刺糖多孢菌染色体的基因整合.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102816783 A (43)申请公布日 2012.12.12 CN 102816783 A *CN102816783A* (21)申请号 201210284307.X (22)申请日 2012.05.03 13/100,220 2011.05.03 US C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12P 21/00(2006.01) C12P 19/62(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 陶氏益农公司 地址 美国印第安纳州 (72)发明人 韩蕾 N芒西 (74)专利代理机构 北京市柳沈律

2、师事务所 11105 代理人 吴培善 (54) 发明名称 刺糖多孢菌染色体的基因整合 (57) 摘要 本发明包括在刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa) 基因组中鉴定和 确认中性多核苷酸整合位点的方法。 此外， 本发明 包括中性位点的用途和用于整合在后续世代中稳 定维持和表达的包含基因表达盒的多核苷酸的方 法。本发明包括可被破坏而对多杀菌素产生、 生 长、 或其他期望的代谢特征没有负面影响的中性 整合位点。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 19 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利

3、要求书 2 页 说明书 19 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 一种用于将基因整合入刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa) 菌种菌株的染 色体 DNA 的方法， 包括步骤 ： 创建噬菌体文库以鉴定基因组基因座 ； 从基因组基因座克隆两个基因组 DNA 片段， 其中将一个基因组片段克隆至多核苷酸的 待整合基因的上游， 并且将第二基因组片段克隆至所述多核苷酸的待整合基因的下游， 并 且所得的连接的 DNA 片段成为整合质粒 ； 通过转化方法将步骤 (b) 的质粒引入刺糖多孢菌菌株 ； 获得转化接合子 ； 并， 筛选存在所述多核苷酸的所述转化接合子。 2. 权利要求

4、 1 的方法， 其中所述多核苷酸含有基因表达盒。 3. 权利要求 2 的基因表达盒， 其中所述基因表达盒含有抗生素可选择标志或多杀菌素 增强基因表达盒。 4. 刺糖多孢菌菌种的基因整合体， 其中已经通过根据如权利要求 1 限定的方法将基因 整合入染色体 DNA 而添加、 取代或缺失了基因， 其中所述已经取代的基因与天然刺糖多孢 菌基因不同。 5. 刺糖多孢菌菌种的基因整合体， 其中已经通过根据如权利要求 1 限定的方法将基因 整合入染色体 DNA 而添加、 取代或缺失了基因， 其中所述已经取代的基因与天然刺糖多孢 菌基因相同。 6. 用于产生选定基因的蛋白质产物的方法， 所述方法包括制备剌糖多

5、孢菌菌株， 在所 述菌株中根据权利要求 1 的方法将特定拷贝数的所述选定基因整合入刺糖多孢菌的基因 组， 并且在合适的培养基中将所述细菌菌株培养足够的时间以使所述选定的基因得到表达 并且所述蛋白质得到产生。 7. 一种用于改善多杀菌素产生的方法， 包括 ： 将遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇作为用于 整合和表达目的靶基因的中性位点整合入刺糖多孢菌基因组。 8. 权利要求 7 的方法， 其中遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇的整合不负面影响多杀菌素产 生、 生长或其他期望的代谢特征。 9. 权利要求 7 的遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇， 其中遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座用于整 合多核苷酸， 并且其中遮蔽蛋白 PKS 基因

6、 obsA 是整合的位点。 10. 一种用于改善刺糖多孢菌菌株的发酵过程的方法， 包括 ： 将遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇作为用于整合和表达目的靶基因的中性位点整合入刺 糖多孢菌基因组。 11. 一种制备刺糖多孢菌菌株的方法， 其中将特定拷贝数的选定基因或选定 DNA 分子 整合入刺糖多孢菌基因组， 其中所述方法包括 ： 将所述选定基因或所述选定 DNA 分子克隆至移动元件中， 其中有至少一个标志基因定 位在所述移动元件中 ； 将含有所述选定基因或所述选定 DNA 分子的所述移动元件整合入所述剌糖多孢菌菌 株的染色体或附加体 ； 用功能基因补充所述移动元件 ； 表达所述功能移动元件基因 ； 权 利

7、 要 求 书 CN 102816783 A 2 2/2 页 3 以获得含有特定拷贝数的所述选定基因或选定 DNA 分子的菌株的方式在对于所述标 记基因为选择性的培养基上选择所述菌株 ； 并 回收由此选择的菌株。 12. 权利要求 11 的方法， 其中所述染色体包含于质粒上并且通过转化引入。 13. 权利要求 12 的方法， 其中所述质粒包括用于整合多核苷酸的基因组基因座。 14. 权利要求 1 或 13 的基因组基因座中， 其中用于整合多核苷酸的基因组基因座是遮 蔽蛋白聚酮合成酶基因座。 15. 权利要求 14 的遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座， 其中所述遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座 用于多核苷酸的整合

