， 胶原玻璃质凝胶薄膜的处理很难， 为 了作为细胞的 3 维培养载体利用， 需要用于除去不必要的来自壁面的胶原玻璃质凝胶薄膜 部分的作业， 但由于胶原玻璃质凝胶薄膜含有水分， 所以该切断加工作业并不容易。此外， 虽然通过改变注入胶原溶胶的容器的形状， 能够在一定程度上控制所制的胶原玻璃质凝胶 薄膜的形状， 但由于伴随来自壁面的胶原玻璃质凝胶薄膜， 所以为了准确地加工成微细形 状需要对含有水分的胶原玻璃质凝胶薄膜进行切断加工， 并不容易。 并且， 为了迅速且大量 生产任意形状的胶原玻璃质凝胶薄膜作为产品， 克服这样繁杂的作业是个大课题。特别是 关于包埋有作为细胞的 3 维培养载体利用的环

20、状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶薄膜， 需 要微细加工成仅在培养容器的底面上附着胶原玻璃质凝胶薄膜、 且在必要时能够用镊子等 容易地从培养容器的底面剥离的形状、 即胶原玻璃质凝胶薄膜不多余地伸出到环状尼龙膜 支撑体的外周部的形状。 0019 此外， 在以往的胶原玻璃质凝胶薄膜的制造方法中， 由于作为玻璃化的第 1 工序 的凝胶内的游离水的除去通过利用风干的自然干燥来进行， 所以通常需要 2 天以上的时 间。 0020 并且， 在迄今为止的技术中， 关于胶原玻璃质凝胶薄膜的含胶原量和厚度的控制， 通过每培养皿的单位面积 (1.0cm2) 注入 0.04 0.4ml 的 0.25胶原溶胶进行凝胶化、

21、 玻 璃化及再水化， 从而能够制作每单位面积(1.0cm2)含有100g1.0mg胶原的胶原玻璃质 凝胶薄膜， 通过进一步调节玻璃化的期间， 从而能够将胶原玻璃质凝胶薄膜的厚度调整为 数 m 数百 m 左右。例如， 在每培养皿的单位面积 (1.0cm2) 注入 0.2ml 的 0.25胶原 溶胶而凝胶化后进行 2 周以上玻璃化后进行再水化的情况下， 能够制作厚度约为 15m 的 胶原玻璃质凝胶薄膜， 此外， 在同样地注入0.4ml进行凝胶化后进行1周左右玻璃化后进行 再水化的情况下， 能够制作厚度约为 120m 的胶原玻璃质凝胶薄膜 ( 非专利文献 2)。 0021 然而认为， 为了调制不为薄

22、膜状、 例如厚度为 1mm 以上的胶原玻璃质凝胶膜， 每单 位面积 (1.0cm2) 至少需要注入 3.3ml 以上的 0.25胶原溶胶。但是， 由于该量在原有的培 养皿中溢出， 所以必须准备特殊的容器。进而， 在进行凝胶化后， 为了使凝胶内的游离水自 然干燥， 要花费 10 天以上。因此， 为了迅速且大量地生产胶原玻璃质凝胶膜， 缩短除去凝胶 内的大量的游离水的时间是重要的课题。 0022 进而， 在以往的制造方法中， 由于不能够将胶原玻璃质凝胶薄膜的干燥体从培养 皿上剥离， 所以胶原玻璃质凝胶薄膜的干燥体以附着在培养皿的底面和壁面上的状态被制 作。因此， 无法将胶原玻璃质凝胶薄膜的干燥体以

