文蛤微卫星标记的检测方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102851357 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102851357 A *CN102851357A* (21)申请号 201210112746.2 (22)申请日 2012.04.17 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 刘保忠 卢霞 王鸿霞 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 周秀梅 李颖 (54) 发明名称 文蛤微卫星标记的检测方法 (57) 摘要 本发明涉及文蛤 DNA 分子遗传标记技术， 涉及一种

2、文蛤微卫星标记的检测方法。首先 利用文蛤 EST 序列获取微卫星标记的微卫星 核心序列， 并在其序列两端设计特异性引物并 进行 PCR 扩增， 对 PCR 产物进行非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳检测， 从而检测文蛤个体的基因 型， 及在此微卫星位点的遗传变异， 获得文蛤 该位点的遗传多态性图谱 ； 所述特异性引物为 正 链 ： 5 -TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3 ， 负 链 ： 5 -AGCATTCACGACACCAACAT-3 。本发明可快捷地 获得文蛤微卫星标记基因座位的多态性图谱， 方 法简便、 准确， 进而可快速获得不同地理群或文蛤 群体内个体间遗传标记、 系谱认证、 遗传

3、图谱构建 等。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 文蛤微卫星标记的检测方法， 其特征在于 ： 首先利用文蛤 EST 序列获取微卫星标记 的微卫星核心序列， 并在其序列两端设计特异性引物并进行PCR扩增， 对PCR产物进行非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 从而检测文蛤个体的基因型， 及在此微卫星位点的遗传变异， 获得文蛤该位点的遗传多态性图谱 ； 所述特异性引物为正链 ： 5 -TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3 ，

4、 负链 ： 5 -AGCATTCACGACACCAACAT-3 。 2. 按权利要求 1 所述的文蛤微卫星标记的检测方法， 其特征在于 ： 所述使用微卫星核 心序列两端设计的特异性引物序列时的退火温度为 58。 3. 按权利要求 1 所述的文蛤微卫星标记的检测方法， 其特征在于 ： 所述 PCR 扩增参数 为 ： 100ng 待测不同地理群体或群体内文蛤个体的基因组 DNA， 10PCR Buffer， 2.5L ； Mg2+， 1.5mmol/L ； rTaq(5U/L)， 0.2L ； dNTP(10mmol/L)， 0.5L ；上 述 正 反 向 引 物 (10mol/L)， 各 0.5

5、L ； 加双蒸水补体系到 25L。 4. 按权利要求 1 或 3 所述的文蛤微卫星标记的检测方法， 其特征在于 ： 所述 PCR 扩增 为 ： 94预变性 5min， 30 个循环， 72延伸 10min， 4保存。 5. 按权利要求 4 所述的文蛤微卫星标记的检测方法， 其特征在于 ： 所述 PCR 扩增为 ： 94变性 40s， 58退火 40s， 72延伸 50s。 权 利 要 求 书 CN 102851357 A 2 1/3 页 3 文蛤微卫星标记的检测方法 技术领域 0001 本发明涉及文蛤 DNA 分子遗传标记技术， 涉及一种文蛤微卫星标记的检测方法。 背景技术 0002 文蛤是广

6、盐性贝类， 分布于中国、 朝鲜、 日本等亚洲国家。文蛤具有极高的营养价 值和经济价值， 已成为我国大量出口的重要鲜活水产品之一。 由于文蛤养殖具有投资小、 见 效快、 效益高等优点， 得到了很大发展。为合理利用和保护文蛤野生种质资源， 一些学者利 用同工酶技术、 RAPD 技术以及 AFLP 技术研究了文蛤的遗传结构及其遗传多样性 ( 林志华 等，大连水产学院学报 ， 2009， 第 6 期， 525-530 页 ； 沈怀舜等，海洋学报 ， 2003， 第 25 期， 97-102 页 ； 赫崇波等，中国水产科学 ， 第 2 期， 215-221 页 )。 0003 然而由于同工酶标记、 RA

7、PD 标记和 AFLP 标记都属于显性遗传标记， 检测效率不如 微卫星标记等共显性标记高。另外， 同工酶标记的缺点是多态性低， RAPD 标记的稳定性不 好， AFLP 标记操作繁琐， 这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生 物基因组中， 其特点是种类多， 等位基因数目多， 多态性高， 共显性， 孟德尔遗传方式， 并随 即分布于基因组中， 而且微卫星标记检测效率高， 结果稳定。目前， 文蛤微卫星标记开发滞 后， 标记数量不足， 限制了该物种分子遗传学研究的发展。所以， 迫切需要获取微卫星标记 以进行文蛤遗传多样性和系谱认证等方面的研究和应用。 发明内容 0004 本发明的目的

