促红细胞生成素微球在制备治帕金森病运动并发症药物中的应用.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102871969 A (43)申请公布日 2013.01.16 CN 102871969 A *CN102871969A* (21)申请号 201210366613.8 (22)申请日 2012.09.28 A61K 9/16(2006.01) A61K 9/19(2006.01) A61K 38/18(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61P 25/16(2006.01) (71)申请人 上海交通大学医学院附属新华医院 地址 200092 上海市杨浦区控江路 1665 号 (72)发明人 刘振国 袁伟恩 张奇昕 戚辰 (74)专利代理机构

2、 上海卓阳知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31262 代理人 曹翠娟 (54) 发明名称 促红细胞生成素微球在制备治帕金森病运动 并发症药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了促红细胞生成素微球在制备 治帕金森病运动并发症药物中的应用， 所述的促 红细胞生成素微球是 ： 自然提取的促红细胞生成 素、 基因重组表达促红细胞生成素、 聚乙二醇修饰 的促红细胞生成素、 糖基化修饰的促红细胞生成 素或人血清融合的促红细胞生成素中的一种与 多糖制备成颗粒， 所述颗粒再与缓释材料制备成 微球。本发明的优点在于 ： 发掘了促红细胞生成 素微球的新医疗用途， 开拓了一个新的应用领域， 促红细胞生成素

3、微球治疗和预防帕金森病运动并 发症具有长效缓释、 无毒副作用、 顺应性好、 减轻 病人痛苦、 价格低等优点， 易于被患者接受， 促红 细胞生成素微球制备工艺简单， 对环境友好， 在治 疗和预防帕金森病运动并发症中有良好的应用前 景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 6 页 1/1 页 2 1. 促红细胞生成素微球在制备治帕金森病运动并发症药物中的应用， 其特征在于， 所 述的促红细胞生成素微球是 ： 自然提取的促红细胞生成素、 基因重组表达促红细胞生成

4、素、 聚乙二醇修饰的促红细胞生成素、 糖基化修饰的促红细胞生成素或人血清融合的促红细胞 生成素中的一种与多糖制备成促红细胞生成素多糖颗粒， 所述促红细胞生成素多糖颗粒再 与缓释材料制备成促红细胞生成素微球。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的促红细胞生成素多糖颗粒是指促 红细胞生成素与多糖在聚乙二醇溶液中通过冷冻干燥或喷雾干燥制备得到， 所述多糖是葡 聚糖或海藻酸钠中的一种。 3. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的缓释材料为聚乳酸、 聚羟基乙 酸 - 聚乳酸、 聚己内酯、 聚乳酸 - 聚乙二醇或聚羟基乙酸 - 聚乳酸 - 聚乙二醇中的一种。 4. 根

5、据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的促红细胞生成素微球是通过水包 油 - 油包固的方法或水包油 - 油包油 - 油包固的方法制备得到。 5. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的促红细胞生成素微球是通过皮下 注射或颅内注射。 6. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的促红细胞生成素微球的注射剂量 为 10 万单位 500 万单位 /kg。 7. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的促红细胞生成素微球的注射频率 为 7 天 60 天一次。 权 利 要 求 书 CN 102871969 A 2 1/9 页 3 促红细胞生成素微球在制备治

6、帕金森病运动并发症药物中 的应用 技术领域 0001 本发明涉及促红细胞生成素微球的新用途， 具体地说， 是促红细胞生成素微球在 制备治帕金森病运动并发症药物中的用途。 背景技术 0002 帕金森病 （Parkinson s disease， PD） 是中老年人常见的神经系统退行性疾患， 主要与黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失及由此造成的黑质纹状体通路多巴胺递质减 少有关。经过多年的临床实践， 一般认为， 左旋多巴仍是最有效的治疗帕金森病药物。但左 旋多巴长期应用后， 大部分患者会出现症状波动、 异动症 （1evodopa-induced dyskinesia， LID） 和精神症状， 即 P

7、D 运动并发症， 加之实验室发现高浓度多巴胺 （dopamine， DA） 和左旋 多巴会由于自身氧化产生自由基， 可导致神经细胞变性坏死， 因此， 联合其他药物共同预防 和治疗 PD 和 PD 运动并发症十分迫切。 0003 近年研究表明， PD 运动并发症的发生与表达 D1 受体的直接通路及其下游 cAMP 依 赖性蛋白激酶 （PKA） 、 ERK 等信号转导通路被激活关系密切， 其下游信号转导蛋白多巴胺和 环磷腺苷调节的磷酸化蛋白 -32（dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000， DARPP-32） 的蛋白 Thr75