23、膜状态自由地进行处理。因此， 也不能够 将胶原玻璃质凝胶薄膜的干燥体切断成任意的微细形状。 发明内容 0023 发明所要解决的问题 说 明 书 CN 103168099 A 6 3/35 页 7 0024 本发明鉴于以上那样的情况而完成， 其课题在于提供具有所期望的形状、 实用性、 处理性等特性优异的玻璃质凝胶膜干燥体及该玻璃质凝胶膜干燥体的前阶段的水凝胶干 燥体、 以及用于迅速且大量生产该玻璃质凝胶膜干燥体及水凝胶干燥体的方法。 0025 用于解决问题的方法 0026 本发明为了解决上述的课题， 提供以下的玻璃质凝胶膜干燥体、 水凝胶干燥体及 它们的制造方法。 0027 一种玻璃质凝胶膜干燥

24、体， 其特征在于， 不具有不定形外周缘部。 0028 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体， 其特征在于， 附着于基板。 0029 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体， 其特征在于， 玻璃质凝胶膜干燥体与能 够剥离的薄膜重叠化。 0030 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体， 其特征在于， 薄膜为石蜡膜。 0031 一种水凝胶干燥体， 其特征在于， 不具有不定形外周缘部。 0032 根据上述 的水凝胶干燥体， 其特征在于， 附着于基板。 0033 根据上述 的水凝胶干燥体， 其特征在于， 水凝胶干燥体与能够剥离的薄膜 重叠化。 0034 根据上述 的水凝胶干燥体， 其特征在于， 薄膜为石蜡膜。 0035 一

25、种玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 其是所期望形状的玻璃质 凝胶膜干燥体的制造方法， 包括以下的工序 ： 0036 (1) 在配置于基板上的与上述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶， 使水凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出的工序 ； 0037 (2) 从基板上除去壁面铸型的工序 ； 0038 (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序 ； 0039 (4) 将水凝胶干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序 ； 以及 0040 (5) 使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水， 制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体 的工序。 0041 根据

26、上述 的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序 (1) 中， 向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。 0042 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序 (1) 中， 将水凝胶内的游离水减少至 1/4 3/4 左右。 0043 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序 (5) 中， 将玻璃质凝胶膜在能够剥离玻璃质凝胶膜干燥体的薄膜上进行玻璃化。 0044 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 薄膜为石蜡 膜。 0045 一种玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 其是能够成形为所期望 形状的玻璃质凝

27、胶膜干燥体的制造方法， 包括以下的工序 ： 0046 (1) 在配置于铺有能够剥离玻璃质凝胶膜干燥体的薄膜的基板上的、 任意形状的 壁面铸型内部保持水凝胶， 使水凝胶内的游离水的一部分从基板上的薄膜与壁面铸型的间 隙中流出的工序 ； 0047 (2) 从基板上除去壁面铸型的工序 ； 说 明 书 CN 103168099 A 7 4/35 页 8 0048 (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序 ； 0049 (4) 将水凝胶干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序 ； 0050 (5) 使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水， 制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体 的

28、工序。 0051 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序 (5) 之后， 包括 ： 0052 (6) 将与薄膜重叠化的玻璃质凝胶膜干燥体切断成所期望形状的工序。 0053 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序 (6) 之后， 包括从薄膜上剥离玻璃质凝胶膜干燥体的工序。 0054 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 薄膜为石蜡 膜。 0055 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序 (1) 中， 向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。 0056 根据上述 的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法，

29、 其特征在于， 在上述工序 (1) 中， 将水凝胶内的游离水减少至 1/4 3/4 左右。 0057 一种水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 其是所期望形状的水凝胶干燥 体的制造方法， 包括以下的工序 ： 0058 (1) 在配置于基板上的与上述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶， 使水凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出的工序 ； 0059 (2) 从基板上除去壁面铸型的工序 ； 0060 (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序。 0061 根据上述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序(1)中， 向壁面铸型内部的水