8、， 并且其中所述遮蔽蛋白 PKS 基因 obsA 是整合位点。 16. 权利要求 1 或 10 的方法， 或权利要求 13 的基因组基因座， 其中多核苷酸的整合不 负面影响多杀菌素产生、 生长、 或其他期望的代谢特征。 17. 权利要求 14 的遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座， 其中所述遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座 作为中性位点发挥作用用于含有基因表达盒的多核苷酸的整合。 权 利 要 求 书 CN 102816783 A 3 1/19 页 4 刺糖多孢菌染色体的基因整合 0001 优先权 0002 本申请要求 2011 年 5 月 3 日提交的美国专利申请系列号为 13/100,220 的 “刺糖 多孢

9、菌染色体的基因整合” 的申请日的权益。 技术领域 0003 本发明应用于分子遗传学技术领域， 其中， 基因可以整合入刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa) 的染色体。一种关键的代谢工程方法是在对多杀菌素产生 或生长几乎没有到没有负面影响的染色体 DNA 区域整合和表达靶基因。 背景技术 0004 正 如 美 国 专 利 No.5,362,634 公 开 的， 发 酵 产 物 A83543 是 由 剌 糖 多 孢 菌 (Saccharopolyspora spinosa) 产生的相关化合物家族。该家族的已知成员被称作因子或 组分， 而且每一个都给予标识字母命名。 在下

10、文中这些化合物指多杀菌素A、 B等。 多杀菌素 化合物对于防治蜘蛛、 线虫类及昆虫， 尤其是鳞翅目 (Lepidoptera)、 双翅目 (Diptera) 物 种。这些化合物被认为对环境友好， 具有有吸引力的毒理学谱 (toxicological profile)。 0005 这些天然产生的多杀菌素化合物是大环内酯类， 由附接有两个脱氧糖的 21- 碳 四环内酯组成， 所述两个脱氧糖为一个中性糖 ( 鼠李糖 ) 和一个氨基糖 ( 福乐糖胺 (forosamine)( 参见 Kirst 等， (1991)。如果氨基糖不存在， 将该化合物称为假糖苷 配基 (pseudoaglycones)A、

11、D 等， 如果中性糖不存在， 则将该化合物称为反式假糖苷配基 (reverse pseudoaglycones)A、 D等。 更优选的命名法将假糖苷配基称为多杀菌素A17-Psa、 多杀菌素 D17-Psa 等， 而将反式假糖苷配基称为多杀菌素 A9-Psa， 多杀菌素 D9-Psa 等。 0006 天然产生的多杀菌素化合物可通过刺糖多孢菌菌株 NRRL18395、 18537、 18538、 18539、 18719、 18720、 18743 和 18823 以及由此而来的衍生物发酵产生。已经保藏了这些培 养物并使其成为美国农业部农业研究服务部门中西部地区北方区域研究中心 ( 北方大学 街

12、道 1815 号， 皮奥里亚， I11.， 61604) 的原种培养物保藏的一部分。 0007 美国专利 No.5,362,634 以及相应的欧洲专利号 0375316B1 涉及多杀菌素 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H 和 J。据称这些化合物通过培养选自 NRRL18395、 NRRL18537、 NRRL18538 和 NRRL18539 的新的微生物剌糖多孢菌的菌株产生。 0008 WO93/09126 涉及多杀菌素 L、 M、 N、 Q、 R、 S 和 T。其中还讨论了两种产生多杀菌素 J 的菌株 ： NRRL18719 和 NRRL18720， 和一种产生多杀菌素 Q、

13、R、 S 和 T 的菌株 ： NRRL18823。 0009 WO94/20518 和美国专利 No.5,670,486 涉及多杀菌素 K、 O、 P、 U、 V、 W 和 Y 及其衍 生物。其中也讨论了产多杀菌素 K 的菌株 NRRL18743。 0010 生产多杀菌素化合物的挑战源自需要鉴定并验证刺糖多孢菌基因组中的中性位 点， 其中包含基因表达盒的多核苷酸能够整合并稳定表达。在其他会赋予现存多杀菌素产 生菌株新的有益特征的基因表达盒之外， 引入的基因表达盒可含有生物合成基因， 所述生 物合成基因提供产生可具有不同杀虫活性谱的新的多杀菌素衍生物的方法， 或能增加多杀 说 明 书 CN 10

