副鸡禽杆菌发酵培养方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 104328077 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104328077 A (21)申请号 201410659185.7 (22)申请日 2014.11.18 C12N 1/20(2006.01) A61K 39/02(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 北京华都诗华生物制品有限公司 地址 102600 北京市大兴区生物医药产业基 地永兴路 35 号 (72)发明人 张洪 杨国良 梁爽 丁春宇 陈秋平 张凌云 王亚丽 周涵锷 李静 贾桂珍 曹宁 (74)专利代理机构 北京康

2、思博达知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11426 代理人 余光军 李霞 (54) 发明名称 副鸡禽杆菌发酵培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种副鸡禽杆菌发酵培养方 法， 属于副鸡禽杆菌的发酵培养领域。 本发明公开 了一种副鸡禽杆菌的发酵培养方法， 包括 ： (1) 一 级种子液的制备 ； (2) 二级种子液的制备 ； (3) 三 级种子液的制备 ； (4)菌液发酵培养。 本发明从接 种方式、 培养时间、 初始接种量等对副鸡禽杆菌的 发酵培养条件进行了改进， 采用四步接种法， 接种 比例为2.510， 培养方式为发酵罐培养， 在不 改变单批次发酵总体积， 不增加人员和原材料成 本的

3、情况下， 最终使副鸡禽杆菌发酵终点活菌数 达到 9.8108CFU/mL， 总菌数达 56.7 亿 /mL， 单批 产量增加 5 倍， 不用浓缩即可达到配苗要求， 能够 进行大规模生产应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104328077 A CN 104328077 A 1/1 页 2 1. 一种副鸡禽杆菌 (Avibacterium paragallinarum) 的发酵培养方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1)

4、一级种子液的制备 ； (2) 二级种子液的制备 ； (3) 三级种子液的制备 ； (4) 菌液发酵培养。 2.按照权利要求1所述的发酵培养方法， 其特征在于， 步骤(1)所述一级种子液的制备 包括 ： 将副鸡禽杆菌种毒稀释， 取4mL接种至160mL半合成培养基培养11h ； 优选的， 所述稀 释为将冻干保存的副鸡禽杆菌种毒用 5mL PH 值为 7.2 的 PBS 稀释。 3.按照权利要求1所述的发酵培养方法， 其特征在于， 步骤(2)所述二级种子液的制备 包括 ： 将 160mL 一级种子液接种至 1600mL 半合成培养基培养 4h。 4.按照权利要求2或3所述的发酵培养方法， 其特征在

5、于 ： 所述培养为37， 200r/min 摇床培养。 5.按照权利要求1所述的发酵培养方法， 其特征在于， 步骤(3)所述三级种子液的制备 包括 ： 将 1600mL 二级种子液接种至 30000mL 半合成培养基培养 4h。 6. 按照权利要求 5 所述的发酵培养方法， 其特征在于 ： 所述培养为 37， 200r/min 磁 力搅拌或摇床培养 ； 优选为 200r/min 磁力搅拌培养。 7. 按照权利要求 1、 2、 3 或 5 任何一项所述的发酵培养方法， 其特征在于 ： 所述培养的 终点至种子液的 OD550值为 0.500.05。 8. 按照权利要求 1 所述的发酵培养方法， 其

6、特征在于， 步骤 (4) 所述菌液发酵培养包 括 ： 将 30000mL 三级种子液接种至 300L 发酵罐， 磁力搅拌培养 ； 发酵终点为菌液 OD550值为 0.550.05 ； 优选的， 培养基为半合成培养基 ； 培养温度为 37， pH 值为 7.2， 搅拌转速为 200r/min。 9. 权利要求 1、 2、 3、 5、 6 或 8 任何一项所述的发酵培养方法培养的副鸡禽杆菌。 10. 权利要求 9 所述副鸡禽杆菌在制备鸡传染性鼻炎灭活疫苗中的用途。 权 利 要 求 书 CN 104328077 A 2 1/8 页 3 副鸡禽杆菌发酵培养方法 技术领域 0001 本发明涉及副鸡禽杆菌

