防治西瓜枯萎病的生防菌株及其应用.pdf

1、10申请公布号CN104087542A43申请公布日20141008CN104087542A21申请号201410340374822申请日20140716CGMCCNO897320140328C12N1/20200601A01N63/00200601A01P3/00200601C12R1/12520060171申请人南京新果园生态农业科技有限公司地址210014江苏省南京市玄武区童卫路4号72发明人张磊晏枫霞韩先旭卢魏魏74专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人王月霞唐循文54发明名称防治西瓜枯萎病的生防菌株及其应用57摘要本发明公开了防治西瓜枯萎病的生防菌株及其应用，其分类

2、命名为枯草芽孢杆菌（BACILLUSSUBTILIS）XGY131，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO8973。将防治西瓜枯萎病的生防菌株单菌落挑至于LB液体培养基，30180RPM摇床振荡培养10H，获得种子液，将种子液以1（V/V）的接种量接种于发酵培养基，于30180RPM摇床振荡培养89D，制备得到生防菌剂，稀释20100倍后在西瓜种植时浸种处理，或者在移栽时进行灌根处理，对西瓜枯萎病的防效在6236。同时，该菌剂还有促生功能。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页

3、说明书4页10申请公布号CN104087542ACN104087542A1/1页21一种防治西瓜枯萎病的生防菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌（BACILLUSSUBTILIS）XGY131，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO8973。2权利要求1所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用。3根据权利要求2所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其特征在于将防治西瓜枯萎病的生防菌株单菌落挑至于LB液体培养基，30180RPM摇床振荡培养10H，获得种子液，将种子液以1（V/V）的接种量接种于发酵培养基，于30180RPM摇床振

4、荡培养89D，制备得到生防菌剂，稀释后浸种或者灌根使用。4根据权利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其特征在于所述的生防菌剂中活菌总浓度为110911010CFU/ML。5根据权利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其特征在于所述的发酵液为黄豆粉10G/L、玉米粉75G/L、磷酸氢二钾05G/L、7水硫酸镁02G/L、酵母膏04G/L、氯化钠5G/L。6根据权利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其特征在于所述LB液体培养基为酵母粉5G/L、胰蛋白胨10G/L、氯化钠10G/L，调PH7072。7根据权利要求3所述

5、的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其特征在于所述稀释倍数为20100倍。权利要求书CN104087542A1/4页3防治西瓜枯萎病的生防菌株及其应用技术领域0001本发明涉及一种防治西瓜枯萎病的生防菌株及其应用，属于植物保护技术领域，专用于西瓜枯萎病的生物防治。背景技术0002西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型FUSARIUMOXYSPORUMSCHLECHLENDAHLFSPMELONSLEACHATCURRENCESNYDERETHANSEN侵染导致的维管束系统病害，是一种世界性土传病害，为西瓜的主要病害之一，自1894年在美国南卡罗来纳州首次发现以来，目前在世界各个西瓜

6、产区、在西瓜生长的任何时间都有发生，严重威胁着西瓜的安全生产。0003西瓜枯萎病自幼苗至成株均可发生，以座瓜期和瓜膨大后期发病最重。幼苗受害，出苗前可造成烂种；出土后发病，子叶、真叶呈失水状萎蔫，茎基部变褐收缩呈猝倒状，拔出瓜苗可见根部黄褐色腐烂。成株期受害，初期病株下部叶片呈失水状萎蔫，似水烫状，茎蔓基部向上褪绿。最初萎蔫在中午尤为明显，但早晚可恢复，36D后整株叶片枯萎下垂，不能复原，后期病部呈棕褐色，发软，常纵裂，有胶状物溢出，俗称吐“红水”。在潮湿条件下病株基部布满白色至粉红色霉状物，即病原的分生孢子，剖视茎基部至根部，可见维管束变黄褐色。病根根系变暗褐色并腐烂，极易拔起，严重时瓜秧枯