14、2816783 A 4 2/19 页 5 菌素的滴度水平的基因表达盒。 鉴定和引入导致多杀菌素化合物的产生增加的基因会是有 利的。 使用中性位点也会是有利的， 其中稳定的整合对多杀菌素产生、 生长或其他期望的代 谢特征造成很少的负面影响或没有负面影响。 发明内容 0011 本发明提供鉴定和验证刺糖多孢菌基因组中性位点的方法， 其中含有至少一种基 因表达盒的新的多核苷酸能够整合并稳定表达。 0012 本发明的一些实施方案包括刺糖多孢菌基因组中的中性位点的鉴定和验证， 其中 含有至少一种基因表达盒的新的多核苷酸能够整合并在后代中稳定表达。 0013 本发明的实施方案也可包括使用遮蔽蛋白聚酮合成酶

15、(obscurin polyketide synthase ； PKS) 基因座作为中性位点用于在刺糖多孢菌基因组中整合外源或天然的含有 基因表达盒的多核苷酸。 更具体地说， 在不负面影响多杀菌素产生、 生长或其他期望的代谢 特征的情况下， 可以破坏遮蔽蛋白聚酮合成酶 (PKS) 基因座的 obsA 基因。 0014 本发明的其他方法包括将多核苷酸整合入刺糖多孢菌菌种的染色体 DNA 中， 该方 法可用于产生杀虫剂、 其整合体， 并且还可用于整合体的应用。 0015 本发明的一些实施方案可包括鉴定刺糖多孢菌基因组中任何中性位点以及稳定 表达的含有基因表达盒的多核苷酸的整合的方法。 0016 本

16、发明的其他实施方案可包括将多核苷酸整合入刺糖多孢菌基因组中而不负面 影响多杀菌素产生、 生长或其他期望的代谢特征。 0017 本发明的其他实施方案可包括将含有基因表达盒的多核苷酸整合入刺糖多孢菌 基因组中， 所述多核苷酸的表达导致增加的多杀菌素产生。 0018 附图简述 0019 图 1 描绘了将粘粒克隆的末端序列定位到遮蔽蛋白基因簇上。显示重叠的粘粒克 隆。实心竖条表示相对于遮蔽蛋白基因簇的粘粒克隆 1E3 和粘粒克隆 2N14 中插入物的实 际大小。虚线表示只有一个粘粒末端在遮蔽蛋白基因簇中。 0020 图 2 描绘了质粒 pIJ773， 其含有阿泊拉霉素抗性表达盒 ( 标记为 aac(3

17、)IV)。 具体实施方式 0021 对于用于多杀菌素菌株改善的代谢工程有用的分子工具包括鉴定和验证剌糖多 孢菌基因组中可以引入基因表达盒的中性位点。中性位点定义为基因组中的 DNA 区域， 其 对刺糖多孢菌初级代谢活性、 多杀菌素产生以及其他期望的特征具有很少的负面影响或没 有负面影响。 鉴定的中性位点意图用于稳定整合和表达对于刺糖多孢菌为天然或异源的靶 基因， 其可以包括 ： i) 将有益的特征引入现有的多杀菌素产生菌株， 如异源血红蛋白基因 的表达 ； ii) 改善现有的多杀菌素产生菌株的特定特征 ( 例如改善由假糖苷配基到多杀菌 素的生物转换 ) ； iii) 在不同的中性位点引入同一基

18、因的多个拷贝， 从而最大化靶基因的 益处并确保工程化重组菌株的稳定性 ； 或 iv) 引入多个靶基因以同时消除两个或更多个控 制多杀菌素生物合成和产生的限速步骤的瓶颈。 刺糖多孢菌中对于生物体的初级代谢活性 非关键性的次级代谢途径表现为有吸引力的中性位点来源。在这些中， 非多杀菌素聚酮合 成酶基因簇尤其受到关注， 因为破坏该基因簇可能导致多杀菌素生物合成和产生所必需的 说 明 书 CN 102816783 A 5 3/19 页 6 常见乙酰 CoA 前体和辅因子的潜在竞争途径的消除。这可在靶基因的益处和增加的前体可 使用性间产生协同作用。 0022 在刺糖多孢菌染色体中整合的基因有很多不同的用