7、的培养方法， 尤其涉及副鸡禽杆菌的发酵培养方法， 属于 副鸡禽杆菌的发酵培养领域。 背景技术 0002 鸡 传 染 性 鼻 炎 (Infectious Coryza,IC) 是 由 副 鸡 禽 杆 菌 (Avibacterium paragallinarum,Apg) 引起鸡的一种急性呼吸道传染病， 多发生于寒冷潮湿季节。该病可 使育成鸡生长发育不良和产蛋鸡产蛋明显下降 ( 可引起产蛋率下降 10 40 )， 在中 国大型的集约化养殖场是重要疫病之一。目前本病在世界许多地方都有发生和流行， 中 国于 1987 年首次分离到该病原 ( 冯文达 . 北京鸡传染性鼻炎病原菌的分离及鉴定 J. 微生物

8、学通报 ,1987,5:216 219.)， 近年来也陆续在中国山东、 北京分离到多株副鸡禽 杆菌 ( 杨国良 , 郑杰等 .A 型副鸡嗜血杆菌 ( 山东株 ) 的分离与鉴定 J. 中国畜牧兽 医 ,2013,40(2):189-192.)。随着养鸡业的发展， 养殖环境的不断复杂化， 鸡传染性鼻炎的 发生频率越来越高， 已经给养鸡业造成很大经济损失。 0003 目前， 对于鸡传染性鼻炎的防治主要采取药物或疫苗免疫两种方法。但是鸡只用 药后， 药物的原形或其代谢产物和有关杂质可能蓄积、 残留在动物的组织、 器官或食用产品 中， 造成了兽药在动物性食品中的残留， 对人体造成严重的危害。所以， 当前

9、高品质的鸡传 染性鼻炎疫苗仍是预防此病的首选。但是， 现有的副鸡禽杆菌的培养方法存在产量低的缺 陷， 需对菌液进行浓缩处理才能达到配苗要求 (兽用生物制品规程 要求半成品总菌数为 50 亿 /mL)。因此， 亟待对副鸡禽杆菌的高密度发酵关键工艺进行优化以有效提高单位产 量， 便于进行规模化工业生产。 发明内容 0004 本 发 明 所 要 解 决 的 技 术 问 题 是 提 供 一 种 副 鸡 禽 杆 菌 (Avibacterium paragallinarum) 的发酵培养方法， 该方法显著提高单位产量， 使发酵终点总菌数达到 56.7 亿 /mL， 不用浓缩即可达到配苗要求。 0005 为

10、解决上述技术问题， 本发明所采取的技术方案是 ： 0006 本发明公开了一种副鸡禽杆菌 (Avibacterium paragallinarum) 的发酵培养方 法， 包括以下步骤 ： (1) 一级种子液的制备 ； (2) 二级种子液的制备 ； (3) 三级种子液的制 备 ； (4) 菌液发酵培养。 0007 其中， 步骤 (1) 所述一级种子液的制备包括 ： 将副鸡禽杆菌种毒稀释， 取 4mL 接种 至 160mL 半合成培养基培养 11h ； 优选的， 所述稀释为将冻干保存的副鸡禽杆菌种毒用 5mL PH 值为 7.2 的 PBS 稀释。 0008 步骤(2)所述二级种子液的制备包括 ：

11、将160mL一级种子液接种至1600mL半合成 培养基培养 4h。 0009 所述一级种子液和二级种子液的制备均为 37， 200r/min 摇床培养。 说 明 书 CN 104328077 A 3 2/8 页 4 0010 步骤(3)所述三级种子液的制备包括 ： 将1600mL二级种子液接种至30000mL半合 成培养基培养 4h ； 所述培养为 37 200r/min 磁力搅拌或摇床培养 ； 优选为 200r/min 磁力 搅拌培养。 0011 本发明所述一级种子液、 二级种子液和三级种子液的制备， 所述培养的终点至种 子液的 OD550值为 0.500.05。 0012 本发明所述副鸡禽

