一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103145825 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103145825 A *CN103145825A* (21)申请号 201310082500.X (22)申请日 2013.03.14 C07K 14/47(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (71)申请人 南京化工职业技术学院 地址 210048 江苏省南京市大厂葛关路 625 号 申请人 马鞍山汇智生物技术有限公司 (72)发明人 李冰峰 刘练 管增东 余利灯 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 李晓峰 (54) 发明名称

2、一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种脾脏铁蛋白提取纯化的方 法， 将动物脾脏绞碎， 溶剂提取， 热变除杂， 氯化镁 或氯化钙盐除杂， 提取液浓缩， 粗品沉淀， 粗品结 晶。本发明所用方法既节省了生产成本又缩短了 生产周期， 成本低， 提取料液量小， 加硫酸铵少， 适 合于生产的规模扩大化。并且铁蛋白的提取率有 显著提高， 而且所用辅料部分还可收。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103145825 A C

3、N 103145825 A *CN103145825A* 1/1 页 2 1. 一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于将动物脾脏绞碎， 溶剂提取， 热变除 杂， 氯化镁或氯化钙盐除杂， 提取液浓缩， 粗品沉淀， 粗品结晶。 2. 根据权利要求 1 所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于该方法具体包括以 下按步骤 ： 1） 将动物脾脏粉碎成匀浆 ； 2） 将所述的匀浆与水混合， 并再粉碎以便于铁蛋白的溶出 ； 3） 将步骤 2） 中再粉碎后的匀浆加热至 60 85， 立即降温至 25以下 ； 4） 将步骤 3） 所得匀浆加入 CaCl2或 MgCl2除杂得提取液 ； 5） 将步骤 4）

4、 所得提取液离心后取上清液超滤浓缩后得浓缩液 ； 6） 将步骤 5） 所得浓缩液中加丙酮进行分级沉淀铁蛋白得粗品铁蛋白， 或者加硫酸铵沉 淀铁蛋白得粗品铁蛋白 ； 7） 将步骤 6） 所得的粗品铁蛋白用水或 / 和硫酸铵溶液溶解得粗品铁蛋白溶解液并用 硫酸镉结晶， 得精品铁蛋白。 3.根据权利要求2所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤1） 中将动物脾 脏绞碎后用胶体磨粉碎至粒度 250m 的匀浆。 4.根据权利要求2所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤2） 中将所述的 匀浆与水混合并用胶体磨再粉碎 12 遍。 5.根据权利要求2所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在

5、于步骤4） 中氯化镁或 氯化钙的添加量为匀浆的 1%5%。 6.根据权利要求2所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤5） 中所述的上 清液经超滤浓缩至原体积的 1/21/6。 7.根据权利要求2所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤6） 浓缩液中加 丙酮进行分级沉淀， 分级沉淀的过程为 ：（1） 初沉 ： 向浓缩液中加入丙酮得初沉溶液， 静置， 离心留上清液 ；（2） 复沉 ： 向上清液中加丙酮得复沉溶液， 离心得粗品铁蛋白。 8. 根据权利要求 7 所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于初沉时所述初 沉溶液中丙酮的体积百分浓度为 5%18%， 复沉时所述复沉溶液中丙

6、酮的体积百分浓度为 52%69%。 9.根据权利要求2所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤6） 浓缩液中加 硫酸铵沉淀铁蛋白时， 硫酸铵的添加量为浓缩液的 30%40%， 优选为 35%。 10. 根据权利要求 2 所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤 7） 中用来溶 解粗品铁蛋白的硫酸铵溶液的质量百分浓度为 0.51.5%， 优选为 1%， 硫酸镉的添加量为粗 品铁蛋白溶解液的 2%10%， 优选为 5%。 权 利 要 求 书 CN 103145825 A 2 1/3 页 3 一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法 技术领域 ： 0001 本发明属生物提取领域， 具体涉及一种脾

7、脏铁蛋白提取纯化的方法。 背景技术 ： 0002 铁蛋白是一种含铁的蛋白质， 具有电子致密特点， 可对细胞抗原进行精确的定位 且在电镜下可见。利用抗原与抗体特异性结合产生微量沉淀的原理， 对组织细胞内的抗原 和抗体进行超微结构鉴定和定位。因此铁蛋白在医学、 生物学研究方面有着广泛的前途。 0003 铁蛋白一般来自动物， 以肝、 脾含量较高， 其中马脾脏含量最高， 因而商品铁蛋白 主要从马脾脏中获得的。 0004 传统的提取的方法主要是取新鲜马脾用组织匀浆机粉碎， 加水提取， 热变除杂， 去 油脂， 硫酸铵沉淀， 粗品透析除盐， 硫酸镉结晶。整个工艺提取周期长， 成本高。特别是组织 匀浆机处理效