30、凝胶导入支撑体。 0062 根据上述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序(1)中， 将水凝胶内的游离水减少至 1/4 3/4 左右。 0063 根据上述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序(3)中， 在能够剥离水凝胶干燥体的薄膜上进行玻璃化。 0064 根据上述 的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 薄膜为石蜡膜。 0065 一种水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 其是能够成形为所期望形状的 水凝胶干燥体的制造方法， 包括以下的工序 ： 0066 (1) 在配置于铺有能够剥离水凝胶干燥体的薄膜的基板上的、 任意形状的壁面铸 型内部保持水凝胶， 使水凝胶内

31、的游离水的一部分从基板上的薄膜与壁面铸型的间隙中流 出的工序 ； 0067 (2) 从基板上除去壁面铸型的工序 ； 0068 (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序。 0069 根据上述 的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序 (3) 之 后， 包括 ： 0070 (4) 将与薄膜重叠化的水凝胶干燥体切断成所期望形状的工序。 0071 根据上述 的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序 (4) 之 说 明 书 CN 103168099 A 8 5/35 页 9 后， 包括从薄膜上剥离水凝胶干燥体的工序。 0072 根据上述的水凝胶干

32、燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序(1)中， 向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。 0073 根据上述的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 在上述工序(1)中， 将水凝胶内的游离水减少至 1/4 3/4 左右。 0074 根据上述 的水凝胶干燥体的制造方法， 其特征在于， 薄膜为石蜡膜。 0075 一种层叠体， 其特征在于， 其是上述 的玻璃质凝胶膜干燥体重叠化、 并一 体化而得到的。 0076 一种构成角膜的主要实质的胶原的模仿物， 所述模仿物为如下的层叠体， 所 述层叠体为重叠多张将玻璃质凝胶膜干燥体进行再水化而成的玻璃质凝胶膜而得到的， 所 述玻璃质凝胶膜干燥体为上述 的玻璃质

33、凝胶膜干燥体， 以胶原作为原料。 0077 一种构成角膜的主要实质的胶原的模仿物， 所述模仿物为如下玻璃质凝胶 膜， 玻璃质凝胶膜为将该玻璃质凝胶膜干燥体重叠化并一体化的层叠体进行再水化而得到 的， 所述玻璃质凝胶膜为上述 的玻璃质凝胶膜干燥体， 以胶原作为原料。 0078 发明的效果 0079 根据本发明， 能够迅速地大量生产不具有来自壁面的不定形外周缘部的所期望形 状的水凝胶干燥体及玻璃质凝胶膜干燥体。 0080 此外， 通过将玻璃质凝胶膜干燥体或水凝胶干燥体在能够剥离的薄膜上重叠化， 可以使玻璃质凝胶膜干燥体或水凝胶干燥体从薄膜上剥离， 以膜状态自由地进行处理。进 而， 除了壁面铸型的形

34、状以外， 能够将已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体或水凝胶干燥体切 断加工成任意的形状。 附图说明 0081 图 1 是例示出本发明的玻璃质凝胶膜的制造方法的一个实施方式的流程图。 0082 图 2 是例示出本发明的玻璃质凝胶膜的制造方法中使用的壁面铸型的立体图。 0083 图 3 是例示出以往的玻璃质凝胶薄膜的制造方法的一个实施方式的流程图。 0084 图 4 是例示出不具有不定形外周缘部的胶原玻璃质凝胶膜的图。 0085 图 5 是例示出附带有不定形外周缘部的胶原玻璃质凝胶膜的图。 0086 图 6 是例示出将吸附在石蜡膜上的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的一部分从石蜡膜 容易地剥离的状态的图。 008

35、7 图 7 是例示出将吸附在石蜡膜上的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干 燥体的一部分从石蜡膜容易地剥离的状态的图。 0088 图 8 是例示出在 1 个基板上设置 4 个壁面铸型并在壁面铸型内部注入胶原溶胶的 状态的图。 0089 图9是在图8的形态中通过使壁面铸型上下稍微移动而解除胶原凝胶与壁面铸型 间的粘接的状态的图。 0090 图 10 是例示出在图 8 的形态中从基板上除去壁面铸型的形态的图。 0091 图 11 的 (A) 是将实施例 8 中制作的含有 FITC 标记山羊抗小鼠抗体的玻璃质凝胶 膜干燥体的层叠体用PBS进行再水化， 并用荧光显微镜(Nikon)观察的图。 (B)

