G6PD缺乏症基因检测试剂盒.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102899411 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102899411 A *CN102899411A* (21)申请号 201210363243.2 (22)申请日 2012.09.26 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/32(2006.01) (71)申请人 广东凯普生物科技股份有限公司 地址 521000 广东省潮州市经济开发区试验 区北片高新区 D5-3-3-4 (72)发明人 陈伟坚 朱娟娟 卢敏 (54) 发明名称 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种 G6PD 缺乏症基因检测试 剂盒， 包

2、括 ： 一个基因芯片， 其上带有针对葡萄 糖 -6- 磷酸脱氢酶基因突变位点设计的突变检测 探针和对应的正常对照探针， 所述的突变检测探 针为 SEQ ID Nos ： 1-13 中的至少一条序列或其 反向互补的序列 ； 正常对照探针为 SEQ ID Nos ： 14-24 中的至少一条序列或其反向互补的序列 ； 还包含一组引物,用于扩增临床样本G6PD基因序 列， 引物的 DNA 序列为 SEQ ID Nos.25-34。本发 明可直接对待检者的基因型进行确诊， 大大降低 女性杂合子的漏诊率， 将检测时间缩短为 3.5 小 时左右， 实现 G6PD 基因的快速检测。 (51)Int.Cl.

3、权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 11 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 11 页 附图 6 页 1/1 页 2 1.G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 包括 ： （1） 一个基因芯片， 其上带有针对葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶基因突变位点设计的突变检 测探针和对应的正常对照探针， 所述的突变检测探针为 SEQ ID Nos ： 1-13 中的至少一条序 列或其反向互补的序列 ； 正常对照探针为 SEQ ID Nos ： 14-24 中的至少一条序列或其反向 互补的序列 ； （2） 还包含一组引物 ,

4、 用于扩增临床样本 G6PD 基因序列， 引物的 DNA 序列为 SEQ ID Nos.25-34。 2. 权利要求 1 所述试剂盒， 其特征在于， 所述探针 5或 3端经过胺基化处理。 3. 权利要求 1 所述试剂盒， 其特征在于， 所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。 4. 权利要求 1 所述试剂盒， 其特征在于， 所述引物的 5端标记有生物素。 权 利 要 求 书 CN 102899411 A 2 1/5 页 3 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒 技术领域 0001 0001 本发明涉及基因领域， 具体是用于诊断人葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 （glucose-6-phosphate deh

5、ydrogenase, 缩略词为 G6PD） 缺乏症的基因检测试剂盒。 背景技术 0002 0002 G6PD 缺乏症是最常见的一种遗传性酶缺乏病 , 俗称蚕豆病 , 全世界约 4 亿人受累。我国是本病的高发区之一， 约有 1 亿 G6PD 缺乏症患者， 主要分布在长江以南各 省， 以海南、 广东、 广西、 云南、 贵州、 四川等省为高。该病特征是平时无症状， 但患者的红细 胞容易受到某些特定物质的破坏而发生溶血， 导致溶血性贫血、 药物性溶血、 感染性溶血、 蚕豆病等， 最严重的是新生儿溶血， 导致核黄疸从而发展为儿童终身智力低下或死亡。 0003 G6PD 基因突变是引起 G6PD 缺乏症

6、的主要原因。G6PD 基因定位于 X 染色体， 男性 只有一条 X 染色体， 一旦有 G6PD 基因缺陷， 则表现为 G6PD 严重缺乏。女性有两条 X 染色 体， 若一条染色有 G6PD 基因缺陷， 则为杂合子， 其临床表现变化很大， 其酶活性可从正常至 完全缺乏， 给检出造成困难。如果 2 条 X 染色体都有 G6PD 基因缺陷， 则为纯合子， 表现为 G6PD 严重缺乏。在女性 G6PD 基因缺陷者中， 多以致病基因携带者 （杂合子） 普遍存在人群 中， 且酶活性不定 ； 但女性杂合子会将致病基因传给下一代， 如在她们妊娠、 生产、 哺乳期发 生急性溶血， 会导致新生儿溶血、 新生儿核黄