8、是提供一种文蛤微卫星标记的检测方法。 0005 为实现上述目的， 本发明采用技术方案为 ： 0006 文蛤微卫星标记的检测方法 ： 首先利用文蛤 EST 序列获取微卫星标记的微卫星核 心序列， 并在其序列两端设计特异性引物并进行PCR扩增， 对PCR产物进行非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳检测， 从而检测文蛤个体的基因型， 及在此微卫星位点的遗传变异， 获得文蛤该 位点的遗传多态性图谱 ； 0007 所 述 特 异 性 引 物 为 正 链 ： 5 -TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3 ， 负 链 ： 5 -AGCATTCACGACACCAACAT-3 。 0008 所述使用微卫星核心序列两

9、端设计的特异性引物序列时的退火温度为 58。 0009 所述 PCR 扩增参数为 ： 100ng 待测不同地理群体或群体内文蛤个体的基因组 DNA， 10PCR Buffer， 2.5L ； Mg2+， 1.5mmol/L ； rTaq(5U/L)， 0.2L ； dNTP(10mmol/L)， 0.5L ； 上述正反向引物 (10mol/L)， 各 0.5L ； 加双蒸水补体系到 25L。 0010 所述PCR扩增为 ： 94预变性5min， 30个循环， 72延伸10min， 4保存。 所述PCR 扩增为 ： 94变性 40s， 58退火 40s， 72延伸 50s。 0011 所述非变性

10、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 将 PCR 扩增反应产物进行 8非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳 -EB 染色系统进行检测， 在凝胶成像系统下观察， 如果某一微卫星位点在 不同个体中可以扩增出大小不同的片段， 即认为这个位点是多态性位点， 因此在不同个体 说 明 书 CN 102851357 A 3 2/3 页 4 间获得的多态性等位基因， 就是本位点的遗传变异图谱。 0012 本发明所具有的优点， 本发明可快捷的获得微卫星标记的遗传变异图谱， 方法简 便。而且， 相对于其他分子遗传标记技术而言， 微卫星标记符合孟德尔遗传模式， 呈共显性 遗传， 所得结果可直观地检测出文蛤每个个体的基因型 ； 而应用于不

11、同地理群体或文蛤群 体内个体间遗传标记、 系谱认证和遗传图谱的构建等。 附图说明 0013 图 1 是本发明实施例提供的获得微卫星标记 MM33945 对文蛤 30 个个体的检测图 谱 ( 编号 1-30 是文蛤的 30 个个体 )。 具体实施方式 0014 下面通过实施例详细叙述本发明。 0015 首先提取文蛤新鲜组织中的基因组 DNA 并稀释备用 ； 再利用文蛤 EST 序列中含有 的微卫星核心序列， 在其序列两端设计特异性引物 ； 然后使用该引物对文蛤不同地理或文 蛤群体内个体的基因组DNA进行PCR检测， 对PCR产物进行8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测， 确定每个个体的基因型， 即获

12、得文蛤的遗传多态性图谱。 0016 实施例 1 0017 1. 利用信息学分析方法， 获得一个含有微卫星序列的 EST MM33945， 具体过程如 下 ： 使用 MicroSAtellite(MISA， http:/pgrc.ipk-gatersleben.de/misa) 软件对已有的 文蛤幼虫转录组 EST 序列进行查找， 筛选含有微卫星的序列， 确认为微卫星的条件是 ： 两碱 基重复12bp、 三碱基重复15bp、 四碱基和五碱基重复20bp， 六碱基重复24bp， 从找 到的微卫星序列中筛选出具有足够侧翼序列可用于引物设计的序列 MM33945， 其序列为 ： 0018 AATTTC

13、TATCATTAATGGAAGGCGATCATGACTCTTATAGGGAAACGCTGGCAAATTATCACAGATGGT AGGGATCTAGTACTATCCCAGGAACGATTGTTAGGTAAATTGCCTGTATTTAACGGATATAATGTTAAAAAACGGGT GCTTAACTTCTAAATTGTAATACGTACATGTACTTACAAAGTATATATATATATATATATATAGACATACTATGTTG GTGTCGTGAATGCTGAAAGTTTATTTTGCCATCACAATACCAGTACTTTTACTTCTTTTTATCCT 0019 其中， 微卫星核心