12、杆菌的发酵培养方法， 步骤 (4) 所述菌液发酵培养包括 ： 将 30000mL 三级种子液接种至 300L 发酵罐， 磁力搅拌培养 ； 发酵终点为菌液 OD550值为 0.550.05。培养基为半合成培养基 ； 培养温度为 37， pH 为 7.2， 搅拌转速为 200r/min。 0013 利用本发明所述副鸡禽杆菌的发酵培养方法培养副鸡禽杆菌， 发酵结束时活菌数 达 9.8108CFU/mL， 总菌数达 56.7 亿 /mL。 0014 本发明所述副鸡禽杆菌的发酵培养方法适用于任何一种可以获得的副鸡禽杆菌 菌株。 0015 本发明从接种方式、 培养时间、 初始接种量等方面对副鸡禽杆菌 C-

13、Apg-8(Page A 型 ) 的发酵培养进行了改进。本发明改变现有副鸡禽杆菌生产的二步接种法 ： 一级种子 二级种子 (7500mL) 300L 为四步接种法 ： 4mL 160mL 1600mL 30000mL 300L。 0016 就细菌发酵过程中种子液接种量而言， 增大接种量可以明显缩短种子液对培养基 的适应过程， 从而较快进入对数生长期， 缩短延滞期。但是增加接种比例也是有一定范围 的， 有研究表明， 接种量过大的时候， 会过度消耗培养基中的营养成分同时产生大量的抑制 细菌继续增长的代谢产物， 这样都是不利于发酵培养的。 同时， 较大的接种量也意味着对制 备种子的工作量的加大， 对

14、于实际的生产工作而言， 也是非常不利的。 本发明经过比较并结 合生产实际情况选用 2.5 10的接种比例， 达到了预期的效果。 0017 在细菌性疫苗的生产过程中， 种子液的最佳培养时间为对数生长期末 ( 此时该细 菌的活菌数为最大值， 且菌龄仍处于对数生长期 )， 这是因为在对数生长期内细菌群体的世 代时间不变， 细菌数目以几何级数量增长 ； 在对数生长期内， 菌体的分裂速度最快， 菌体个 体之间细胞组成成分差异性较小， 菌体抗原性相对稳定、 一致， 因此使用对数生长期的种子 液接种制苗用菌液可使制苗菌液的抗原质量相对稳定、 延滞期大大缩短从而使整个培养周 期最短。在本发明的培养条件下， 一

15、级种子液的培养时间应该控制在 11h 以内。 0018 在一定条件下 ( 如培养基、 温度、 PH 值等 )， 每一种细菌的世代时间是恒定的 ( 李 季伦， 张伟心等 . 微生物生理学 M. 北京 ： 北京农业大学出版社， 1993， 422-426)， 因此在 鸡传染性鼻炎灭活疫苗抗原的实际生产过程中， 当需要调整种子液的培养时间或菌液浓度 时， 只要保证培养条件不变就可以利用测得的种子液的世代时间和所需的种子液培养时间 或菌液浓度来计算出最适宜的最初接种量， 从而达到控制生产工艺流程的目的。 0019 在实际生产中， 由于生物试验的可重复性差， 希望精确找到种子液活菌数最高时 的 OD 值

16、是困难的。本发明通过大量的 OD 值与活菌数的对应数据， 找到对数期末活菌数达 到某数值时的 OD 值范围 (550nm)， 即对于种子液为 ： 0.500.05， 对于制苗菌液发酵终点 为 ： 0.550.05( 由于发酵罐培养副鸡禽杆菌需要通气、 搅拌、 补碱， 故活菌数有所增加， 导 致 OD 值比种子液略高 )， 这样就可以估算出此时的活菌数， 简便的解决了测定活菌数耗时 长的问题， 通过此方法可以快速判定副鸡禽杆菌的收获终点， 从而最终来指导生产。 0020 本发明通过改变现有副鸡禽杆菌生产的二步接种法 ： 一级种子二级种子 说 明 书 CN 104328077 A 4 3/8 页