8、 位点磷酸化表达的改变可能参与了异动症 （LID） 的发病。 0004 目前在 PD 运动并发症的预防方面， 主要采用 COMT 抑制剂、 金刚烷胺、 DR 激动剂、 L-dopa 甲酯或乙酯等。如中国专利文献 CN 200880108979.7， 公布日 2010 年 8 月 18 日， 公 开了一种 “用于改善帕金森病的运动并发症或精神症状的药剂” ， 所述的药剂具有 5- 羟色 胺1A受体部分激动剂作用， 同时对多巴胺D3受体具有激动剂作用， 对于在反复给药左旋多 巴时伴随产生的运动并发症具有改善和延迟发病的效果。 但是西药预防和治疗产生的副作 用较大， 容易形成耐药性， 不宜长期服用。

9、 0005 促红细胞生成素 （Erythropoictin， EPO） 是一种参与调节红细胞前体细胞分化、 增殖、 抑制凋亡的糖蛋白激素， 可以增加红血球的数目。近年来越来越多的研究表明， EPO 在神经发育、 神经保护和成年神经元修复、 生存、 再生过程中均发挥着非常广泛和复杂的作 用， 而且认为它的神经保护作用是一种不依赖于其促进红细胞生成功能的直接作用。 另外， EPO 及其受体 （Erythropoictin receptor， EPO-R） 在啮齿类、 哺乳类及人类的神经元和胶 质细胞均有表达。关于促红细胞生成素对 PD 模型的保护作用及其机制的实验研究已有报 道， 但是关于促红细胞

10、生成素与多糖、 缓释材料制备的微球用来治疗和预防 PD 运动并发症 的应用还未见报道。 发明内容 0006 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种促红细胞生成素微球在制备治 帕金森病运动并发症药物中的应用。 0007 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是 ： 说 明 书 CN 102871969 A 3 2/9 页 4 促红细胞生成素微球在制备治帕金森病运动并发症药物中的应用， 所述的促红细胞生 成素微球是 ： 自然提取的促红细胞生成素、 基因重组表达促红细胞生成素、 聚乙二醇修饰的 促红细胞生成素、 糖基化修饰的促红细胞生成素或人血清融合的促红细胞生成素中的一种 与多糖制备成促红

11、细胞生成素多糖颗粒， 所述促红细胞生成素多糖颗粒再与缓释材料制备 成促红细胞生成素微球。 0008 所述的促红细胞生成素多糖颗粒是指促红细胞生成素与多糖在聚乙二醇溶液中 通过冷冻干燥或喷雾干燥制备得到， 所述多糖是葡聚糖或海藻酸钠中的一种。 0009 所述的缓释材料为聚乳酸 （PLA） 、 聚羟基乙酸-聚乳酸 （PLGA） 、 聚己内酯 （PCL） 、 聚 乳酸 - 聚乙二醇 （PLA-PEG） 或聚羟基乙酸 - 聚乳酸 - 聚乙二醇 （PLGA-PEG） 中的一种。 0010 所述的促红细胞生成素微球是通过水包油 - 油包固 （S/O/W） 的方法或水包油 - 油 包油 - 油包固 （S/O

12、/O/W） 的方法制备得到。 0011 所述的促红细胞生成素微球是通过皮下注射或颅内注射。 0012 所述的促红细胞生成素微球的注射剂量为 10 万单位 500 万单位 /kg。 0013 所述的促红细胞生成素微球的注射频率为 7 天 60 天一次。 0014 本发明优点在于 ： 1、 本发明发掘了促红细胞生成素特制微球的新医疗用途， 开拓了一个新的应用领域 ； 2、 该促红细胞生成素微球作为药物治疗和预防 PD 运动并发症具有长效缓释、 无毒副 作用、 顺应性好、 减轻病人痛苦、 价格低等优点， 易于被患者接受 ； 3、 促红细胞生成素微球制备工艺简单， 对环境友好， 在治疗和预防 PD 运

