能够降解拟除虫菊酯类农药残留的产气肠杆菌M6R9.pdf

1、10申请公布号CN102021135A43申请公布日20110420CN102021135ACN102021135A21申请号201010567809422申请日20101130CGMCCNO415520100908C12N1/20200601A62D3/02200701C12R1/01200601A62D101/04200701A62D101/2820070171申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路388号72发明人廖敏谢晓梅74专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟冷红梅54发明名称能够降解拟除虫菊酯类农药残留的产气肠杆菌M6R957摘要本发明提供

2、了一株能够降解拟除虫菊酯类农药残留、尤其是能够同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留的产气肠杆菌M6R9，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号CGMCCNO4155，保藏日期2010年09月08日。本发明的有益效果主要体现在提供了一株能够同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留的新菌株，为控制农产品中拟除虫菊酯类农药残留提供了研究基础，应用前景广阔。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页序列

3、表2页附图1页CN102021149A1/2页21产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENESM6R9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号CGMCCNO4155，保藏日期2010年09月08日。2如权利要求1所述的产气肠杆菌M6R9，其特征在于所述产气肠杆菌M6R9菌落特征如下为杆菌，不产胞子且具有小的荚膜，革兰氏阴性，菌体大小为0819M0510M，在固体培养基上，菌落呈圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈灰白色，不透明。3如权利要求1所述的产气肠杆菌M6R9，其特征在于所述产气肠杆菌M6R

4、9的16SRDNA基因序列如下TGACGGCAGGCTTACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAAGGGAGCTTGCTCTCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA

5、CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAACTTAATACGTTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCCAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCA

6、ACCTGGGAACTGCATTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTG

7、ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGG

8、CTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAG权利要求书CN102021135ACN102021149A2/2页3AATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTGGATCAGTTGTC。权利要求

9、书CN102021135ACN102021149A1/6页4能够降解拟除虫菊酯类农药残留的产气肠杆菌M6R9一技术领域0001本发明涉及一株能够降解拟除虫菊酯类农药残留、尤其是能够同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留的产气肠杆菌M6R9。二背景技术0002拟除虫菊酯类农药是模拟天然的除虫菊酯而合成，含有多个苯环结构的一类杀虫剂，具有广谱高效、低毒、耐光、热等特点，其品种数和使用量仅次于有机磷农药，占杀虫剂市场的第二位，在茶叶、蔬菜等经济作物害虫防治中得到广泛应用，常用的有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯等。但是这类农药普遍具有对环境稳定、降解速度慢、降解率低，残留过高，带来

10、了食品安全问题。特别是我国加入WTO后，“关税壁垒”随之拆除，国外针对我国入关而颁布的农产品中农药的最大残留量MRL标准带有明显的“技术壁垒”倾向，农药检测范围大幅度扩大，拟除虫菊酯类农药MRL标准明显降低，使我国茶叶等农产品出口面临着更为严峻的挑战。0003农药残留是吸附、降解和迁移等综合作用后结果，其中降解是制约其残留量的关键过程，控制农药残留有多种途径，包括禁用农药、化学处理方法和微生物降解等。大量研究表明微生物对土壤和水环境中的农药降解起着关键作用，已分离到大批能降解或转化农药的微生物类群，如细菌、放线菌、真菌和藻类，在对拟除虫菊酯类农药降解研究中发现假单胞菌属PSEUDOMONASS

11、P、肠杆菌属EHTEROBACTESP、产碱杆菌属ALCALIGENESSP和蜡状芽孢杆菌属BACILLUSCEREUSSP等对拟除虫菊酯类农药具有降解作用。但大多数微生物降解针对某一或少数几个农药，而同时能降解多种拟除虫菊酯类农药的微生物报道较少。三发明内容0004本发明目的是提供一种能够同时降解多种拟除虫菊酯类农药的菌株产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENESM6R9。0005本发明采用的技术方案是0006产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENESM6R9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，10