17、5 (7500mL)300L为四步接种法 ： 4mL160mL1600mL30000mL300L， 接种比例由之 前的2.5变为2.510， 培养方式由大瓶变为发酵罐培养， 同时在不改变单批次发酵总 体积， 不增加人员和原材料成本的情况下， 最终使发酵终点活菌数比优化前提高了接近 13 倍 (9.8108 7.7107CFU/mL)， 总菌数提高了接近 5 倍 (11.5 亿 /mL 56.7 亿 /mL)， 即 单批产量增加 5 倍， 菌液不用浓缩即可达到配苗用抗原要求 ( 规程要求半成品总菌数为 50 亿/mL)。 本发明应用优化的副鸡禽杆菌发酵培养方法在兽用生物制品GMP车间连续生产六

18、批副鸡禽杆菌抗原的良好效果表明， 本发明副鸡禽杆菌的发酵培养方法完全可以大规模生 产应用。 0021 在实际的疫苗生产中， 本发明将工艺改进后培养的副鸡禽杆菌乳化制苗， 进行疫 苗的免疫攻毒保护试验， 其攻毒保护率达到 100合格。 0022 本发明所涉及到的术语定义 0023 除非另外定义， 否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。 0024 术语 “接种” 意指按无菌操作技术要求将目的微生物移接到培养基质中的过程。 0025 可互换使用的术语 “疫苗” 或 “疫苗组合物” 指这样的药物组合物， 其包括在动物 中诱导免疫应答的至少一种免疫原

19、性组合物。 疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感 染的疾病或可能的死亡， 并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另 外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分， 包括 例如佐剂或免疫调节剂。 疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在 经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体， 或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的 生物体， 或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗， 或通过本领域技术人员已 知的方法制备的遗传改造、 突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超 过一种上述组分。 附图说明 0026 图 1 为种子液

20、生长曲线 ； 0027 图 2 为种子液对数生长期直线方程 ； 0028 图 3 为不同培养方式对副鸡禽杆菌活菌数的影响比较。 具体实施方式 0029 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的， 不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换， 但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。 0030 1、 实验材料 0031 1.1 菌株 0032 副鸡禽杆菌菌株 C-Apg-8(Page A 型 ) 购自中国兽医药品监察所。 00

21、33 1.2 主要仪器 0034 KC-06-57-300L 型发酵罐， 北京科诺德流体设备有限公司生产 ； ZHWY-211C 型恒温 说 明 书 CN 104328077 A 5 4/8 页 6 培养振荡器， 上海智城分析仪器制造有限公司 ； 752 型紫外可见分光光度计， 上海光谱仪器 有限公司 ； DL-CJ-2ND 型超级洁净工作台， 北京东联哈尔仪器制造有限公司 ； HF90 型 CO2 培 养箱， 上海力申科学仪器有限公司 ； 标准比浊管， 中国食品药品检定研究院。 0035 1.3 培养基 0036 半合成培养基、 半合成琼脂培养基参照冯文达等的方法制备 ( 冯文达 . 北京鸡

22、传 染性鼻炎病原菌的分离鉴定 J. 微生物学通报， 1987， 5:216 219.) ； 半合成培养基的配 方与中华人民共和国兽用生物制品规程 2000 年版规定的相同。 0037 1.4 其他 0038 鸡血清， 购自郑州佰安生物工程有限公司 ； 辅酶， 产地 Germang。实施例 1 副鸡 禽杆菌的发酵培养 0039 (1) 一级种子液的制备 0040 将冻干保存的副鸡禽杆菌 C-Apg-8 种毒用 5mL PBS(PH 7.2) 稀释， 取 4mL 接种 至 160mL 半合成培养基 37， 200r/min 摇床培养 11h， 培养终点种子液的 OD550值为 0.450， 活菌数

23、最高。 0041 (2) 二级种子液的制备 0042 将160mL一级种子液接种至1600mL半合成培养基中37， 200r/min摇床培养4h。 活菌数最高为 1.3109CFU/mL， 此时菌液在 550nm 下 OD 值为 0.507。 0043 (3) 三级种子液的制备 0044 将 1600mL 二级种子液接种至 30000mL 半合成培养基， 37 200r/min 磁力搅拌培 养 4h ； 活菌数达到峰值为 9.0108CFU/ml， 此时菌液在 550nm 下 OD 值为 0.467。 0045 (4) 菌液发酵培养 0046 将30000mL三级种子液接种至300L发酵罐，