13、动并发症中有 良好的应用前景。 附图说明 0015 附图 1 是大鼠脑脊液 EPO 含量结果。 0016 附图 2 是免疫组化检测大鼠脑内 EPO 结果。 0017 附图 3 是免疫组化检测大鼠脑内 EPO-R 结果。 0018 附图 4 是免疫组化检测大鼠黑质 TH 细胞结果。 0019 附图 5 是大鼠脑内黑质多巴胺能神经元计数结果。 0020 附图 6 是大鼠黑质 TH 的检测结果。 0021 附图 7 是大鼠纹状体 TH 的检测结果。 具体实施方式 0022 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 0023 实施例 1 促红细胞生成素微球的制备 一、 制备促红细胞生成素多糖

14、颗粒 用超纯水分别制备 10%（w/w） 的聚乙二醇 （PEG） 水溶液和 10%（w/w） 的葡聚糖水溶 液。精确称取 800mg 自然提取的促红细胞生成素溶于 7.2ml 超纯水中待用。 0024 在 0 4条件下， 将上述的葡聚糖水溶液、 促红细胞生成素水溶液和 PEG 水 溶液按照体积比为 1:1:5、 1:1:10、 1:1:20 或 1:1:40 的比例混合， 然后旋涡震荡 30s 60s 充分混匀。 说 明 书 CN 102871969 A 4 3/9 页 5 0025 将促红细胞生成素、 PEG 和葡聚糖形成的混合溶液冷冻过夜， 然后真空冷冻干 燥。 0026 将步骤所得的样品

15、用二氯甲烷洗涤三次除去 PEG 连续相， 获得载促红细胞生 成素多糖颗粒。 0027 得到的促红细胞生成素多糖颗粒的粒径为 0.3 5m， 这些玻璃体颗粒光滑圆 整， 粒径分布均匀， 促红细胞生成素的结构得到较好的保护， 避免了在剂型制备过程中失 活。 0028 二、 制备促红细胞生成素微球 称取1g聚乙烯醇 （PVA） 和5g NaCl， 加超纯水94g， 然后加热、 搅拌， 至PVA完全溶胀， 停止加热， 继续缓慢搅拌， 待溶液呈澄清透明且无气泡后， 停止搅拌， 放于 4冰箱待用。该 溶液中 PVA 浓度为 1（w/w） ， NaCl 浓度为 5（w/w） 。 0029 精确称取缓释材料聚

16、羟基乙酸 - 聚乳酸 （PLGA） 200mg， 加二氯甲烷 800mg， 漩涡 振荡， 使 PLGA 溶于二氯甲烷中， 得 PLGA 的二氯甲烷溶液， 浓度为 20（w/w） ， 现用现配， 以 防二氯甲烷挥发。 0030 称取促红细胞生成素多糖颗粒 10mg， 均匀分散于 0.5g 步骤中的 PLGA 的二氯 甲烷溶液中， 磁力搅拌 15min， 转速 1800rpm， 充分搅拌使得促红细胞生成素多糖颗粒均匀 分散于 PLGA 的二氯甲烷溶液中， 将所得初乳分散于含 1（w/w） PVA 和 5（w/w） 氯化钠 的水溶液中， 以 2200rpm 的转速匀浆成复乳 （S/O/W） ， 于

17、1min 内转移到 4的 10 （w/w） 氯 化钠的水溶液中固化， 搅拌 3 4 小时后收集陈化的蛋白微球， 用超纯水洗涤三次， 在冰相 预冻过夜， 再真空冷冻干燥， 制得粒径在 50m 120m 的微球。 0031 需要说明的是， 促红细胞生成素还可以是基因重组表达促红细胞生成素、 聚乙二 醇修饰的促红细胞生成素、 糖基化修饰的促红细胞生成素或人血清融合的促红细胞生成素 中的一种。 0032 所述的促红细胞生成素多糖颗粒还可以是促红细胞生成素与多糖在聚乙二醇溶 液中通过喷雾干燥制备得到， 所述多糖还可以是海藻酸钠。 0033 所述的缓释材料还可以是聚乳酸 （PLA） 、 聚己内酯 （PCL

18、） 、 聚乳酸 - 聚乙二醇 （PLA-PEG） 或聚羟基乙酸 - 聚乳酸 - 聚乙二醇 （PLGA-PEG） 中的一种。 0034 所述的促红细胞生成素微球还可以采用水包油 - 油包油 - 油包固 （S/O/O/W） 的 方法制备得到 （详见 ： Yuan W, Wu F, Guo M, Jin T. Development of protein delivery microsphere system by a novel S/O/O/W multi-emulsion. Eur J Pharm Sci, 2009, 36(2-3): 212-218. 袁伟恩 , 吴飞 , 葛梅燕， 金拓 .