8、率比较低， 加热后保温使很多铁蛋白变性失活， 提取料液量大， 加硫酸铵多且 添加过程易使铁蛋白失活， 透析处理耗时更不适合于生产的规模扩大化。 发明内容 ： 0005 本发明提供一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 该方法解决传统工艺周期长、 成本 高的问题。 0006 本发明的目的通过以下技术方案实现 ： 0007 一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于将动物脾脏绞碎， 溶剂提取， 热变除杂， 氯化镁或氯化钙盐除杂， 提取液浓缩， 粗品沉淀， 粗品结晶。 0008 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于该方法具体包括以下按步骤 ： 0009 1） 将动物脾脏粉碎成匀浆 ； 0010 2） 将所述

9、的匀浆与水混合， 并再粉碎以便于铁蛋白的溶出 ； 0011 3） 将步骤 2） 中再粉碎后的匀浆加热至 60 85， 立即降温至 25以下 ； 0012 4） 将步骤 3） 所得匀浆加入 CaCl2或 MgCl2除杂得提取液 ； 0013 5） 将步骤 4） 所得提取液离心后取上清液超滤浓缩后得浓缩液 ； 0014 6） 将步骤 5） 所得浓缩液中加丙酮进行分级沉淀铁蛋白得粗品铁蛋白， 或者加硫酸 铵沉淀铁蛋白得粗品铁蛋白 ； 0015 7） 将步骤 6） 所得的粗品铁蛋白用水或 / 和硫酸铵溶液溶解得粗品铁蛋白溶解液 并用硫酸镉结晶， 得精品铁蛋白。 可以用水溶解粗品铁蛋白并用硫酸镉结晶，

10、重复进行几次 得到精品铁蛋白 ； 也可以用硫酸铵溶液溶解粗品铁蛋白并用硫酸镉结晶， 重复进行几次得 到精品铁蛋白 ； 或者用水和硫酸铵溶液结合使用溶解粗品铁蛋白并用硫酸镉结晶， 得精品 铁蛋白。 0016 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 1） 中将动物脾脏绞碎后用胶体磨 粉碎至粒度 250m 的匀浆。 0017 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 2） 中将所述的匀浆与水混合并用 说 明 书 CN 103145825 A 3 2/3 页 4 胶体磨再粉碎 12 遍。 0018 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 4） 中氯化镁或氯化钙的添加量为 匀浆的 1%5

11、%（w/v， 即每 100ml 匀浆中加入 15g 氯化镁或氯化钙） 。 0019 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 5） 中所述的上清液经超滤浓缩至 原体积的 1/21/6。 0020 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 6） 浓缩液中加丙酮进行分级沉 淀， 分级沉淀的过程为 ：（1） 初沉 ： 向浓缩液中加入丙酮得初沉溶液， 静置， 离心留上清液 ； （2） 复沉 ： 向上清液中加丙酮得复沉溶液， 离心得粗品铁蛋白。 0021 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于初沉时所述初沉溶液中丙酮的体积百 分浓度为 5%18%， 复沉时所述复沉溶液中丙酮的体积百分浓度为 5

12、2%69%。 0022 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 6） 浓缩液中加硫酸铵沉淀铁蛋白 时， 硫酸铵的添加量为浓缩液的 30%40%（w/v， 即每 100ml 浓缩液中加入 3040g 硫酸铵） ， 优选为 35%。 0023 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 7） 中用来溶解粗品铁蛋白的硫 酸铵溶液的质量百分浓度为 0.51.5%， 优选为 1%， 硫酸镉的添加量为粗品铁蛋白溶解液的 2%10% （w/v， 每 100ml 粗品铁蛋白溶解液中加入 210g 硫酸镉） ， 优选为 5% 。 0024 本发明的有益效果 ： 0025 本发明所用方法既节省了生产成本又

13、缩短了生产周期， 成本低， 提取料液量小， 加 硫酸铵少， 适合于生产的规模扩大化。 并且铁蛋白的提取率有显著提高 （与现有方法相比铁 蛋白的提取率可提高约 20% 左右） ， 而且所用辅料部分还可收。 附图说明 ： 0026 图 1 为本发明实施例方法所得精品铁蛋白经电泳检测的铁蛋白活性铁染色。 0027 图 2 为铁蛋白活性考马斯亮蓝染色。 0028 图 3 为铁蛋白 SDS-page 变性电泳。 具体实施方式 : 0029 以下通过实施实例对本发明作进一步说明， 但其并不限制本发明的保护范围。 0030 实施例 1 ： 0031 取马脾脏 2.7 kg， 绞碎后用胶体磨粉碎至粒度为 25