24、磁力搅拌培养， 搅拌转速为200r/min ； 发酵罐培养温度通过自动控温系统维持在 37左右 ； 培养基为半合成培养基 ； 通过自动流 加 5 10的 NaOH 控制 pH 在 7.2 左右。发酵终点菌液 OD550值为 0.501。 0047 发酵结束时， 活菌数为 7.6108CFU/mL， 总菌数为 56.7 亿 /mL。 0048 实施例 2 副鸡禽杆菌的发酵培养 0049 (1) 一级种子液的制备 0050 将冻干保存的副鸡禽杆菌 C-Apg-8 种毒用 5mL PBS(PH 7.2) 稀释， 取 4mL 接种 至 160mL 半合成培养基 37， 200r/min 摇床培养 11

25、h， 培养终点种子液的 OD550值为 0.550， 活菌数最高。 0051 (2) 二级种子液的制备 0052 将160mL一级种子液接种至1600mL半合成培养基中37， 200r/min摇床培养4h。 活菌数最高为 1.3109CFU/mL， 此时菌液在 550nm 下 OD 值为 0.507。 0053 (3) 三级种子液的制备 0054 将1600mL二级种子液接种至30000mL半合成培养基， 37200r/min摇床培养4h ； 活菌数达到峰值为 1.4109CFU/ml， 此时菌液在 550nm 下 OD 值为 0.523。 0055 (4) 菌液发酵培养 0056 将3000

26、0mL三级种子液接种至300L发酵罐， 磁力搅拌培养， 搅拌转速为200r/min ； 发酵罐培养温度通过自动控温系统维持在 37左右 ； 培养基为半合成培养基 ； 通过自动流 说 明 书 CN 104328077 A 6 5/8 页 7 加 5 10的 NaOH 控制 pH 在 7.2 左右。发酵终点菌液 OD550值为 0.60。 0057 发酵结束时， 活菌数为 3.3109CFU/mL， 总菌数为 57.4 亿 /mL。 0058 实施例 3 副鸡禽杆菌的发酵培养 0059 (1) 一级种子液的制备 0060 将冻干保存的副鸡禽杆菌 C-Apg-8 种毒用 5mL PBS(PH 7.2

27、) 稀释， 取 4mL 接种 至 160mL 半合成培养基 37， 200r/min 摇床培养 11h， 培养终点种子液的 OD550值为 0.502， 活菌数最高。 0061 (2) 二级种子液的制备 0062 将160mL一级种子液接种至1600mL半合成培养基中37， 200r/min摇床培养4h。 活菌数最高为 1.2109CFU/mL， 此时菌液在 550nm 下 OD 值为 0.507。 0063 (3) 三级种子液的制备 0064 将1600mL二级种子液接种至30000mL半合成培养基， 37200r/min摇床培养4h ； 活菌数达到峰值为 1.45109CFU/ml， 此时

28、菌液在 550nm 下 OD 值为 0.512。 0065 (4) 菌液发酵培养 0066 将30000mL三级种子液接种至300L发酵罐， 磁力搅拌培养， 搅拌转速为200r/min ； 发酵罐培养温度通过自动控温系统维持在 37左右 ； 培养基为半合成培养基 ； 通过自动流 加 5 10的 NaOH 控制 pH 在 7.2 左右。发酵终点菌液 OD550值为 0.578。 0067 发酵结束时， 活菌数为 8.5108CFU/mL， 总菌数为 57.21 亿 /mL。 0068 实验例 1 副鸡禽杆菌的发酵方法优化实验 0069 1、 实验方法 0070 1.1 一级种子液的制备 0071