19、 用一种新颖的水包油 - 油包油 - 油包 固的方法制备输送蛋白微球系统， 欧洲药剂科学杂志， 2009， 36（2-3） ： 212-218） 。制备的促 红细胞生成素微球可以用于皮下注射或颅内注射， 起到缓释和治疗 PD 运动并发症的作用。 0035 实施例 2 自然提取的促红细胞生成素制备的微球治疗 PD 运动并发症的临床前 试验 一、 实验方法 1. 异动症 （levodopa-induced dyskinesia， LID） 模型制备 大鼠腹腔注射 3的戊巴比妥麻醉后， 严格平颅位固定于大鼠脑立体定向仪上， 剪毛后 碘伏消毒头部皮肤， 沿正中线切开头皮， 15% 双氧水烧灼骨膜， 暴

20、露颅骨缝及前囟， 确定前囟 说 明 书 CN 102871969 A 5 4/9 页 6 坐标， 根据包新民等所著 大鼠脑立体定位图谱 ， 确定右侧前脑内侧束 （medial forebrain bundle， MFB） 注射位点 ： 前囟后 3.7mm， 矢状缝右侧 1.7mm， 颅骨下 8.0mm， 门齿线 2.4mm ； 前囟后4.4mm， 矢状缝右侧1.2mm， 颅骨下8.0mm， 门齿线2.4mm。 按上述确定的注射位点钻 孔， 用10l规格的微量注射器抽取6-OHDA 6l （溶于0.2%维生素C生理盐水， 浓度4g/ l） ， 每点注射 3l， 注射速度约 1l/min， 留针

21、5min 后缓慢退针， 退 4mm 再留针 5min， 直 至完全退出， 缝合皮肤切口， 置笼喂养。3 周后， 大鼠腹腔注射阿朴吗啡 （0.5mg/kg） 诱导旋 转， 平均旋转频率 7 次 /min 为成功 PD 大鼠模型。利用 6-OHDA 制备 PD 模型大鼠后， 腹腔 注射左旋多巴甲酯 / 苄丝肼 （50 mg/kg 左旋多巴甲酯和 25 mg/kg 苄丝肼溶于含 0.2% 维生 素 C 的消毒生理盐水中） 4 周， 制备 LID 大鼠模型。 0036 微球注射液预处理 自然提取的促红细胞生成素制备微球的方法见实施例 1。 0037 羧甲基纤维素 （CMC） 溶剂配方 ： 0.5%CM

22、C， 5% 甘露醇， 0.1% 吐温 -80， 加水溶解。 0038 EPO 微球注射液 ： 将 123mg 实施例 1 所制备的 EPO 微球溶于 7.5mlCMC 溶剂中， 得 到含 EPO 和 CMC 的混悬液， 即 EPO 微球注射液， 其中， EPO 的终浓度为 10000 U/ml。 0039 模型分组和行为学测定 随机将LID大鼠模型分为 ： LID组 （LID大鼠不再做进一步处理） 、 EPO微球10万单 位 /kg 组 （LID 大鼠皮下注射或颅内注射剂量为 10 万活性单位 /kg 大鼠的自然提取的 EPO 制备的微球） 、 EPO微球100万单位/kg组 （LID大鼠皮下

23、注射或颅内注射剂量为100万活 性单位 /kg 大鼠的自然提取的 EPO 制备的微球） 、 EPO 微球 500 万单位 /kg 组 （LID 大鼠 皮下注射或颅内注射剂量为 500 万活性单位 /kg 大鼠的自然提取的 EPO 制备的微球） 。另 设有假手术组 ： 正常SD大鼠， 不作任何处理。 各组大鼠经腹腔注射阿朴吗啡诱导旋转， 记录 其 30 分钟内旋转圈数， 计算各组大鼠每分钟的平均旋转圈数。 0040 大鼠脑脊液抽取 大鼠在注射 EPO 微球注射液 1 周后， 予腹腔注射 3的戊巴比妥麻醉后， 严格平颅位 固定于大鼠脑立体定向仪上， 剪毛后碘伏消毒头部皮肤， 解剖器械由 18G 针