7、疸或发育生长迟缓等。 0004 目前临床上常用的 G6PD 缺乏症检测方法包括高铁血红蛋白实验、 荧光斑点法、 四 氮唑蓝定性定量法、 G-6-PD 活性直接测定、 G-6-PD/6-P-GD 比值法等。这些化学试验方法虽 然过程简单、 价格低廉， 适宜基层医院使用或普查， 但其准确性不高， 特别是对于女性杂合 子检出率不足 50%， 容易造成漏诊。 发明内容 0005 本发明目的是为了弥补现有化学试验方法对女性 G6PD 杂合子检出率的不足， 提 供一种 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒。 0006 本发明的 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 包括 ： （1） 一个基因芯片， 其上带有针对葡萄

8、糖 -6- 磷酸脱氢酶基因突变位点设计的突变检 测探针和对应的正常对照探针， 所述的突变检测探针为 SEQ ID Nos ： 1-13 中的至少一条序 列或其反向互补的序列 ； 正常对照探针为 SEQ ID Nos ： 14-24 中的至少一条序列或其反向 互补的序列， 探针序列如下 ： 名称 序列 序列号 95M 5 - GATACACGCATATTCATC -3 SEQ ID NO.1 392M 5 - TCCACCTGGTGTCACAG -3 SEQ ID NO.2 493M 5 - CTGGGACCGCATCATC -3 SEQ ID NO.3 592M 5 - ATCTACTGCAT

9、CGACCA -3 SEQ ID NO.4 871M 5 - TCAGGTCAAGATGTTGAAA -3 SEQ ID NO.5 说 明 书 CN 102899411 A 3 2/5 页 4 1004M 5 - ACCACCGTCACTTTTG -3 SEQ ID NO.6 1024M 5 - GCCGTCGTCTTCTATGT -3 SEQ ID NO.7 1311M 5 - CCTGACGCCTATGAGC -3 SEQ ID NO.8 1360M 5 - ACTTCGTGTGCAGGTGA -3 SEQ ID NO.9 1376M 5 - CGACGAGCTCCTTGAG -3 SEQ

10、 ID NO.10 1381M 5 - AGCTCCGTGAGACCTG -3 SEQ ID NO.11 1387M 5 - CCTGGTGTATTTTCACC -3 SEQ ID NO.12 1388M 5 - CCTGGCATATTTTCACCC -3 SEQ ID NO.13 95N 5 - CGGATACACACATATTCATC -3 SEQ ID NO.14 392N 5 - TCCACCTGGGGTCACAG -3 SEQ ID NO.15 493N 5 - GCTGGAACCGCATCATC -3 SEQ ID NO.16 592N 5 - CAGATCTACCGCATCGA

11、-3 SEQ ID NO.17 871N 5 - CAGGTCAAGGTGTTGAAA -3 SEQ ID NO.18 1004N 5 - ACCACCGCCACTTTTG -3 SEQ ID NO.19 1024N 5 - CCGTCGTCCTCTATGTG -3 SEQ ID NO.20 1311N 5 - CCTGACGCCTACGAGC -3 SEQ ID NO.21 1360N 5 - CACTTCGTGCGCAGGTG -3 SEQ ID NO.22 1376/1381N 5 - CTCCGTGAGGCCTGG -3 SEQ ID NO.23 1387/1388N 5 - CCTG

12、GCGTATTTTCACC -3 SEQ ID NO.24 （2） 还包含一组引物 (10 条 ), 用于扩增临床样本 G6PD 基因序列， 引物的 DNA 序列为 SEQ ID Nos.25-34， 引物序列如下 ： 名称 序列 序列号 exon2-F 5 - TCAAGAAAGGGGCTAACTTCTCAA -3 SEQ ID NO.25 exon2-R 5 - CACTTCCTGGCTTTTAAGATTGGG -3 SEQ ID NO.26 exon5-F 5 - AAGCTGGAGGACTTCTTTGC -3 SEQ ID NO.27 exon5-R 5 - ACACGCTCATAGA

13、GTGGTGG -3 SEQ ID NO.28 exon6-F 5 - TGGGAGGGCGTCTGAATGA -3 SEQ ID NO.29 exon6-R 5 - GGGCAAGGTGGAGGAACTG -3 SEQ ID NO.30 exon9-F 5 - ACACCCAAGGAGCCCATTC -3 SEQ ID NO.31 exon9-R 5 - ACTGCTGGTGGAAGATGTCG -3 SEQ ID NO.32 exon11/12-F 5 - TGGCATCAGCAAGACACTCTCT -3 SEQ ID NO.33 exon11/12-R 5 - CCTTTCCTCACC