7、死，但叶片不脱落。0004温度高、湿度大是发生病害的原因之一。病菌在2432和高湿条件下侵染力强，0005发病快，连阴2D以上、降雨量大及土壤粘重、地势低洼、排水不良、管理粗放的连作地块均有此病发生。肥料配比不合理是引起发病的另一个主要原因。底肥不足，氮肥过量，磷、钾肥不足，使用未腐熟好的带病菌的有机肥，地下害虫危害严重等都可以导致西瓜枯萎病的发生。西瓜枯萎病发生轻重与轮作年限直接相关，轮作年限越短，发病越重；轮作年限越长，发病越轻。连作地死株率高，往往造成改种或毁种。0006镰刀菌以菌丝和厚垣孢子在土壤或未腐熟的带菌肥料中越冬，一般分布在025土层内，成为翌年发病的初侵染源，种子也可带菌。该

8、菌侵染寄主植物根系的温度为535，最适温度为2328。病菌侵染通过胚根侵染发芽的种子，通过植株根部自然伤口或从根毛顶端细胞间侵入，或通过线虫等侵染伤口及其它机械损伤传入，最终进入维管束。菌丝体和分生孢子在植株体内分布广泛，且以下胚轴和子叶节中的数量最多，导管周围的薄壁细胞中有时也有菌丝存在，但无分生孢子。该菌可使皮层腐烂，子叶和嫩叶褪绿，在胚轴上出现水浸状软腐环带，使成株叶片萎蔫，任何生育阶段都可发生枯萎病，西瓜开花期和结果期最为明显。0007在无寄主情况下，病菌仍可在土中存活6年以上，有时甚至超过10年，更有甚者菌核和厚垣孢子通过家畜消化系统后仍具有生活能力。而在水田中12年后基本上失去活性

9、。土壤含水量为70的壤土最适于病原菌生存；含水量为40时，土壤质地对病菌存活率无明显影响。在病害严重的地块，许多作物如香附子、畔茅、再生稻、花生及番茄等都成为病原菌的寄生场所；自然重病田连续3年种植非寄主植物如大葱、大蒜、辣椒、茄子、玉米及大豆等均能减少病原菌数量。说明书CN104087542A2/4页40008目前对西瓜枯萎病的防治主要采用南瓜砧木嫁接的方法，这种方法严重影响到西瓜的口感，降低西瓜品质。针对西瓜枯萎病分布广、危害严重、难以防治以及化学农药的种种弊病和研制化学农药历时长、花费大的现实，迫切需要开发并商业化生产用于防治西瓜枯萎病的生物农药。发明内容0009针对现有技术中没有对西瓜

10、枯萎病有较高防效的生防制剂的现状，提供开发一种防治西瓜枯萎病的单一生防菌菌株及其应用，该菌剂对这种重要土传病害的防效可以达到60以上。0010为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为0011一种防治西瓜枯萎病的生防菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILISXGY131，已于2014年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCCNO8973。0012所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用。0013将防治西瓜枯萎病的生防菌株单菌落挑至于LB液体培养基，30180RPM

11、摇床振荡培养10H，获得种子液，将种子液以1V/V的接种量接种于发酵培养基，于30180RPM摇床振荡培养89D，制备得到生防菌剂，稀释20100倍后浸种或者灌根使用。在西瓜种植前浸种使用至少半小时，或者在移栽时以每亩9升进行灌根处理。0014所述的生防菌剂中活菌总浓度为110911010CFU/ML。0015所述LB液体培养基为酵母粉5G/L、胰蛋白胨10G/L、氯化钠10G/L，调PH7072。0016所述的发酵液为黄豆粉10G/L、玉米粉75G/L、磷酸氢二钾05G/L、7水硫酸镁02G/L、酵母膏04G/L、氯化钠5G/L。0017有益效果0018本发明是专门针对西瓜枯萎病开发的生防制

12、剂。本发明有利于西瓜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，节省农民开支。本发明可省掉砧木的使用，改善西瓜风味，提高西瓜品质，促进农民增收。同时，该菌剂还有促生功能表2。0019温室实验表明该菌制剂能显著降低西瓜枯萎病的发生。该菌剂可以稀释100倍后在西瓜种植时浸种处理幼苗，或者在移栽时灌根处理。在温室条件下对于西瓜枯萎病的防效可以达到6236表1。具体实施方式0020实施例1防治西瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法0021防治西瓜枯萎病的生防菌株，枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILISXGY131，为2013年在江苏南京病田土壤中分离得到，筛选过程如下0022于2013年5月，在