19、途。 无论天然或异源的克隆基 因， 均可以用于改善多杀菌素的产量和产生新的多杀菌素。通过在特定菌株的基因组中整 合双重拷贝的基因以克服该菌株中限速的酶来获得改善的产量。在有些情况下， 由于缺少 所需的酶使特定突变菌株中的生物合成途径被阻断， 而通过整合所需基因的拷贝可以恢复 期望的多杀菌素的产生。 在生物合成途径遭破坏的其他情况下， 可以产生不同的前体菌株。 0023 本文使用的下列定义将用作参考来解释权利要求和说明书。 0024 如本文使用的， 本发明中元件或组分前的不定冠词 “一 / 一个 / 一种” 针对该元件 或组分的出现 ( 如发生 ) 数量意图为非限制性的。因此，“一 / 一个 /

20、 一种” 应当被解读为 包括一个/一种或至少一个/至少一种， 并且元件或组分的单数形式也包括复数， 除非该数 明显表示单数。 0025 如本文使用的， 术语 “包含” 和 “包括” 意指存在如权利要求中涉及的规定的特征、 整体 (integer)、 步骤或组分， 但不排除存在或增加一个或多个其他特征、 整体、 步骤、 组分 或其组合。这意味着 “包含” 或 “包括” 一系列元件的组合物、 混合物、 过程 / 工艺、 方法、 物 品或装置不限于这些元件， 而是可能包括其他未明确列出的或其固有的元件。如本文使用 的，“或” 指相容的和互斥的 “或” 。例如， 以下任何一种都满足条件 A 或 B ：

21、 A 为真 ( 或存在 的 ) 且 B 为伪 ( 或不存在的 )， A 为伪 ( 或不存在的 ) 且 B 为真 ( 或存在的 )， 以及 A 和 B 均 为真 ( 或存在的 )。 0026 如本文使用的， 术语 “约” 修饰本发明中的成分或反应物的量， 或是用于指可能发 生的数字量的变化， 例如， 经由在现实的世界中用于制备浓缩物或使用溶液的典型测量和 液体处理过程 ； 经由这些过程中的意外错误 ； 经由用于制备组合物或实施方法的成分在制 造、 来源或纯度上的差异 ； 等等。术语 “约” 也包括由于从特定的初始混合物产生的组合物 的不同平衡条件而不同的量。无论有或没有术语 “约” 修饰， 权利

22、要求都包括所述量的等效 量。 0027 如本文使用的， 术语 “发明” 或 “本发明” 是非限制性术语， 旨在包含如说明书中描 述的和权利要求中记载的所有可能的变化。 0028 如本文使用的， 术语 “多肽” 和 “肽” 会是可以互换使用的， 用于指两个或更多个氨 基酸通过肽键连接在一起的聚合物。在一个方面， 该术语也包括多肽的表达后修饰， 例如， 糖基化、 乙酰化、 磷酸化等等。例如， 含有一个或多个氨基酸类似物或标记的氨基酸和肽模 拟物 (peptidomimetic) 的肽包括在该定义中。肽可能包含 L- 氨基酸。 0029 如本文使用的， 术语 “目的肽” 、“POI” 、“基因产物”

23、 、“靶基因产物” 和 “靶编码区基 因产物” 指由重组表达的外源基因编码的期望的异源肽 / 蛋白质产物。目的肽可包括任何 肽 / 蛋白质产物， 其包括但不限于蛋白质、 融合蛋白、 酶、 肽、 多肽和寡肽。目的肽的大小为 长度范围从 2 到 398 个氨基酸。 0030 如本文使用的， 术语 “遗传构建体” 指一系列用于调节生物体基因型或表型的连续 核酸。遗传构建体的非限制性实例包括但不限于核酸分子、 开放阅读框、 基因、 表达盒、 载 体、 质粒等等。 0031 如本文使用的， 术语 “内源基因” 指生物体基因组中在其天然位点的天然基因。 说 明 书 CN 102816783 A 6 4/1

24、9 页 7 0032 如本文使用的，“外源基因” 指正常情况下不存在于宿主生物体中， 但通过基因转 移引入该宿主生物体中的基因。 外源基因可包括插入到非天然生物体的天然基因或嵌合基 因。 0033 如本文使用的， 涉及特定生物体 / 基因组内的序列的术语 “异源的” 表明该序列源 自外源物种， 或者， 如果来自相同物种， 则通过有意的人为干预实质上进行了修饰而在组成 和 / 或基因组位点上不同于其天然形式。因此， 例如， 异源基因表达指通过将来自一种生物 体 / 基因组的基因置于不同的生物体 / 基因组中而表达该基因的方法。 0034 如本文使用的， 术语 “重组体” 指人工组合两个本来是单独