24、头改造， 针尖 1.5mm， 用钳子改成 90 度角。30G 针连接 1ml 注射器用于收集脑脊液。改造枕头钝性分离表 层肌肉， 暴露环枕膜， 立即用连接 1ml 的 30G 针头以 30 度角度从切口的尾端刺入环枕膜， 进 入约 1mm， 抽取脑脊液。将脑脊液注入 0.5ml 的 EP 管中， -80下保存待用。 0041 免疫组化染色 大鼠在结束注射后的第 12h， 每组随机抽取 4 只大鼠用乙醚麻醉， 依次经心脏灌注预冷 的生理盐水 100ml 和 4% 多聚甲醛 300ml， 断头取脑， 相同固定液中后固定 8h， 经修块、 梯度 酒精脱水、 二甲苯透明、 浸蜡后用石蜡包埋。行石蜡切片

25、， 切片厚度为 5m。取纹状体冠状 层面采用链霉菌抗生物素蛋白 - 过氧化物酶连结法 （SP 法） 行免疫组化染色， 步骤如下 ： 石 蜡切片脱蜡至水 ； 3% 双氧水室温避光孵育 5min， 以消除内源性过氧化氢酶活性 ； pH7.7 的 1nmol/l EDTA-Tris-HCl 微波加热修复 ； 1%BSA-PTS（0.5%Triton-X100） 室温封闭 20min ； TH 受体单克隆抗体 （1:400， 1%BSA 稀释） 4湿盒内孵育过夜 ； 滴加稀释的生物素标记二抗， 37孵育 20min ； 滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素， 37孵育 20min ； 联苯二胺 （D

26、AB） 显色剂显色， 自来水冲洗， 之后脱水、 透明、 封片。各步骤之间均用 0.01mol/l PBS 充 分漂洗， PBS 代替一抗作为阴性对照。免疫组化切片各观察区随机取 5 个不重叠视野， 于高 说 明 书 CN 102871969 A 6 5/9 页 7 倍镜 （1040） 下观察， 采用 OLYMPUS-IX50 成相系统拍摄， Image-Pro Plus 5.1 图象处理软 件进行半定量分析， 计算 TH 受体阳性细胞指数 （IOD） = 阳性细胞面积 校正光密度值 （测 量区光密度背景光密度） 。 0042 蛋白免疫印迹 大鼠在最后一次注射 12h 后， 乙醚麻醉， 每组随机

27、抽取 4 只大鼠断头处死。迅速开颅 取脑， 快速冰上分离双侧纹状体， 每 10mg 组织加入 100l 蛋白裂解液 RIPA（含有 50mM pH7.4 Tris， 150mM NaCl， 1%Triton X-100， 1% sodium deoxycholate， 0.1% SDS以及sodium orthovanadate， sodium fluoride， EDTA， leupeptin 等） 和 1l 蛋白酶抑制剂 PMSF， 超声 充分匀浆， 冰上裂解 30 min， 然后置于 4离心机于 14000rpm 离心 30min， 吸取上清液至另 一 EP 管， 提取总蛋白， 测定蛋白

28、浓度后于 -80保存。 0043 蛋白电泳溶液配制。1 电泳缓冲液 (Running Buffer) ： 14.4g/L 甘氨酸， 3g/L Tris base， 1g/L十二烷基磺酸钠。 转膜缓冲液(Transter Buffer) ： 19.375 g Tris base， 0.75 g 甘氨酸， 200ml 甲醇加水至 1000ml。1 上样缓冲液 (Sample Buffer) ： 62.5mM Tris-HCl (pH6.8， 25)， 2% w/v十二烷基磺酸钠， 10%甘油， 50mM二硫苏糖醇， 0.01%w/v溴 酚蓝或酚红。 10TBS (Tris-buffered sal

29、ine) ： 封闭缓冲液(Blocking Buffer) ： 1TBS， 0.1% 吐温 -20 和 5% w/v 脱脂奶粉。第一抗体稀释液 ： 1TBS， 0.1% 吐温 -20 和 5% 封闭剂。 Wash Buffer TBS/T ： 1TBS， 0.1% Tween-20。 0044 配胶用 Bio-Rad 公司的专用配胶槽， 用 15l 微量注射器或 20l EPPENDORF 移 液枪加已变性的样品于加样孔中， 每加一个， 水冲洗针管。先在 100V 下电泳 30min， 再稳压 150V 电泳 60min。蛋白转膜， 250mA 的电流下转移 90min， 转膜后取膜。转膜后用