14、TGCCATAAA -3 SEQ ID NO.34 所述的葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶基因突变位点为 cDNA95（AG） , cDNA392（GA） , cDNA493（AG） , cDNA592（CT） , cDNA871（GA） , cDNA1004（CT） , cDNA1024（CT） , cDNA1311（CT） , cDNA1360（CT） , cDNA1376（GT） , cDNA1381（GA） , cDNA1387（CT） 和 cDNA1388（GA） 。 0007 本发明上述的试剂盒， 所述探针 5或 3端经过胺基化处理。 0008 本发明上述的试剂盒， 所述基因芯片的探针是

15、固定在尼龙膜上。 0009 本发明上述的试剂盒， 所述引物的 5端标记有生物素。 说 明 书 CN 102899411 A 4 3/5 页 5 0010 本发明所述的基因芯片， 其制备方法包括以下步骤 ： （1） 合成SEQ ID Nos ： 1-24序列或与SEQ ID Nos ： 1-24互补的序列， 5或3端经过 胺基化 ； （2） 将上述探针固定在经活化处理好的尼龙膜上 ； （3） 以步骤 （2） 所得的尼龙膜利用氢氧化钠停止反应 , 制得基因芯片。 0011 利用本发明的试剂盒进行人 G6PD 基因检测的方法包括以下步骤 ： 利用试剂盒中 含特定序列的引物PCR扩增人基因组的DNA

16、； 对扩增后的DNA进行杂交 ； 检测基因芯片表面 上结合的 DNA。 0012 具体步骤如下 ： 第一步 ： 扩增样品 将临床样本中提取的DNA(人基因组DNA)通过试剂盒进行扩增， 所用引物的5端标记 有生物素， 扩增得到 5端带有生物素标记的 DNA 产物 ； 第二步 ： 杂交 使用导流杂交技术， 将上述扩增得到的 DNA 产物与基因芯片上面分布的 DNA 探针进行 反应 ； 第三步 ： 显色 在碱性磷酸酶 AP 酶的作用下， 利用 NBT/BCIT 系统显色， 肉眼直接观察结果。 0013 本发明与现有技术对比的有益效果 : 本发明是基于 PCR- 膜杂交技术的基因检测 方法， 一方面

17、通过对固定在基底上的 G6PD 基因突变检测探针和正常对照探针进行杂交， 显 色， 可直接对待检者的基因型 （正常、 女性杂合子、 纯合子） 进行确诊， 大大降低女性杂合子 的漏诊率。 同时结合导流杂交技术平台， 避免了传统杂交方法， 操作麻烦， 检测时间长 （一般 6 小时以上） 等缺点， 将检测时间缩短为 3.5 小时左右， 实现 G6PD 基因的快速检测。 附图说明 0014 以下是附图的说明， 便于理解上述发明的目的和具体特征。 0015 图 1 表示本发明基因芯片上探针的类型和具体的分布位置， 字母 N 代表正常对照 探针， 字母 M 代表突变检测探针。 “ ” 代表空位置， 不标记

18、。 0016 图 2 是表示本发明实施例的未检出 G6PD 基因突变样本结果示例， 其基因型为 ： N/ N。 0017 图 3 是表示本发明实施例的 G6PD 基因突变杂合子样本结果示例， 其基因型为 ： 1388M/N。 0018 图 4 是表示本发明实施例的 G6PD 基因突变纯合子样本结果示例， 其基因型为 ： 1376M/M。 0019 图 5 是表示本发明实施例的 G6PD 基因突变纯合子样本结果示例 , 其基因型为 ： 95M/M。 0020 图 6 是表示本发明实施例的 G6PD 基因双重突变杂合子样本结果示例， 其基因型 为 ： 1311M/N, 1360M/N。 具体实施方

19、式 以下通过实施例对本发明进行详细的说明。 说 明 书 CN 102899411 A 5 4/5 页 6 0021 实施例中， 20% 的 EDAC 溶液、 0.1% SDS、 0.25% 脱脂奶粉、 0.05% 硫柳汞、 0.05% 叠 氮钠均是指质量比， 0.1% Tween 20 是指体积比。 0022 步骤 1 基因芯片的制备 根据 G6PD 基因突变位点 cDNA95（AG） , cDNA392（GA） , cDNA493（AG） , cDNA592 （CT） , cDNA871（GA） , cDNA1004（CT） , cDNA1024（CT） , cDNA1311（CT） , c