25、的序列片段 (otherwise separated segments of sequence)， 例如， 通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的 核酸片段。 “重组体” 还包括所提到的通过引入异源核酸而经过修饰的细胞或载体， 或衍生 自这样修饰的细胞的细胞， 但是不包括通过自然发生事件 ( 如， 自发突变、 天然转化、 天然 转导、 天然转座 ) 造成的细胞或载体的改变， 例如不存在有意的人为干预而发生的那些改 变。 0035 术语 “遗传工程化的 (genetically engineered)” 和 “遗传改变的” 指科学改变活 生物体中遗传物质的结构。其牵涉重组 DNA 的产生和使用

26、。更具体而言， 将其用于描述来 自天然存在的生物体的经遗传工程化或修饰的生物体。 遗传工程化可以通过许多本领域已 知的技术进行， 诸如例如使用质粒、 病毒或其他载体进行的基因取代、 基因扩增、 基因破坏、 转染、 转化。 遗传修饰的生物体， 例如遗传修饰的微生物， 也经常称作重组生物体， 如重组微 生物。 0036 如本文使用的， 术语 “破坏的” 或 “破坏” 在涉及基因时指已经通过遗传工程化或 通过改变该基因活性的天然原因而经过操作或修饰的基因。 这样的基因活性可以是增加的 或减少的。此外， 这样的破坏可能消除蛋白质功能。为了促进这种减少， 可以减少基因的 拷贝数， 诸如例如通过该基因的不

27、足表达 (underexpression) 或破坏该基因。与野生型基 因相比， 如果所述基因的转录水平降低则称该基因为 “表达不足的” 。这可以通过例如量化 mRNA量作为基因表达的指示的Northern印迹分析来测量。 如本文使用的， 如果与从野生型 基因产生的 mRNA 量相比， 产生的 mRNA 量减少了至少 1、 2、 5、 10、 25、 50、 75、 100、 200或甚至大于500， 则基因是表达不足的。 或者， 可使用弱启动子指导多核苷酸 的表达。在另一个实施方案中， 可以改变基因上游的启动子、 调节区和 / 或核糖体结合位点 来实现降低的表达。表达也可以通过减少信使 RNA

28、 的相对半衰期来降低。在另一个实施方 案中， 多肽的活性本身可以通过在多肽氨基酸序列中采用一个或多个减少活性的突变来减 少。例如， 改变多肽对其相应底物的亲和力可导致活性减少。同样， 可减少多肽的相对半衰 期。 在有降低的基因表达或降低的活性的任一情况下， 可以通过改变细胞培养基的组成和/ 或用于培养的方法来实现所述降低。如本文使用的 “降低的表达” 或 “降低的活性” 意指与 野生型蛋白质、 多核苷酸、 基因相比， 或与该多核苷酸或多肽降低之前存在的蛋白质的活性 和 / 或浓度相比， 至少 5、 10、 25、 50、 75、 100、 200或甚至超过 500的减少。 obsA 基因组基因

29、座的活性也可通过将蛋白质与其活性的特异性或通用抑制剂接触来降低。 在本文术语 “降低的活性” 和 “减少或消除的活性” 可互换使用。 0037 在另一个实施方案中， 可以改变基因上游的启动子、 调节区和 / 或核糖体结合位 点以实现增加的表达。过表达也可通过增加信使 RNA 的相对半衰期来降低。在另一个实施 说 明 书 CN 102816783 A 7 5/19 页 8 方案中， 多肽本身的活性可以通过在多肽氨基酸序列中采用一个或多个增加活性的突变来 增加。例如， 改变多肽对其相应底物的亲和力可导致增加的活性。同样， 可增加多肽的相对 半衰期。 在有基因过表达或增加的活性的任一情况下， 可以通

30、过改变细胞培养基的组成和/ 或用于培养的方法来实现所述增加。如本文使用的 “过表达” 或 “增加的活性” 意指与野生 型蛋白质、 多核苷酸、 基因相比， 或与该多核苷酸或多肽降低之前存在的蛋白质的活性和 / 或浓度相比， 至少 5、 10、 25、 50、 75、 100、 200或甚至超过 500的增加。obsA 基因组基因座的活性也可通过将蛋白质与其活性的特异性或通用抑制剂接触来增加。 在本 文术语 “过表达” 和 “增加的活性” 可互换使用。 0038 表述 “调控序列” 概括地指启动子序列、 核糖体结合位点、 转录终止序列、 上游调节 结构域、 增强子等等， 它们在宿主细胞中共同提供编