14、序列为 ： TATATATATATATATATATATA 0020 2. 根据获得的上述序列， 设计的 MM33945 微卫星引物序列为 ： 0021 正链 ： 5 -TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3 ， 0022 负链 ： 5 -AGCATTCACGACACCAACAT-3 ， 0023 使用该引物时的退火温度为 58。 0024 3. 提取文蛤基因组 DNA， 将其稀释为 50ng/L， 每个 PCR 反应中加入 2L， 反应总 体积为25L。 PCR扩增的加样参数 ： 每个PCR反应总体积为25L， 包括100ng文蛤基因组 DNA， 10PCR buffer， 2.5L ；

15、 Mg2+， 1.5mmol/L ； rTaq(5U/L)， 0.2L ； dNTP(10mmol/L)， 0.5L ； 上述正反向引物 (10mol/L)， 各 0.5L ； 加双蒸水补体系到 25L。使用该引物 时设置 PCR 的程序参数为 ： 94预变性 5min， 30 个循环 (94变性 40s， 58退火 40s， 72 延伸 50s)， 72延伸 10min， 4保存。 0025 4.PCR扩增反应产物进行8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测， 在凝胶成像系统下观察记录成像结果， 结果显示 MM33945 微卫星位点在不同个体中可以扩 说 明 书 CN 1028513

16、57 A 4 3/3 页 5 增出大小不同的片段， 即这个位点是多态性位点， 因此在不同个体中由多态性等位基因组 成的基因型， 就获得了文蛤 MM33945 微卫星标记的遗传变异图谱。 0026 实施例 2 0027 1. 文蛤基因组 DNA 的提取 ： 0028 对来自文蛤山东群体的 30 个个体 ( 编号 1-30) 分别取 30mg 新鲜组织， 剪 切成尽可能小的碎片， 加入到 1.5ml Eppendorf 管中， 再加入细胞裂解液 (10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)， 0.1mmol/L EDTA(pH8.0)， 0.5 (m/V)SDS)500L 和 20mg/ml

17、的蛋白酶 K 5L， 轻轻摇匀， 37过夜。然后再裂解好的样品中加入 600L 酚、 氯仿和异戊醇混合液 (酚 ： 氯仿 ： 异戊醇体积比25241)， 晃动20min后12000rpm离心10min， 取上清液。 再 加入酚、 氯仿和异戊醇混合液， 重复上述操作 2 次。再取上清液加入 2 倍体积冷却无水乙醇 和上清液 1/10 体积的 3mmol/L 的醋酸钠， 12000rpm 离心 10min， 弃上清液， 保留 DNA 沉淀， 再用 70乙醇洗涤 2 次， 待乙醇挥发完全后， 以 TE 缓冲液溶解 DNA， 4保存。 0029 2. 微卫星引物的设计 ： 在文蛤 EST 序列基础上，

18、 利用微卫星 DNA 两侧的序列 在同一物种相对于核心序列的高度保守性， 据此在其两侧设计特异性引物， 用其扩增出 该位点的微卫星片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高， 造成微卫星 DNA 核心序 列重复次数的增加或减少， 即微卫星核心序列两端的特异性引物序列为 ： 正链， 正链 ： 5 -TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3 ， 负链 ： 5 -AGCATTCACGACACCAACAT-3 ， 使用该引物的退火温 度为 58。 0030 3.PCR 扩增 ： 首先加样， 加样参数如下 ： 待测文蛤基因组 DNA(50ng/L)， 2L ； 10PCR Buffer， 2.5L ；

19、Mg2+(25mmol/L)， 1.5L ； rTaq(5U/L)， 0.2L ； dNTP(10mmol/ L)， 0.5L ； 上述正反向引物 (10mol/L)， 各 0.5L ； 加双蒸水补体系到 25L。其次， 进 行 PCR 反应， 其 PCR 扩增仪程序参数为 ： 94预变性 5min， 30 个循环 (94变性 40s， 58退 火 40s， 72延伸 50s)， 72延伸 10min， 4保存。 0031 4.PCR产物的检测 ： PCR产物的检测步骤为， 各取5LPCR扩增反应产物， 在90V电 压下， 进行 8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 3h， 取下凝胶在浓度为 0.5L/ml 的 EB 染液中 染色 10min 后， ， 在凝胶成像系统下观察记录成像结果， 在不同个体中获得的由多态性等位 基因组成的基因型， 即为获得的文蛤的 MM33945 微卫星标记的遗传变异图谱 ( 参见图 1)。 说 明 书 CN 102851357 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102851357 A 6