12、0101，保藏编号CGMCCNO4155，保藏日期2010年09月08日。0007所述产气肠杆菌M6R9菌落特征如下为杆菌，不产胞子且具有小的荚膜，革兰氏阴性，菌体大小为0819M0510M，在固体培养基上，菌落呈圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈灰白色，不透明。0008所述产气肠杆菌M6R9的16SRDNA基因序列如下0009TGACGGCAGGCTTACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAAGG0010GAGCTTGCTCTCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAA0011TGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAAC

13、说明书CN102021135ACN102021149A2/6页50012GGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGAC0013CTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCT0014AGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTG0015GTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCC0016AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGG0017GCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGT

14、GTGAAGAAGGCC0018TTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAAC0019TTAATACGTTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCG0020GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCCA0021GCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTT0022TGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTG0023CATTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAAT0024TCC

15、AGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACC0025GGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGT0026GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT0027CCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGG0028CGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAG0029TACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCG0030CACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT

16、TAATTCGATGCAACGCGAAG0031AACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGC0032TTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGT0033CGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA0034GCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACT0035CAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATG0036ACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGT

17、G0037CTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAG0038CGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAA0039CTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGA0040ATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG0041TCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAAC0042CTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTGGATCAGTTGTC。0043本发明菌株由采集杭州农药厂拟除虫菊酯类农

18、药生产车间下水道处驯化过的污泥中筛选获得，根据SHERLOCKMIS软件系统对菌株M6R9定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比LIBRARY数据库，初步鉴定菌M6R9为产气肠杆菌属ENTEROBACTERSP中的产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENES，相似指数SISIMILARITYINDEX为0931；用16SRDNA测序鉴定方法也证明该菌株为产气肠杆菌。0044该菌株能同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留，在通气、PH70、温度2530、OD415NM02、农药浓度100MGL1、转速180RMIN1的条件下，对含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的混合

19、培养基，培养3说明书CN102021135ACN102021149A3/6页6天，3种菊酯农药的降解率分别为6521、6518、66983。0045本发明的有益效果主要体现在提供了一株能够同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留的新菌株，为控制农产品中拟除虫菊酯类农药残留提供了研究基础，应用前景广阔。四附图说明0046图1为产气肠杆菌M6R9的电镜照片放大50000倍；0047图2为16SRDNAPCR扩增结果ZA样品M6R9；MARKEDNA标准分子量；0048图3为基于16SRDNA序列的菌株M6R9系统发育树；五具体实施方式0049下面结合具体实施例对本发明进行进一步

20、描述，但本发明的保护范围并不仅限于此0050实施例1降解菌株的筛选与鉴定00511材料与方法005211培养基和试剂0053富集培养基蛋白胨10G，NACL10G，KH2PO410G，H2O1000ML，葡萄糖10G，PH70；0054基础培养基NH4NO3100G，MGSO47H2O05G，NH42SO405G，KH2PO405G，NACL05G，K2HPO415G，H2O1000ML，PH70；0055基础培养基加入15W/V，每100ML加15G琼脂和100MGL1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即配成相应的含农药固体培养基；005650GL1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。00571

21、2菌株对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯降解效能的测定0058将纯化后的单个菌株以菌量OD415NM02接种到100ML含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100MGL1的无菌液体富集培养基的250ML三角瓶中，以不接菌的培养液作对照，在30，180RMIN1的恒温摇床上振荡培养3天。培养结束后，吸取2ML培养液，加入4、4、3ML的石油醚萃取3次，加入无水硫酸钠吸水，并定容至10ML，用气相色谱检测。0059气相色谱检测条件AGILENT6890GCG1530N/G3172A气相色谱仪，HP530MM025MM025M色谱柱，ECD检测器，检测温度280，柱温260，进样口温度280，柱流10MLM

22、IN1，分流比为110，载气为N299999，进样量为1L。0060降解率对照样品残留量处理样品残留量100/对照样品残留量006113优势降解菌株选育0062131菌株来源0063采集杭州农药厂拟除虫菊酯类农药生产车间下水道处驯化过的污泥。0064132降解菌株的分离、纯化和筛选说明书CN102021135ACN102021149A4/6页70065从每份污泥土样中取10G，在无菌的条件下，分别加到含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100MGL1的100ML无菌液体富集培养基的250ML三角瓶中在30下180RMIN1摇床上培养7天后，按10接种量转移到下一批富集培养基上三种农药梯度依次为10