31、码序列的转录和翻译。 并不是所有这些 调控序列都始终需要存在于重组载体中， 只要期望的基因能够得到转录和翻译即可。 0039 “重组” 指两个 DNA 或 RNA 分子之间部分 DNA 或 RNA 序列的重排。 “同源重组” 发 生在两个 DNA 分子之间， 所述两个 DNA 借助存在于每个 DNA 分子中的同源的或互补的核苷 酸序列杂交。 0040 术语 “严格条件” 或 “在严格条件下杂交” 指在该条件下探针会优先与其靶亚序列 杂交， 且较低程度或完全不与其他序列杂交。 在核酸杂交实验如Southern杂交和Northern 杂交的语境中的 “严格杂交” 和 “严格杂交洗涤条件” 是序列依

32、赖性的， 并且在不同的环境 参数下是不同的。纽约埃尔塞维尔科学出版社的 Tiissen(1993) 的 生物化学和分子生物 试验技术 中第一部分第二章的 “用核苷酸探针杂交” 中关于杂交原理和核苷酸探针测定 法策略的概述 (Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 Overview of principles of hybridization and the strategy of

33、 nucleic acid probe assays， Elsevier， New York) 中有核苷酸杂交的详尽指南。一般来说， 高严格杂交和洗涤条件选择 为低于在限定的离子强度和 pH 下特定序列的热解链温度 (Tm) 约 5。Tm 指 ( 在限定的离 子强度和pH下)50的靶序列杂交到完全匹配的探针的温度。 非常严格条件选择为与特定 探针的 Tm 相等。 0041 用于互补核酸的杂交 ( 其在 Southern 或 Northern 印迹中的滤膜上具有超过 100 个互补残基 ) 的严格杂交条件的实例为， 具有 1mg 肝素的 50甲酰胺， 在 42， 使杂交过 夜进行。高严格洗涤条件

34、的实例是在 72， 0.15M NaCl， 约 15 分钟。严格洗涤条件的实例 是在 65， 0.2SSC 洗涤 15 分钟 ( 关于 SSC 缓冲液的描述参见， Sambrook 等， (1989)， 分 子克隆 - 实验室手册 ( 第二版 )1-3 卷， 冷泉港实验室， 冷泉港出版社， 纽约 (Sambrook et al.， (1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd ed.)Vo1.1-3， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Press， NY)。通常， 在高严格洗涤前

35、为低严格 洗涤， 以去除背景探针信号。用于例如超过 100 个核苷酸的双链体的中等严格洗涤的实例 是在 45， 1SSC， 15 分钟。对于例如超过 100 个核苷酸的双链体的低严格洗涤的实例是 在 40， 4-6SSC， 15 分钟。一般来说， 在特定的杂交测定法中， 与对于不相关的探针观察 到的相比为 2x( 或更高的 ) 信噪比表明检测到特异性杂交。在严格条件下彼此不杂交的核 酸， 如果它们编码的多肽基本上相同， 则仍为基本上相同的。 这发生在， 例如， 当核酸拷贝是 使用遗传密码所允许的最大密码子简并性来产生的时。 说 明 书 CN 102816783 A 8 6/19 页 9 004

36、2 本发明也涉及在严格条件下， 优选在高严格条件下可与如本发明的多核苷酸杂交 的分离的多核苷酸。 0043 如本文使用的， 术语 “杂交” 旨在描述杂交和洗涤条件， 在该条件下， 彼此至少约 50、 至少约 60、 至少约 70， 更优选至少约 80， 甚至更优选至少约 85至 90， 最优 选至少 95同源的核苷酸序列通常保持彼此杂交。 0044 在一个实施方案中， 本发明的核酸与本申请中所示的核酸序列或其互补物为至 少 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99或更高同源的。

37、0045 严格杂交条件的另一个非限定性实例是， 在约 45在 6 氯化钠 / 柠檬酸钠 (SSC) 中杂交， 随后在 50， 优选在 55， 更优选在 60， 并且甚至更优选在 65， 在 1SSC、 0.1 SDS 中进行一次或多次洗涤。 0046 高严格条件可包括在 42温育数天的时间， 如 2-4 天， 使用标记的 DNA 探针， 例如 洋地黄毒苷 (DIG) 标记的 DNA 探针， 随后为在室温在 2SSC、 0.1 SDS 中的一次或多次 洗涤， 和在 65-68在 0.5SSC、 0.1 SDS 或 0.1SSC、 0.1 SDS 中的一次或多次洗涤。 具体而言， 高严格条件包括，