20、DNA1360 （CT） , cDNA1376（GT） , cDNA1381（GA） , cDNA1387（CT） 和 cDNA1388（GA） ， 共设计 了13条突变位点探针 （SEQ ID Nos ： 1-13） 和11条正常对照突变探针 （SEQ ID Nos ： 14-24） 。 探针的长度一般在 14-25 个碱基左右， 探针 5或 3端进行胺基化处理。 0023 DNA 基因芯片的制作步骤如下 ： 将制备的探针首先溶解在超纯水中， 制成浓度为 200M的母液， 然后溶解在pH=8.4的0.5M Na2CO3和0.5M NaHCO3的溶液中， 使其最终浓度 为 5M。 0024 对

21、尼龙膜进行处理， 首先放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟， 然后把已除去残余溶 液的膜放进 20% 的 EDAC 溶液中浸泡 15 分钟， 最后放在洗膜盘中用 200ml 的纯化水冲洗 10 秒钟， 此步骤重复 3 次， 再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为 20、 湿度为 45% 的 烘干箱内烘干 12 小时。将已烘干的尼龙膜用 Kimwipes 纸隔开， 装入封口薄膜袋中， 放进点 膜间的冰箱中， 贮藏在 4的温度下， 备用。 0025 通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述处理过的尼龙膜上， 每滴 0.4 l。点膜完成后， 将膜放置于室温 15 分钟， 进行反应。然后将膜

22、转入 0.1M NaOH 溶液 中浸泡 10 分钟， 停止反应。将洗好的膜转入温度为 20、 湿度为 45% 的烘干箱内放置 12 小 时， 即制得基因芯片。 0026 步骤 2 PCR 扩增 步骤 2-1 根据 G6PD 基因 13 个突变位点的序列资料 , 我们设计了 5 对引物用于扩增 （SEQ ID Nos.25-34） 。引物合成方法为常规的 DNA 合成方法， 引物的 5端带有生物素标 记。 0027 步骤 2-2 提取模板 DNA ： 使用其他商业化试剂盒从待检者的血液中提取基因组 DNA, 作为 PCR 扩增的模板。 0028 步骤 2-3 配制 PCR 反应液 ： 分两个 P

23、CR 反应体系进行扩增， 每 30L 反应体系 包括了 27.5l PCR MIX 、 0.5l DNA 聚合酶、 3l 处理好的样品 DNA（10-30ng） 。 0029 步骤 2-4 PCR 扩增 ： PCR 扩增程序为 95 C 10min， 95 C 变性 30 s、 56 C 退火 30s、 72 C 延伸 45s， 共 35 个循环， 最后一步 72 C 延伸 5min。得到生物素化的 DNA 扩增 产物。 0030 步骤 3 利用 DNA 基因芯片检测 DNA 扩增产物 利用导流杂交技术， 将步骤 2 中扩增得到的 DNA 扩增产物用步骤 1 中制备的基因芯片 进行检测， DN

24、A 扩增产物和基因芯片中尼龙膜上的探针反应， 最后根据显色情况进行判断。 0031 将获得的G6PD基因的两管扩增产物在95C下变性5分钟， 迅速转移到冰水混合 物中， 放置 2 分钟。然后加入到预先温浴到 45 C 的 0.8 mL 杂交液 （2SSC/0.1%SDS） 中， 混合后加入杂交仪的反应孔中， 应用于实施 1 制得的基因芯片， 45 C 杂交 20 分钟， 然后用 溶液 WB1（0.5SSC/0.1%SDS， 42 C 温浴） 清洗 3 遍。加入 0.5mL 封阻液 （0.25% 脱脂奶 粉， 0.05% 硫柳汞） ， 25 C 封闭 5 分钟。抽干后加入 0.5mL 的酶标液

25、（TBS 中溶解的带有链 说 明 书 CN 102899411 A 6 5/5 页 7 霉亲和素标记的 AP 酶） ， 酶标 5 分钟。用 0.8mL 溶液 A（TBS， 0.1% Tween20 及 0.05% 叠氮 钠） 清洗 4 遍， 然后加入 0.5mL 的显色液 （NBT/BCIP） ， 避光显色 5 分钟。最后用溶液 B 冲洗 3 遍， 晾干， 分析显色情况， 判读结果。 说 明 书 CN 102899411 A 7 1/11 页 8 序列表 广东凯普生物科技股份有限公司 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒 34 1 18 DNA 人工序列 95M 1 gatacacgca tattc