30、 25ml TBS 室温下洗膜5min ； 用25ml的封闭缓冲液室温下封闭1h ； 用15ml的Wash Buffer洗3次， 每 次 5min ； 按相应浓度稀释第一抗体 TH 抗体 （滴度为 1:400） 或抗 -actin 的兔抗溶液 （滴 度为 1:1000） ， 在 10ml 的一抗稀释缓冲液中， 4轻摇孵育膜过夜 ； 用 15ml 的 Wash Buffer 洗 3 次， 每次 5min ； 加第二抗体 （抗兔的 HRP 相连的 IgG ； 1:1000） 于 10ml 的封闭缓冲液中 室温下轻摇孵育膜 1h ； 用 15ml 的 Wash Buffer 洗 3 次， 每次 5m

31、in。配置 10ml 的 ECL 显色 混合液， 加于PVDF膜上， 置室温中反应， 去除多余液体， 用Imagelab图像分析软件计算各样 本目的蛋白条带 OD 值与面积值的乘积， 从而进行蛋白条带密度定量。每个样品的免疫印迹 蛋白条带与 -actin 相比较后， 得出一个密度比， 再进行统计学分析。 0045 统计学分析 采用 SPSS13.0 软件进行统计学处理。数据以均数 标准误差表示， 应用团体 t 检验 和单因素方差分析进行统计， 以 P 0.05 为显著性水平。 0046 二、 结果 1. 不同剂量 EPO 微球对大鼠模型旋转次数的影响 各组大鼠注射阿朴吗啡后， 其平均旋转圈数结

32、果见表 1， 假手术组大鼠 30 分钟内平均 旋转数为02圈/分钟， LID组大鼠30分钟内平均旋转数为192圈/分钟， 与假手术组相 比 P0.001 （*） ； 10 万活性单位 /kg EPO 微球组旋转数为 152 圈 / 分钟， 与 LID 组相比无 显著差异 ； 100 万活性单位 /kg EPO 微球组旋转数为 41 圈 / 分钟， 与 LID 组相比 P0.001 （#） ； 500 万活性单位 /kg EPO 微球组旋转数为 21 圈 / 分钟， 与 LID 组相比 P0.001（#） 。 结果表明自然提取的 EPO 制备的微球可以降低 LID 大鼠的不自主旋转次数， 其中，

33、 高剂量 说 明 书 CN 102871969 A 7 6/9 页 8 EPO 微球有十分明显的治疗效果。 0047 表 1 不同剂量 EPO 微球对大鼠模型旋转次数的影响 2. 脑脊液 EPO 检测结果 注射EPO微球1周后抽取大鼠脑脊液， Western blot检测EPO含量， 结果见附图1。 从图中可看出， EPO 微球组的大鼠脑脊液 EPO 含量与假手术组相比明显增加， P0.001(*) ； EPO 微球组的光密度值远远高于假手术组。其中 EPO 微球剂量为 100 万活性单位 /kg 大鼠。 0048 免疫组化检测结果 （1） EPO 及 EPO-R 检测结果 假手术组大鼠脑内

34、EPO 检测为阴性， 注射 EPO 微球 （100 万活性单位 /kg） 的大鼠脑内 EPO检测明显阳性， 说明注射了EPO微球后大鼠脑内可检测到较多的EPO阳性神经元。 请参 见图 2， A ： 假手术组大鼠脑 EPO 染色， 无阳性 ； B ： EPO 微球组 （100 万活性单位 /kg） ， 明显阳 性 ； 标尺 ： 200m， P0.001(*)。 0049 相似的， 注射 EPO 微球后大鼠脑内神经元上的 EPO-R 表达出现增多现象， 特别是 注射了 100 万活性单位 /kg 的 EPO 微球后， 大鼠脑内神经元上的 EPO-R 大量表达。请参见 图 3， A ： 假手术组大鼠

35、脑 EPO-R 染色， 无阳性 ； B ： EPO 微球组 （100 万活性单位 /kg） 大鼠脑 EPO-R 染色， 明显阳性 ； 标尺 ： 200m， P0.001(*)。 0050 （2） 黑质多巴胺能神经元的检测结果 与正常 SD 大鼠相比， LID 模型组的毁损侧黑质 TH 阳性细胞明显减少， 而给予 EPO 微球 保护的 LID 大鼠可见毁损侧的 TH 阳性细胞较 LID 模型组明显增加， 可见 EPO 微球对黑质多 巴胺能神经元具有保护作用， 其中 EPO 微球剂量为 100 万活性单位 /kg 大鼠。请参见图 4， A ： 假手术组大鼠黑质， 毁损侧 ； B ： 假手术组大鼠黑