38、 例如， 使用 DIG 标记的 DNA 探针 ( 由例如使用 DIG 标记系统制 备 ； 罗氏诊断有限公司， 68298 曼海姆， 德国 (Roche Diagonostics GmbH， 68298Mannheim， Germany)， 在溶液中， 如 DigEasyHyb 溶液 ( 罗氏诊断有限公司 (Roche Diagonostics GmbH)( 含有或不含 100ug/ml 鲑精 DNA)， 或包含 50甲酰胺、 5SSC(150mM NaCl、 15mM 柠 檬酸钠 )、 0.02十二烷基硫酸钠、 0.1 N- 月桂酰肌氨酸和 2封闭试剂的溶液 ( 罗氏诊 断有限公司(Roche

39、 Diagonostics GmbH)， 在42温育2小时到4天， 随后在室温在2SSC 和 0.1 SDS 中洗涤滤膜 2 次， 5-15 分钟， 然后再在 65-68， 在 0.5SSC 和 0.1 SDS 或 0.1SSC 和 0.1 SDS 中洗涤两次， 15-30 分钟。 0047 在一些实施方案中， 在高严格条件下与本发明的核苷酸序列杂交的本发明的分离 的核酸分子可对应于天然存在的核酸分子。如本文使用的，“天然存在的” 核酸分子指具有 自然界中存在的核苷酸序列的 RNA 或 DNA 分子 ( 例如， 编码天然蛋白质 )。 0048 本领域技术人员会知道哪些条件适用于严格和高严格杂交

40、条件。 现有技术中可以 容易地获得关于这些条件的其他指导， 例如， Sambrook 等， 1989， 分子克隆， 实验室手册， 冷 泉港出版社， 纽约 (Sambrook et al.， 1989， Molecular Cloning， A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Press， N.Y.) ； 和 Ausubel 等 ( 编辑 )， 1995， 分子生物学的通用流程 (Current Protocols in Molecular Biology)， (John Wiley&Sons， 纽约 )。 0049 含有多杀菌素生物合成酶基因的 DN

41、A 的克隆片段会使在多杀菌素产生中编码限 速酶的基因能够加倍 (duplication)。这能够用于在任何编码的活性之一限制了期望的多 杀菌素合成的情况中来提高产量。 当多杀菌素聚酮合成酶连锁的基因通过将含有它们的粘 粒整合入刺糖多孢菌而加倍时， 观察到多杀菌素 A/D 的产量增加 (Madduri 等， 2001)。在另 一个实例中， 在弗氏链霉菌 (Streptomyces fradiae) 的发酵中， 通过加倍编码限速甲基转 移酶的基因实现了这种类型的产量增加， 所述甲基转移酶使大菌素转化为泰乐菌素 (Baltz 等， 1997)。 0050 特定的中间体 ( 或它们的天然衍生物 ) 能

42、够通过刺糖多孢菌的突变菌株合成， 在 所述刺糖多孢菌的突变菌株中， 已经破坏了某些编码多杀菌素生物合成的酶的基因。这样 说 明 书 CN 102816783 A 9 7/19 页 10 的菌株可以通过经由同源重组整合含有靶基因的内部片段的诱变质粒来产生。在质粒整 合后， 形成生物合成基因的两个不完整拷贝， 由此消除其编码的酶功能。这种酶的底物， 或 其一些天然衍生物， 应在该突变菌株发酵时积累。将这样的策略有效地用于生成产生新的 6- 脱氧红霉素衍生物的红色糖多孢菌 (Saccharopolyspora erythraea) 菌株 (Weber 和 McAlpine， 1992)。 0051

43、这样的菌株可经由双交换同源重组通过与诱变质粒交换靶区产生， 所述诱变质粒 含有在所述靶区侧翼的非突变序列之间的新片段。 该杂合基因会产生具有改变的功能的蛋 白质， 其或是缺少活性， 或是实施新的酶促转化。新的衍生物会在所述突变菌株发酵时积 累。 将这样的策略有效地用于生成产生新的脱水红霉素衍生物红色糖多孢菌菌株(Donadio 等， 1993)。 0052 克隆了多杀菌素生物合成基因和相关的 ORF， 并确定了各自的 DNA 序列。克隆的 基因和 ORF 在下文中命名为 spnA、 spnB、 spnC、 spnD、 spnE、 spnF、 spnG、 spnH、 spnI、 spnJ、 sp