26、atc 18 2 17 DNA 人工序列 392M 2 tccacctggt gtcacag 17 3 16 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102899411 A 8 2/11 页 9 493M 3 ctgggaccgc atcatc 16 4 17 DNA 人工序列 592M 4 atctactgca tcgacca 17 5 19 DNA 人工序列 871M 5 tcaggtcaag atgttgaaa 19 6 16 DNA 人工序列 1004M 序 列 表 CN 102899411 A 9 3/11 页 10 6 accaccgtca cttttg 16 7 17 DNA 人工序

27、列 1024M 7 gccgtcgtct tctatgt 17 8 16 DNA 人工序列 1311M 8 cctgacgcct atgagc 16 9 17 DNA 人工序列 1360M 9 acttcgtgtg caggtga 17 序 列 表 CN 102899411 A 10 4/11 页 11 10 16 DNA 人工序列 1376M 10 cgacgagctc cttgag 16 11 16 DNA 人工序列 1381M 11 agctccgtga gacctg 16 12 17 DNA 人工序列 1387M 12 cctggtgtat tttcacc 17 13 18 序 列 表

28、 CN 102899411 A 11 5/11 页 12 DNA 人工序列 1388M 13 cctggcatat tttcaccc 18 14 20 DNA 人工序列 95N 14 cggatacaca catattcatc 20 15 17 DNA 人工序列 392N 15 tccacctggg gtcacag 17 16 17 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102899411 A 12 6/11 页 13 493N 16 gctggaaccg catcatc 17 17 17 DNA 人工序列 592N 17 cagatctacc gcatcga 17 18 18 DNA 人工序列

29、 871N 18 caggtcaagg tgttgaaa 18 19 16 DNA 人工序列 1004N 序 列 表 CN 102899411 A 13 7/11 页 14 19 accaccgcca cttttg 16 20 17 DNA 人工序列 1024N 20 ccgtcgtcct ctatgtg 17 21 16 DNA 人工序列 1311N 21 cctgacgcct acgagc 16 22 17 DNA 人工序列 1360N 22 cacttcgtgc gcaggtg 17 序 列 表 CN 102899411 A 14 8/11 页 15 23 15 DNA 人工序列 137

30、6/1381N 23 ctccgtgagg cctgg 15 24 17 DNA 人工序列 1387/1388N 24 cctggcgtat tttcacc 17 25 24 DNA 人工序列 exon2-F 25 tcaagaaagg ggctaacttc tcaa 24 26 24 序 列 表 CN 102899411 A 15 9/11 页 16 DNA 人工序列 exon2-R 26 cacttcctgg cttttaagat tggg 24 27 20 DNA 人工序列 exon5-F 27 aagctggagg acttctttgc 20 28 20 DNA 人工序列 exon5-

31、R 28 acacgctcat agagtggtgg 20 29 19 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102899411 A 16 10/11 页 17 exon6-F 29 tgggagggcg tctgaatga 19 30 19 DNA 人工序列 exon6-R 30 gggcaaggtg gaggaactg 19 31 19 DNA 人工序列 exon9-F 31 acacccaagg agcccattc 19 32 20 DNA 人工序列 exon9-R 序 列 表 CN 102899411 A 17 11/11 页 18 32 actgctggtg gaagatgtcg 20

32、 33 22 DNA 人工序列 exon11/12-F 33 tggcatcagc aagacactct ct 22 34 21 DNA 人工序列 exon11/12-R 34 cctttcctca cctgccataa a 21 序 列 表 CN 102899411 A 18 1/6 页 19 图 1 说 明 书 附 图 CN 102899411 A 19 2/6 页 20 图 2 说 明 书 附 图 CN 102899411 A 20 3/6 页 21 图 3 说 明 书 附 图 CN 102899411 A 21 4/6 页 22 图 4 说 明 书 附 图 CN 102899411 A 22 5/6 页 23 图 5 说 明 书 附 图 CN 102899411 A 23 6/6 页 24 图 6 说 明 书 附 图 CN 102899411 A 24