36、质， 右侧 ； C ： LID 模型大鼠黑质， 毁损侧 ； D ： LID 模型大鼠黑质， 健侧 ； E ： EPO 微球组大鼠黑质， 毁损侧 ； F ： EPO 微球组大鼠黑质， 健侧 ； 标尺 ： 200m。 0051 （3） 黑质多巴胺能神经元计数结果 对黑质 TH 阳性细胞计数， 与自身未损伤侧相比得出 TH 阳性神经元百分比。统计结果 请参见图 5， 图中显示 LID 组大鼠阳性细胞为 193， 与假手术组比 P0.01（*） ， EPO 微 球组为 866， 与 LID 组比 P0.01 （*） ， 其中 EPO 微球剂量为 100 万活性单位 /kg 大鼠。 0052 检测结果

37、与假手术组相比， LID 组及 EPO 微球组 （100 万活性单位 /kg 大鼠） 的黑质损伤侧的 TH 均明显减少， 但 EPO 微球组的 TH 含量与 LID 组相比较多， P 0.001 （*） ， 检测结果请参见 说 明 书 CN 102871969 A 8 7/9 页 9 图 6， L ： 损伤侧， U ： 未损伤侧， 与假手术组相比， LID 组的 TH 含量明显减少， P 0.001（*） ， 与 LID 组相比， EPO 微球组的 TH 含量增加， P 0.001（*） 。但在纹状体中， EPO 微球组损 伤侧的 TH 明显增加， 提示 EPO 微球对纹状体的多巴胺神经元具有

38、保护作用， 其中 EPO 微球 剂量为100万活性单位/kg大鼠， 检测结果请参见图7， L ： 损伤侧， U ： 未损伤侧， 与假手术组 相比， LID 组的 TH 含量明显减少， P 0.001（*） ， 与 LID 组相比， EPO 微球组的 TH 含量显 著增加， P 0.001（*） 。 0053 实施例 3 基因重组表达促红细胞生成素制备的微球治疗 PD 运动并发症的临床 前试验 基因重组表达促红细胞生成素微球的制备方法见实施例 1， 实验方法同实施例 2， 以基 因重组表达 EPO 代替自然提取的 EPO 制备微球， 皮下或颅内注射到 LID 大鼠， 然后检测相应 指标。基因重组

39、表达 EPO 制备的微球对大鼠模型旋转次数的影响见表 2。 0054 表 2 不同剂量基因重组表达 EPO 微球对大鼠模型旋转次数的影响 从表中可以看出， 基因重组表达EPO制备的微球可以降低LID大鼠的不自主旋转次数， 其中， 高剂量 EPO 微球有十分明显的治疗效果。 0055 对各组大鼠进行脑脊液 EPO 检测、 免疫组化检测和 Western blot 检测， 检测结果 与实施例 2 中的图 1 至图 7 结果基本一致， 在注射基因重组表达 EPO 微球后， 大鼠脑内神经 元上的EPO-R表达出现增多现象， 特别是注射了高剂量基因重组表达EPO微球后， 大鼠脑内 神经元上的 EPO-R

40、 大量表达， 可见基因重组表达 EPO 微球对黑质和纹状体的多巴胺能神经 元具有保护作用。充分说明基因重组表达 EPO 制备的微球具有治疗帕金森病运动并发症的 功效。 0056 实施例 4 聚乙二醇修饰的促红细胞生成素制备的微球治疗 PD 运动并发症的临 床前试验 聚乙二醇修饰的促红细胞生成素微球的制备方法见实施例 1， 实验方法同实施例 2， 以 聚乙二醇修饰的 EPO 代替自然提取的 EPO 制备微球， 皮下或颅内注射到 LID 大鼠， 然后检测 相应指标。聚乙二醇修饰的 EPO 制备的微球对大鼠模型旋转次数的影响见表 3。 0057 表 3 不同剂量聚乙二醇修饰 EPO 微球对大鼠模型旋