23、0、150、200、250MGL1，同条件驯化培养7天。然后再按10接种量转接到含250MGL1的联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯无菌液体的基础培养基中，继续培养7天，连续转接2次后从农药浓度为250MGL1基础培养基中，取01ML基础培养基发酵液反复进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面上，于4冰箱内保存。0066133菌株鉴定0067菌株鉴定采用美国MIDI公司的SHERLOCKMICROBIALIDENTITYSYSTEMMIS软件系统，该系统将基础培养基上纯化的单菌落按照MIDI公司的操作规范进行脂肪酸的提取和分析，定性种类和定量含量地分析微生物的脂肪酸成份并生成

24、脂肪酸图谱，将生成的图谱和数据库LIBRARY进行比对，根据相似指数SISIMILARITYINDEX鉴定未知菌种，相似指数SI大于09就基本可确定是某种微生物。该系统是一相对快速和具有丰富菌库的微生物鉴定系统，已得到较广泛的应用吴愉萍，徐建明，汪海珍等SHERLOCKMIS系统应用于土壤细菌鉴定的研究土壤学报，2006，434642647。0068此外，同时用16SRDNA鉴定方法进行验证，与SHERLOCKMICROBIALIDENTITYSYSTEMMIS进行比较。以M6R9菌株总DNA为模板，用16SRDNA基因的通用引物进行PCR扩增，得到的扩增片段经回收、测序可明确其大小，再将测序

25、结果用BLAST软件与GENBANK中的序列进行同源性比较。0069134菌株形态特征观察及生理生化特性测定0070将菌株接种在固体培养基中，48H后电镜观察菌株形态特征；取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、结晶紫简单荚膜等染色；生理生化特性测定参照常见细菌系统鉴定手册东秀珠，蔡妙英。00712结果007221菌株的分离与筛选0073经分离、纯化、筛选获得1株能同以联苯菊酯、甲氰、氯氰菊酯为碳源并保持较高和较稳定降解率的细菌，命名为M6R9，其它菌株降解力都不同程度地衰退，培养3天，发现它对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分别为6521、6518、66983。007422菌株的鉴定0075

26、221菌株M6R9基本形态及生理生化特征0076该菌为杆菌，不产胞子且具有小的荚膜，革兰氏阴性，菌体大小约为长0819M、宽0510M如图1，在固体培养基上，菌落圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈灰白色，不透明。乙酰甲基甲醇生成试验VP反应阳性，吲哚实验阴性，不能液化明胶，其他生理生化特性见表1。0077表1产气肠杆菌的生理生化特性0078说明书CN102021135ACN102021149A5/6页8测试项目结果生理生化测试结果革兰氏染色VP实验甲基红吲哚实验脂酶硫化氢赖氨酸脱羧酸苯丙氨酸脱氨酶鸟酸氨脱羧酶氧化酶柠檬酸盐脲酶水解木糖精氨酸双水解酶葡萄糖产气蔗糖产酸丙二酸麦芽糖产酸乳糖卫矛醇产

27、酸00790080注阳性反应；阴性反应0081222菌株M6R9鉴定00821SHERLOCKMIS系统对M6R9的鉴定0083根据SHERLOCKMIS软件系统对菌M6R9脂肪酸定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比LIBRARY数据库，初步鉴定菌M6R9为产气肠杆菌属ENTEROBACTERSP中的产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENES，相似指数SISIMILARITYINDEX为0931。0084216SRDNA鉴定方法对M6R9的验证0085IDNA提取结果0086以M6R9菌株总DNA为模板，用16SRDNA基因的通用因为进行PCR扩增，得到1条约为15KB的片段图1。