36、是观察通过 说 明 书 CN 103168099 A 9 6/35 页 10 实施例 6 的方法制作的层叠体的图。 0092 图 12 是表示实施例 8 中制作的玻璃质凝胶膜中的 FITC 标记山羊抗小鼠抗体的局 部存在的玻璃质凝胶膜的垂直剖面图。 0093 图 13 是将实施例 9 中制作的含有琼脂糖的玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体用 PBS 进行再水化， 并用荧光显微镜观察的图。 0094 图 14 是对于在增加所重叠的玻璃质凝胶膜的张数的情况下没有被一体化的层叠 体表示吸光度的变化的图。 0095 图 15 是关于重叠 10 张的玻璃质凝胶膜的没有被一体化的层叠体表示透明性的 图。 0096

37、 图 16 是表示通过插入 9 张的玻璃质凝胶膜而一体化的层叠体 ( 来自 0.25胶原 溶胶 1.0ml+0.25胶原溶胶 2.0ml9 层 +0.25胶原溶胶 1.0ml) 的透明性的图。 具体实施方式 0097 本发明的水凝胶干燥体的制造方法的第 1 实施方式是所期望形状的水凝胶干燥 体的制造方法， 包括以下的工序 ： 0098 (1) 在配置于基板上的与上述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶， 使水凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出的工序 ； 0099 (2) 从基板上除去壁面铸型的工序 ； 以及 0100 (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化

38、的水凝胶干燥体的工序。 0101 进而， 本发明的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法的第 1 实施方式是所期望形状的 玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法， 紧接着上述工序 (3)， 包括 ： 0102 (4) 将水凝胶干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序 ； 以及 0103 (5) 使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水， 制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体 的工序。 0104 本发明中，“水凝胶” 是指高分子通过化学键合而采取网眼状结构， 并在该网眼中 保有大量水的物质， 更具体而言， 是指在天然物来源的高分子或合成高分子的人工原料中 导入交联使其凝胶化而成的物质。 0105 此外，“水凝胶干燥体” 是指从

39、水凝胶中除去游离水而玻璃化的物质。进而，“玻璃 质凝胶膜” 是指使该水凝胶干燥体再水化而成的物质。另外， 如上所述，“能够经由玻璃化 (vitrification) 的工序而制作的新的稳定状态的凝胶” 被本发明者命名为 “玻璃质凝胶 (vitrigel)” 。并且，“玻璃质凝胶膜干燥体” 是指将该玻璃质凝胶再次玻璃化而成的物质。 玻璃质凝胶膜干燥体通过在必要时进行再水化， 可以得到玻璃质凝胶膜。 0106 以下， 对各工序进行说明。图 1 是例示出本发明的玻璃质凝胶膜的制造方法的一 个实施方式的流程图。 0107 工序 (1) ： 在配置于基板上的与上述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水

40、凝胶， 使水凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出。 0108 基板和壁面铸型可以适当使用70乙醇或可耐受利用高压釜等的灭菌的材料。 具 体而言， 可例示出聚苯乙烯或丙烯酸树脂等塑料、 玻璃、 或不锈钢等。 0109 第 1 实施方式中， 壁面铸型可以制成不具有上表面、 底面的筒状的框体， 壁面铸型 说 明 书 CN 103168099 A 10 7/35 页 11 的形状可以设计成与所期望的玻璃质凝胶膜的形状相同的形状。 具体而言， 例如， 在制作圆 形的玻璃质凝胶膜的情况下， 如图 2 中例示的那样， 可以使用壁面 ( 框 ) 为环状的壁面铸型 ( 圆筒状 )。此外， 在制作矩