14、0m 的匀浆， 加水 4.0 L 后 继续胶体磨匀浆 2 遍以便于铁蛋白溶出， 加热至 75， 立即降温至 20以下， 得匀浆约 6.2 L， 加入氯化镁 186 g 除杂得提取液， 将提取液离心得上清液 4.0 L， 将上清液 100KD 超滤浓 缩至 1400 ml 得浓缩液， 向浓缩液中加入硫酸铵固体 490 g（硫酸铵的添加量为浓缩液的 35%， 即每 100ml 浓缩液中加入 35g 硫酸铵） ， 静置， 离心得粗品铁蛋白 121.5 g， 将粗品铁蛋 白用 1600ml 水溶解得粗品铁蛋白溶解液， 加硫酸镉 （硫酸镉添加量为粗品铁蛋白溶解液的 5%， 即每 100ml 粗品铁蛋白溶

15、解液中加入 5g 硫酸镉） ， 静置结晶， 结晶完全后离心取晶体以 质量百分浓度为 1% 的硫酸铵水溶液溶解， 加硫酸镉结晶 2 次， 得精品铁蛋白 5.6 g（湿重， 约含水 50%） ， 以质量百分浓度为 1% 硫酸铵溶液反复溶解后加硫酸铵固体沉淀除镉后加半 饱和硫酸铵溶液保存。 说 明 书 CN 103145825 A 4 3/3 页 5 0032 实施例 2 ： 0033 取马脾脏2.7 kg， 绞碎后用胶体磨粉碎至粒度为250m的匀浆， 加水4.0 L后继 续胶体磨匀浆2遍以便于铁蛋白溶出， 加热至80， 立即降温至20以下， 得匀浆约6.4 L， 加入氯化钙 128g 除杂得提取液

16、， 将提取液离心得上清液 4.2 L， 将上清液 100 KD 超滤浓缩 至1100 ml得浓缩液 ； 向浓缩液中加丙酮进行分级沉淀， 分级沉淀的过程为 ：（1） 初沉 ： 向浓 缩液中加入丙酮 150 ml 得初沉溶液， 静置， 离心留上清液 1250ml ；（2） 复沉 ： 向上清液中加 丙酮 1500 ml 得复沉溶液， 离心得粗品铁蛋白。将粗品铁蛋白以 1700 ml 质量百分浓度为 1% 的硫酸铵水溶液溶解得粗品铁蛋白溶解液， 加硫酸镉 （硫酸镉添加量为粗品铁蛋白溶解 液的 5%， 即每 100ml 粗品铁蛋白溶解液中加入 5g 硫酸镉） ， 静置结晶， 结晶完全后离心取晶 体以质量

17、百分浓度为 1% 的硫酸铵水溶液溶解， 加硫酸镉结晶 2 次， 得精品铁蛋白 5.5 g （湿 重， 约含水 50%） ， 以质量百分浓度为 1% 硫酸铵溶液反复溶解后加硫酸铵固体沉淀除镉后加 半饱和硫酸铵溶液保存。 0034 对比实施例 ： 0035 取马脾脏 2.7 kg， 绞碎后用胶体磨粉碎至粒度为 250m 的匀浆， 加水 4.0 L， 加 热至 65， 降温至 20以下， 得匀浆约 4.4 L， 离心得上清液 3.1 L， 向上清液中加硫酸铵 1085 g， 静置， 离心得粗品铁蛋白 83.2 g， 用 1200 ml 水溶解得粗品铁蛋白溶解液， 加硫酸 镉 （硫酸镉添加量为粗品铁蛋

18、白溶解液的 5%， 即每 100ml 粗品铁蛋白溶解液中加入 5g 硫酸 镉） ， 静置结晶， 结晶完全后离心取晶体以质量百分浓度为 1% 的硫酸铵水溶液溶解， 加硫酸 镉结晶 2 次， 得精品铁蛋白 4.4 g（湿重， 约含水 50%） ， 以质量百分浓度为 1% 硫酸铵溶液反 复溶解后加硫酸铵固体沉淀除镉后加半饱和硫酸铵溶液保存。 0036 上述实施例和对比实施例所得精品铁蛋白经电泳检测如图 1 铁蛋白活性铁染色、 图 2 铁蛋白活性考马斯亮蓝染色及图 3 铁蛋白 SDS-page 变性电泳所示。 0037 实施例 1 与对比实施例对比可知， 超滤后硫酸铵用量仅是传统工艺的一半以下， 且料液量少， 处理方便 ； 实施例 2 与对比实施例对比可知， 超滤后加丙酮比加固体硫酸铵耗 时少且不易使蛋白质失活， 另外丙酮可以回收， 成本相应降低。 故本发明从收率和能耗上均 优于传统工艺， 适用于工业生产。 0038 表 1 为实施例 1、 实施例 2 和对比实施例的工艺参数及产品量 0039 说 明 书 CN 103145825 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103145825 A 6