28、扩增片段经回收、测序明确其大小为1446BPSEQIDNO1。0087II16SRDNA基因PCR扩增和序列分析0088将测序结果用BLAST软件与GENBANK中的序列进行同源性比较发现，M6R9菌株16SRDNA序列与产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENESAAC64477和阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAEBAA24279的16SRDNA序列相似性高达997和986，与成团肠杆菌ENTEROBACTERAGGLOMERANSABY76238、目勾维肠杆菌ENTEROBACTERGERGOVIAEABY76238、中间肠杆菌ENTEROBACTERINTERMED

29、IUSCAD48860、阪崎肠杆菌ENTEROBACTERSAKAZAKIIABP96975、泰洛氏肠杆菌ENTEROBACTERTAYLORAEABI21952、霍说明书CN102021135ACN102021149A6/6页9氏肠杆菌ENTEROBACTERHOMAECHEACR39085的16SRDNA序列相似性为981。基于16SRDNA序列的M6R9菌株与产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENESAAC64477和阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAEBAA24279具有较高的同源性，为确定该菌株的系统发育位置，选取一些沙雷氏菌构建系统发育树，并选择沙雷氏菌属为外

30、群，各菌株名称及序列号见图2，各种菌株之间的系统发育树可知，M6R9与产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENESAAC64477具有较高的同源性，遗传距离也较紧。0089综合M6R9的生理生化性质、SHERLOCKMISMIDI鉴定系统及16SRDNA系统进化分析可以看出，该菌属于肠杆菌属ENTEROBACTERSP中的产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENES。00903结论00911从拟除虫菊酯类农药生产车间下水道驯化过的污泥中分离得到1株能同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的高效菌M6R9，经SHERLOCKMIS系统鉴定为产气肠杆菌属ENTEROBACTERSP中

31、的产气肠杆菌ENTEROBACTERAEROGENES。0092实施例2菌株降解性能检测00931材料与方法009411培养基和试剂0095基础培养基NH4NO3100G，MGSO47H2O05G，NH42SO405G，KH2PO405G，NACL05G，K2HPO415G，H2O1000ML，PH70；009650GL1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。009712菌株对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解0098在装有100ML基础培养基的三角瓶中，混合加入100MGL1联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯作为唯一碳源，在接种量OD415NM02、2530、PH70、振荡速率180RMIN1、装液

32、量100ML250ML三角瓶条件下培养3天后，按照实施例1方法测定菌株M6R9对3种菊酯农药的降解率。00992结果0100菌株M6R9在通气量、PH70、温度2530、OD415NM02、农药浓度100MGL1、转速180RMIN1环境条件下，对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分别为6521、6518、66983。与GRANT等从使用过拟除虫菊酯的菜园和农田土壤的混和土样中分离出荧光假单胞菌和普城沙雷菌两株优势菌，于25、80RMIN1条件下培养14天，对250MGL1的氯氰菊酯去除率约为667的结果相比，表明本研究分离、筛选的产气肠杆菌菌株M6R9是一株可同时对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰

33、菊酯降解的高效菌株，对控制农产品中拟除虫菊酯类农药残留具有一定的应用潜力。说明书CN102021135ACN102021149A1/2页10SEQUENCELISTING浙江大学能够降解拟除虫菊酯类农药残留的产气肠杆菌M6R91PATENTINVERSION3411446DNAENTEROBACTERAEROGENES1TGACGGCAGGCTTACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAAGGGAGCTTGCTCTCCTGGGT60GACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTAC120TGGAAACGGTAGCT

34、AATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCT180CTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGG240CGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCA300GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCC360ATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTG42

35、0GTGAACTTAATACGTTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGT480GCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCCAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGC540GCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT600序列表CN102021135ACN102021149A2/2页11TGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAAT660GCGTAGAGATCTGG

36、AGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCT720CAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAAC780GATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCG840ACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA900AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACAT96

37、0CCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATG1020GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA1080TCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG1140GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTAC1200AATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCG1260TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGA1320TCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG1380AGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTGGATCA1440GTTGTC1446序列表CN102021135ACN102021149A1/1页12图1图2图3说明书附图CN102021135A