41、转次数的影响 说 明 书 CN 102871969 A 9 8/9 页 10 从表中可以看出， 聚乙二醇修饰的 EPO 制备的微球可以降低 LID 大鼠的不自主旋转次 数， 其中， 高剂量 EPO 微球有十分明显的治疗效果。 0058 对各组大鼠进行脑脊液 EPO 检测、 免疫组化检测和 Western blot 检测， 检测结果 与实施例 2 中的图 1 至图 7 结果基本一致， 在注射聚乙二醇修饰的 EPO 微球后， 大鼠脑内神 经元上的EPO-R表达出现增多现象， 特别是注射了高剂量聚乙二醇修饰的EPO微球后， 大鼠 脑内神经元上的 EPO-R 大量表达， 可见聚乙二醇修饰的 EPO 微

42、球对黑质和纹状体的多巴胺 能神经元具有保护作用。充分说明聚乙二醇修饰的 EPO 制备的微球具有治疗帕金森病运动 并发症的功效。 0059 实施例 5 糖基化修饰的促红细胞生成素制备的微球治疗 PD 运动并发症的临床 前试验 糖基化修饰的促红细胞生成素微球的制备方法见实施例 1， 实验方法同实施例 2， 以糖 基化修饰的 EPO 代替自然提取的 EPO 制备微球， 皮下或颅内注射到 LID 大鼠， 然后检测相应 指标。糖基化修饰的 EPO 制备的微球对大鼠模型旋转次数的影响见表 4。 0060 表 4 不同剂量糖基化修饰的 EPO 微球对大鼠模型旋转次数的影响 从表中可以看出， 糖基化修饰的EP

43、O制备的微球可以降低LID大鼠的不自主旋转次数， 其中， 高剂量 EPO 微球有十分明显的治疗效果。 0061 对各组大鼠进行脑脊液 EPO 检测、 免疫组化检测和 Western blot 检测， 检测结果 与实施例 2 中的图 1 至图 7 结果基本一致， 在注射糖基化修饰的 EPO 微球后， 大鼠脑内神经 元上的EPO-R表达出现增多现象， 特别是注射了高剂量糖基化修饰的EPO微球后， 大鼠脑内 神经元上的 EPO-R 大量表达， 可见糖基化修饰的 EPO 微球对黑质和纹状体的多巴胺能神经 元具有保护作用。充分说明糖基化修饰的 EPO 制备的微球具有治疗帕金森病运动并发症的 说 明 书

44、CN 102871969 A 10 9/9 页 11 功效。 0062 实施例 6 人血清融合的促红细胞生成素制备的微球治疗 PD 运动并发症的临床 前试验 人血清融合的促红细胞生成素微球的制备方法见实施例 1， 实验方法同实施例 2， 以人 血清融合的 EPO 代替自然提取的 EPO 制备微球， 皮下或颅内注射到 LID 大鼠， 然后检测相应 指标。人血清融合的 EPO 制备的微球对大鼠模型旋转次数的影响见表 5。 0063 表 5 不同剂量人血清融合的 EPO 微球对大鼠模型旋转次数的影响 从表中可以看出， 人血清融合的EPO制备的微球可以降低LID大鼠的不自主旋转次数， 其中， 高剂量

45、EPO 微球有十分明显的治疗效果。 0064 对各组大鼠进行脑脊液 EPO 检测、 免疫组化检测和 Western blot 检测， 检测结果 与实施例 2 中的图 1 至图 7 结果基本一致， 在注射人血清融合的 EPO 微球后， 大鼠脑内神经 元上的EPO-R表达出现增多现象， 特别是注射了高剂量人血清融合的EPO微球后， 大鼠脑内 神经元上的 EPO-R 大量表达， 可见人血清融合的 EPO 微球对黑质和纹状体的多巴胺能神经 元具有保护作用。充分说明人血清融合的 EPO 制备的微球具有治疗帕金森病运动并发症的 功效。 0065 本发明促红细胞生成素微球在制备治疗帕金森病运动并发症药物中的

46、应用， EPO 微球可以降低 LID 大鼠的不自主旋转次数， 注射 EPO 微球后大鼠脑内神经元上的 EPO-R 表 达出现增多现象， EPO 微球对黑质和纹状体多巴胺能神经元具有保护作用， 可以作为 PD 运 动并发症治疗的有效辅助药物。 0066 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102871969 A 11 1/6 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102871969 A 12 2/6 页 13 图 2 说 明 书 附 图 CN 102871969 A 13 3/6 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 102871969 A 14 4/6 页 15 图 4 说 明 书 附 图 CN 102871969 A 15 5/6 页 16 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102871969 A 16 6/6 页 17 图 7 说 明 书 附 图 CN 102871969 A 17