41、形的玻璃质凝胶膜的情况下， 可以制成壁面 ( 框 ) 为矩形状的 壁面铸型 ( 方筒状 )。 0110 并且， 若在基板上配置壁面铸型， 则两者处于抵接状态， 但形成物理上利用基板和 壁面铸型的表面的凹凸能够使游离水流出的程度的很小的间隙。本发明中， 可以根据所期 望的数目的玻璃质凝胶膜， 在基板上配置多个壁面铸型。 0111 本发明中， 作为用于制作水凝胶的原料的来自天然物的高分子例如可例示出胶 原、 由小鼠 EHS 肿瘤提取物再构成的基底膜成分 ( 商品名 ： Matrigel)、 明胶、 琼脂、 琼脂糖、 纤维蛋白、 糖胺聚糖、 透明质酸、 蛋白聚糖等。 可以选择最适于各自的凝胶化的盐等

42、成分、 其 浓度、 pH 等来制作水凝胶。 0112 此外， 作为用于制作水凝胶的合成高分子， 可列举出聚丙烯酰胺、 聚乙烯醇、 甲基 纤维素、 聚环氧乙烷、 聚 ( 甲基丙烯酸树脂 2- 羟基乙酯 )/ 聚己内酯等。此外， 也可以使用 2 种以上这些高分子来制作水凝胶。水凝胶的量可以考虑所制作的玻璃质凝胶膜的厚度来 调节。 0113 其中， 水凝胶的原料优选胶原， 在使用胶原凝胶的情况下， 可以使用将胶原溶胶注 入配置在基板上的壁面铸型中并用孵化器凝胶化而成的物质。图 1 中， 作为水凝胶的原料， 例示出胶原溶胶。 0114 以使用胶原溶胶的情况为例进行说明， 胶原溶胶可以用生理盐水、 PB

43、S(Phosphate Buffered Saline ： 磷酸盐缓冲盐水 )、 HBSS(Hank s Balanced Salt Solution ： 汉克斯平 衡盐溶液 )、 基础培养液、 无血清培养液、 或含血清的培养液等调制成具有最适的盐浓度的 溶液。此外， 胶原凝胶化时的溶液的 pH 优选为 6 8 左右。 0115 这里， 胶原溶胶的调制期望在 4下进行。之后， 凝胶化时的保温必须为比依赖于 所使用的胶原的动物种类的胶原的变性温度低的温度， 但一般可以保温于在 37以下的温 度下能够以数分钟数十分钟凝胶化的温度下进行。 0116 此外， 胶原溶胶若胶原的浓度达到 0.2以下则过于

44、稀薄而凝胶化弱， 若达到 0.3以上则过于浓稠而难以均一化。 因此， 胶原溶胶的胶原的浓度优选为0.20.3， 更 优选为 0.25左右。 0117 将这样调整的胶原溶胶注入到壁面铸型内部。由于上述浓度的胶原溶胶具有粘 性， 所以若将胶原溶胶注入到壁面铸型内部并迅速地保温， 则胶原溶胶不会从基板与壁面 铸型的间隙中流出， 能够在数分钟以内进行凝胶化。 0118 并且， 所形成的胶原凝胶与基板和壁面铸型密合， 但通过放置规定的时间， 随着时 间的经过， 胶原凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙向壁面铸型的外侧流 出。 0119 这里， 通过使壁面铸型上下等稍微移动， 从而凝胶与壁面铸型间

45、的粘接被解除而 产生很小的间隙， 所以能够促进游离水的流出。 0120 进而， 例如， 在每单位面积 (1.0cm2) 注入的 0.25胶原溶胶的量为 0.4ml 以上的 情况下， 期望在将已凝胶化的胶原凝胶内的游离水减少至1/42/3左右之前， 经时地除去 从基板与壁面铸型的间隙流出的游离水。 由此， 由于凝胶的胶原浓度变成0.3751.0左 说 明 书 CN 103168099 A 11 8/35 页 12 右， 所以即使除去壁面铸型， 也可以达到凝胶形状不变形的凝胶强度。另外， 之后可以在也 伴随流出到基板上的游离水的状态下使残留在凝胶内的游离水自然干燥并除去而玻璃化。 这里， 从迅速大