29、 将冻干保存的 C-Apg-8 种毒用 5mL PBS(PH 7.2) 稀释， 取 4mL 接种 160mL 半合 成培养基37， 200r/min摇床培养16h， 期间每1h取样测定活菌数及OD值， 绘制生长曲线， 根据对数生长期末活菌数最高的特点来确定培养时间及 OD 值范围。重复 3 次。 0072 检测 OD 值即将上述培养时取得的样品， 用 752 型紫外可见分光光度计检测， 以吸 光度表示， 取发酵菌液 3mL， 在 550nm 下测定吸光度， 并详细记录数据。 0073 1.2 二级种子液的制备 0074 将确定好活菌数最高时的160mL一级种子液接种至1600mL半合成培养基中

30、37， 200r/min 摇床培养 6h， 期间每 0.5h 及 1h 取样测定活菌数及 OD 值。重复 3 次， 以 3 次重复 的平均值作为最终的结果。 0075 1.3 三级种子液的制备 0076 按照试验可操作性及接种比例， 将 1600mL 30000mL 阶段用 160mL 3000mL 试 验替代， 37培养， 并根据现有生产条件， 选用磁力搅拌与摇床培养同步进行对比试验， 转 速 200r/min。 0077 1.4 发酵培养 0078 按照 10的接种比例接种至 300L 发酵罐， 其余条件与二步接种法一致， 分别进行 发酵培养， 检测活菌数及 OD 值， 以便对照比较。 0

31、079 1.5 活菌计数方法 0080 采用平板计数法。分别取每种样品做 10 倍稀释， 用移液器将灭菌好的 PBS 液加 说 明 书 CN 104328077 A 7 6/8 页 8 入小管中， 每管 9mL， 然后将样品摇匀后取 1mL 加入第一管中， 之后以此类推， 选择适宜的三 个稀释度， 每个稀释度接种 2 个平板， 接种量为 500L， 接种半合成琼脂培养基使其自然扩 散， 于 37 5 CO2条件下培养 18h 20h。依照 GB4789.2-94 中的方法计算 CFU/mL。 0081 1.6 总菌数测定方法 0082 采用标准比浊法。将制苗菌液高速离心 30min， 转数为

32、4000r/min， 弃去上清， 取沉 淀加入 PH7.2 的 PBS 制成悬浊液， 用生物制品国家标准品 “中国细菌浊度标准 (C-Apg-8 菌 株 ： 28 亿 /mL)” 进行比较， 测得总菌数。 0083 1.7 副鸡禽杆菌生长曲线的绘制 0084 以培养时间为横轴， 种子液活菌数对数为纵轴， 绘制出种子液生长曲线。 0085 1.8 种子液世代时间的计算 0086 细菌在对数生长期每分裂一次所需时间， 称为世代时间或倍增时间， 用 g 表示。根 据统计学计算， 细菌群体所有细胞世代时间的平均值是一定的， 称之为细菌群体的世代时 间。根据张洪等 ( 张洪， 王文泉等 . 副鸡嗜血杆菌

33、在疫苗生产中生长特性的研究 J. 中国 兽药杂志 .2003,37(5):15-17,20.) 的试验方法计算世代时间。 0087 2、 实验结果 0088 2.1 一级种子液活菌数及 OD 值的测定 0089 种子液各时间点的活菌数测定结果及其相应的对数值、 OD 值见表 1。 0090 表 1 C-Apg-8 菌株各时间点活菌数、 对数值及 OD 值 0091 0092 2.2 种子液生长曲线的绘制 0093 根据表1测得的数据描点， 以培养时间为横轴， 种子液活菌数对数为纵轴， 从0h到 16h 各点作图， 绘制出种子液生长曲线， 结果见图 1。 0094 从图 1 可以看出， 接种后

34、0-2h， 这一时期处于生长延滞期， 2-11h( 试验 1)、 2-12h( 试验 2、 3) 菌体进入对数生长期， 11-12h( 试验 1)、 12-13h( 试验 2、 3) 进入稳定期， 此后菌体进入衰亡期。 依据生长曲线可知， 在37200r/min摇床培养条件下， 选择11小时 说 明 书 CN 104328077 A 8 7/8 页 9 左右的菌液作为一级种子液。 0095 2.3 种子液世代时间 g 的数据计算 0096 参照张洪等 ( 张洪， 王文泉等 . 副鸡嗜血杆菌在疫苗生产中生长特性的研究 J. 中国兽药杂志 .2003,37(5):15-17,20.) 的方法， 在