13、江苏省南京市溧水区西瓜枯萎病发病严重的地块采集样品。采用五点采样法，每点间隔至少10M。每点收集三株健康植株的根围土，带回实验室进行分离。0023称取根围土3G,分别加入到27ML灭菌水中含灭菌玻璃珠，180RMP摇床振荡说明书CN104087542A3/4页505H，静置5MIN，得到101稀释液，吸取上清液01ML依次稀释，分别取104106三个梯度01ML涂LB平板，28培养48H,选取菌落数在50300之间的平板，计数并且挑取所有菌落，纯化，70，40甘油保存备用。0024用LB平板活化分离纯化的菌株，牙签挑取处于生长盛期的菌落点于含西瓜枯萎病原菌的YGPA平板上，每板5点，间距相等，

14、30培养48H，观察并且记录结果，分别量取颉颃菌内径以及颉颃圈外径。根据内外径之差划分为三个等级13MM，36MM，6MM以上。培养基LB酵母粉5G/L、胰蛋白胨10G/L、氯化钠10G/L，调PH7072。0025按照平板拮抗活性、蛋白酶活性、几丁质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性以及产嗜铁素活性，采用赋值法，选择出综合得分最高较高菌株，通过温室试验最终筛选出防治效果最好的XGY131。0026实施例2菌株鉴定0027防治西瓜枯萎病的生防菌株，枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILISXGY131为革兰氏阳性杆菌，单个细胞070823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢0609

15、1015微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在LB液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。0028实施例3XGY131生防菌剂的制备0029LB液体培养基为酵母粉5G/L、胰蛋白胨10G/L、氯化钠10G/L，调PH7072。0030发酵液为黄豆粉10G/L、玉米粉75G/L、磷酸氢二钾05G/L、7水硫酸镁02G/L、酵母膏04G/L、氯化钠5G/L。0031将分离出的XGY131单菌落挑至于LB液体培养基，30180RPM摇床振荡培养10H，获得种子液。将种子液以1的接种量接种于上述

16、发酵培养基，于30180RPM摇床振荡培养89D，菌剂成品中活菌总浓度为110911010CFU/ML。0032实施例4温室盆钵试验检测XGY131生防菌剂对西瓜枯萎病的防效0033移栽之前，用实施例3制备的生防菌剂XGY131稀释至107CFU/ML浸种处理幼苗30MIN；移栽时采用20ML107CFU/ML菌剂灌根处理，移栽一周后接种107CFU/ML西瓜枯萎病菌FUSARIUMOXYSPORUMSCHLECHLENDAHLFSPMELONSLEACHATCURRENCESNYDERETHANSEN，孢子悬液20ML。另外不用生防菌XGY131处理，直接接种西瓜枯萎病菌孢子悬液作为对照处理

17、。每个处理组24株，三次重复。在温度2528，相对湿度40，光照12H/12H条件下，培养4周后调查病级数，计算病害严重度和防效，结果见表1。0034按照KEMPE和SEQUERIA1983年提出的病害分级标准，病害严重度和防效的计算公式如下0035DI0，无发病；0036DI1，25的叶片萎蔫；0037DI2，2550的叶片萎蔫；0038DI3，5075的叶片萎蔫；0039DI4，75100的叶片萎蔫KEMPEANDSEQUERIA,1983。0040说明书CN104087542A4/4页60041在移栽4周后的调查结果显示，生防菌剂XGY131对西瓜枯萎病的防效达到6236。0042表1温室中生防菌剂XGY131对西瓜枯萎病的生防效果00430044实施例5XGY131生防菌剂对西瓜的田间促生效果0045移栽之前，用实施例3制备的生防菌剂XGY131稀释至107CFU/ML浸种处理幼苗30MIN；移栽时和移栽后15天采用200ML107CFU/ML菌剂灌根处理，对照浇灌清水。花期和座果期调查植株株高、茎粗。每处理五点取样，每点调查6株，结果见表2。0046表2西瓜园艺性状比较00470048西瓜花期和座果期的调查结果表明，XGY131处理对西瓜的生长具有显著的促进作用。说明书CN104087542A