46、量生产的观点出发， 将胶原凝胶内的游离水减少至1/42/3左右的时间期 望为 2 8 小时。进而， 之后使残留在凝胶内的游离水自然干燥而完全除去的时间期望为 48小时以内。 因此， 每单位面积(1.0cm2)注入的0.25胶原溶胶的量期望为0.12.4ml， 其结果是， 可以制作每单位面积 (1.0cm2) 含有 250g 6mg 胶原的胶原玻璃质凝胶膜。 0121 另外， 作为制作每单位面积含有更多胶原的胶原玻璃质凝胶膜的方法， 可以采用 以下的 2 种方法。第 1 方法是在已经制作的胶原玻璃质凝胶膜或其干燥体上重叠胶原溶胶 而进行凝胶化、 玻璃化及再水化的方法。通过重复该方法， 可得到胶原

47、玻璃质凝胶膜重叠 化了的层叠体， 能够制作任意厚度的胶原玻璃质凝胶膜 ( 层叠体 )。此外， 第 2 方法是在胶 原溶胶内包埋已经制作的胶原玻璃质凝胶膜或其干燥体进行凝胶化、 玻璃化及再水化的方 法。 该方法中， 可得到以包埋有任意张数的胶原玻璃质凝胶膜的状态重叠化的层叠体， 能够 制作任意的厚度的胶原玻璃质凝胶膜。另外， 也可以在第 1 方法中用于重叠的溶胶及第 2 方法中用于包埋的溶胶中使用胶原以外的成分， 制作表里或层状中成分不同的玻璃质凝胶 膜。 0122 此外， 可以在壁面铸型的内部的水溶胶中导入支撑体。 例如， 支撑体可例示出尼龙 膜、 金属丝、 棉制薄纱、 蚕丝、 其它的织成体、

48、 生物体吸收性材料等， 可以使用与壁面铸型的 内部的形状对应的支撑体。优选的是， 在壁面铸型为环状的情况下， 支撑体可以制成如图 1 中例示的那样的具有与壁面铸型的内径大致相等的外径的环状尼龙膜。 通过在溶胶中导入 支撑体， 玻璃质凝胶膜的强度或形状保持能力提高， 处理性、 便利性提高。 例如， 通过导入比 圆形的壁面铸型的直径短 1.0mm 左右的外圆直径的环状尼龙膜支撑体， 可以制作可用镊子 容易地处理的玻璃质凝胶膜。 0123 工序 (2) 从基板上除去壁面铸型。 0124 在基板上留下水凝胶， 去掉壁面铸型。 水凝胶由于游离水流出， 所以在基板上不会 发生变形等， 可以维持保持于壁面铸型中的形状。 0125 工序 (3) 使水凝胶干燥而除去残留的游离水， 制作已玻璃化的水凝胶干燥体。 0126 根据需要， 使水凝胶移动至最终想要玻璃化的容器内后， 通过干燥， 完全地除去水 凝胶内的游离水而玻璃化。 例如， 通过使水凝胶移动到能够剥离水凝胶干燥体的薄膜上， 可 以将所制作的水凝胶干燥体从薄膜上剥离。 此外， 这种情况下， 也可以在薄膜上将水凝胶干 燥体成形为所期望的形状。作为薄膜， 可例示出石蜡膜、 莎纶包装膜 (Saran Wrap)、 乙烯树 脂等非吸水性薄膜， 特别优选石蜡膜。 0127 越延长该玻璃化工序的期间， 在再水化时越能够得到透明度、 强度