35、细菌生长曲线中， 对数生长期直线方程 可表示为 log2N Kt+b， 其中， N 表示在对数生长期内细菌在某一时刻的活菌数， t 表示对 数生长期某一时刻。 0097 log2N1 Kt1+b log2N2 Kt2+b 0098 K log2(N1/N2)/t1-t2 0099 g t1-t2/log2(N1/N2) 1/K 0100 利用计算机软件 Excel 中提供的函数计算直线方程 K 值。即 ： 细菌的世代时间 g 等于细菌对数生长期直线方程的斜率 K 的倒数， 结果见图 2、 表 2。 0101 表 2 C-Apg-8 菌株的对数生长期直线方程及世代时间 0102 0103 2.4

36、 二级种子液的制备 0104 结果如表 3 所示， 在 160mL 1600mL 阶段， 副鸡禽杆菌在 37， 200r/min 摇床培 养 4h 时活菌数最高为 1.3109CFU/mL， 此时 OD 值为 0.507。 0105 表 3 C-Apg-8 菌株的各时间点活菌数及 OD 值 0106 0107 注 ： 以上数据为 3 次试验结果的平均值。 0108 2.5 三级种子液的制备 0109 从图 3 生长曲线 (3 次试验结果的平均值 ) 可以看出， 在 4h 左右， 摇床与磁力搅拌 培养的活菌数均达到峰值为 1.4109CFU/ml、 9.0108CFU/ml， 并且使用 SPSS

37、 11.5 对其分 别进行统计学分析， 二者差异不显著 (P 0.1365 0.05)。根据生产现有实际情况， 采用 磁力搅拌培养替代摇床培养。 0110 2.6 OD 值的确定 0111 在对数生长期内， 由于细菌悬液的浓度即鼻炎菌的数量与光密度(OD值)成正比， 在生产实践中通过大量的 OD 值与活菌数的对应数据， 成功找到对数期末活菌数最高时的 OD 范围， 对于种子液为 ： 0.500.05， 对于发酵终点为 ： 0.550.05。 说 明 书 CN 104328077 A 9 8/8 页 10 0112 2.7 工艺改进后与改进前对比 0113 发酵罐培养温度通过自动控温系统维持在

38、37左右 ； 搅拌转速为 200r/min ； 通过 自动流加 5 10的 NaOH 控制 pH 在 7.2 左右。 0114 表 4 为工艺改进前后六批发酵培养检测结果， 根据本结果可以得到以下结论， 副 鸡禽杆菌C-Apg-8(Page A型)株通过改变现有大瓶生产的二步接种法 ： 一级种子二级种 子(7500mL)300L为四步接种法 ： 4mL160mL1600mL30000mL300L， 接种比例由 之前的2.5变为2.510， 同时在不改变单批次发酵总体积， 不增加人员和原材料成本 的情况下， 培养的菌体活菌数及总菌数比较理想， 应用在 300L 发酵罐， 取得了菌体密度 OD 值

39、、 活菌数及总菌数分别为 0.566、 9.8108CFU/mL、 56.7 亿 /mL， 相比较工艺改进前后活菌 数相差13倍左右(9.81087.7107CFU/mL)， 总菌数增加接近5倍(11.5亿/mL56.7 亿 /mL)， 最终可以使副鸡禽杆菌发酵单批产量增加约 5 倍。 0115 表 4 工艺改进前后 C-Apg-8 菌株发酵结果 0116 0117 实验例 2 免疫攻毒保护试验 0118 本发明根据实验例 1 的优化结果， 在实际的疫苗生产中将工艺改进后培养的副鸡 禽杆菌乳化制苗， 并依据 中华人民共和国兽用生物制品质量标准 2001 年版 ( 中华人民共 和国农业部， 2001) 进行疫苗的免疫攻毒保护试验， 其攻毒保护率达到 100合格。 说 明 书 CN 104328077 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104328077 A 11 2/2 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 104328077 A 12