44、nK、 spnL、 spnM、 spnN、 spnO、 spnP、 spnQ、 spnR、 spnS、 ORFL15、 ORFL16、 ORFR1、 ORFR2、 剌糖 多孢菌 gtt、 刺糖多孢菌 gdh、 刺糖多孢菌 epi 和刺糖多孢菌 kre。 0053 刺糖多孢菌产生统称为 “多杀菌素” 的 9 种密切相关的化合物的混合物。在该混 合物中， 称为 Spinosad 的多杀菌素 A 和 D 是主要组分并具有针对关键昆虫目标的活性。多 杀菌素 J 和 L， 两种在多杀菌素混合物中的次要组分， 是乙基多杀菌素的前体， 乙基多杀菌 素是另一种多杀菌素类杀虫剂。 0054 Spinosad 是

45、一种由 Dow AgroSciences(Indianapolis， Ind.) 生产的杀虫剂， 该杀虫剂主要含有约 85的多杀菌素 A 和约 15的多杀菌素 D。多杀菌素 A 和 D 是由 刺糖多孢菌发酵产生的天然产物， 如美国专利 No.5,362,634 中公开的。Spinosad 是可 从 Dow AgroSciences 商购获得的数种杀虫制剂中的活性成分， 所述制剂包括 TRACERTM、 SUCCESSTM、 SPINTORTM和CONSERVETM昆虫防治产品。 例如， TRACER产品包含约44到约48 Spinosad(w/v)， 或每加仑约4磅的Spinosad。 已经确

46、定了颗粒和液体制剂中的多杀菌素化 合物用于控制蜘蛛、 线虫和昆虫， 特别是鳞翅目 (Lepidoptera)、 缨翅目 (Thysanoptera) 和 双翅目 (Diptera) 物种的用途。多杀菌素 A 和 D 在此也称作多杀菌素 A/D。 0055 乙基多杀菌素是 5， 6- 二氢 -3 - 乙氧基多杀菌素 J( 主要成分 ) 和 3 - 乙氧基 多杀菌素 L 的混合物， 由 Dow AgroScience 生产。该混合物可以通过乙氧基化多杀菌素 J 和多杀菌素 L 的混合物， 再进行氢化来制备。多杀菌素 J 的 5， 6 双键及其 3 - 乙氧基比多 杀菌素 L 和其 3 - 乙氧基衍

47、生物更加易于氢化， 原因是多杀菌素 L 及其 3 - 乙氧基衍生 物中 C-5 上的甲基的空间位阻。参见， 美国专利 No.6,001,981。多杀菌素 J 和 L 在此也称 作多杀菌素 J/L。 0056 此处使用常规表示法来描述多核苷酸序列 ： 单链多核苷酸序列的左手端是 5 端 ； 双链多核苷酸序列的左手方向称为 5方向。向新生 RNA 转录物从 5到 3添加核苷 酸的方向称为转录方向。与 mRNA 具有相同序列的 DNA 链称为 “编码链” ； 在具有与转录自该 DNA 的 mRNA 相同序列的 DNA 链上且位于该 RNA 转录物 5 端的 5 的序列称作 “上游序列” ； 在具有与

48、 RNA 相同序列的 DNA 链上且位于该编码 RNA 转录物 3 端的 3 的序列称作 “下游 序列” 。 0057 在某些用于改善剌糖多孢菌菌株改良的实施方案中， 通过将基因表达盒整合入 说 明 书 CN 102816783 A 10 8/19 页 11 刺糖多孢菌的基因组中来产生稳定的多核苷酸转化体。这通过使用染色体 DNA 的一部分 和插入元件经由同源重组整合基因来实现的。基于这种重组并作为其应用的结果， 分别将 aac(3)IV和vhb基因表达盒整合入了刺糖多孢菌染色体中遮蔽蛋白聚酮合成酶(PKS)基因 座处， 导致天然基因 obsA 的失活。 0058 本发明的其他实施方案可包括将

49、多核苷酸整合入刺糖多孢菌基因组， 而不负面影 响多杀菌素产生、 生长和其他期望的代谢特征。 0059 本发明的另外的实施方案可包括将包含基因表达盒的多核苷酸整合入刺糖多孢 菌基因组， 其表达导致增加的多杀菌素产生。 0060 本发明的实施方案也可以包括将多核苷酸整合入剌糖多孢菌基因组的中性位点， 并且随后在相同位置叠加第二多核苷酸。其中， 利用剌糖多孢菌内的中性位点作为引入额 外的多核苷酸的优选基因座。 0061 本发明的其他实施方案可以包括将含有基因表达盒的多核苷酸整合入刺糖 多孢菌基因组的中性位点， 并且随后从整合的多核苷酸中去除选择性标志表达盒。其 中， 除了现有技术中已知的其他切除方法外， 用于去除所述选择性标志表达盒的方 法是双交换方法、 使用 CRE-LOX 的切除方法、 使用 FLP-FRT 的