胶体金标记HLY基因单克隆抗体测定单核细胞增生性李斯特菌试剂盒.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102539770 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102539770 A *CN102539770A* (21)申请号 201110449180.8 (22)申请日 2011.12.29 G01N 33/577(2006.01) G01N 33/531(2006.01) (71)申请人 何鑫 地址 130033 吉林省长春市仙台大街 126 号 中日联谊医院检验科 申请人 贾芙蓉 黄胜起 赵丽纯 何成彦 (72)发明人 何鑫 贾芙蓉 黄胜起 赵丽纯 何成彦 (74)专利代理机构 长春众益专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 22211 代理人 纪尚

2、(54) 发明名称 胶体金标记 Hly 基因单克隆抗体测定单核细 胞增生性李斯特菌试剂盒 (57) 摘要 一种胶体金标记 Hly 基因单克隆抗体测定单 增李斯特菌试剂盒， 属于卫生学检验及医学检验 技术领域， 其特征是 ： 1 引物设计、 2PCR 扩增、 3 琼 脂糖凝胶电泳的反应条件、 4 切下目的 DNA 片段、 5 应用热休克转化法、 6SDS 裂解法纯化试剂盒制 备质粒、 7 蛋白的诱导表达、 8SDS-PAGE 电泳、 9 从 SDS-PAGE 电泳凝胶中切下所需条带、 10 胶体金的 制备。有益效果是 ： 改进了过去针对单一菌属单 一抗原测定的局限性。抗体纯、 效价高， 提高了

3、敏感度和准确度。对单增李斯特菌进行检测， 同 ELISA法和PCR法比较， 免疫胶体金层析对李斯特 菌的检测具有快速、 便捷的优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 13 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 13 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/3 页 2 1. 一种胶体金标记 Hly 基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒， 其特征是 ： a、 引物设计 L.monocytogenes Hly 蛋白基因序列 根据GenBank中的L.monocytogenes Hly蛋白基因序列，

4、应用Primer Premier5.0， DNA Club 和 Oligo 6.0 设计特异性引物 P1 和 P2， 预期扩增长度为 1434bp ； 在 NCBI GENEBANK 中找到基因序列后， 看选择的酶切位点， 在所要进行 PCR 的基因序列中是否存在 ； 用 Primer primer5 把序列反向互补 ； 在应用 Oligo 6.0 引物设计时， 上下游引物全长输入 ； 上游引物 位点的确定为 5 端模板第一个碱基前面的所有碱基的负数值 +1 下游引物位点的确定为下 游引物 - 酶切位点 - 保护性碱基 A， 序列全长 -A+1 下游引物位点 ； 上游引物 5 一 AAGAgg

5、atccAGAGTGAAACCCATG 一 3 ； 下游引物 5 一 GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT 一 3 ； 为下一步克隆需要， 分别在上、 下游引物中引入 BamH 和 Xho 酶切位点 权 利 要 求 书 CN 102539770 A 2 2/3 页 3 b、 PCR 扩增 PCR 反应条件为 95预变性 5min， 94变性 1min， 53退火 1min， 72延伸 2min， 扩增 32 个循环 ； 预期片段大小 1 600bp ； c、 琼脂糖凝胶电泳的反应条件 用 1.0琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物， 电压 100V， 电泳 30min ； d、

6、切下目的 DNA 片段， 用凝胶快速纯化回收试剂盒回收 ； 将回收纯化的 PCR 产物与 pMD18-T 进行连接， 并 pMD18-T 载体 16 12 小时以上连接 ； 制备感受态细胞， 应用 CaCl2致 敏法制备大肠杆菌感受态， 接种 JM109 菌种， 37， 225rpm12 小时振摇培养后， 菌液在 LB 固 体培养基上划线， 37孵箱过夜培养， 筛选单克隆 ； 选一单菌落接种于 5mLLB 培养基中， 12 小时以上培养， 培养物按 1/100 接种于 LB 培养基中， 培养至 A600达 0.45-0.55， 用 CaCl2致 敏大肠杆菌 ； e、 应用热休克转化法， 将连接

7、反应液加入 100L 感受状态的细胞中， 再加 3l DMSO 以增加转化效率， 冰浴 30min 后， 42休克 45s， 然后迅速冰浴 5min， 再将转化产物加入 LB 液体培养基中复苏 30min 后， 离心收集菌体， 将其铺于含筛选抗生素的 LB 固体培养基上， 37恒温孵箱放置 16h 后观察转化效果 ； f、 SDS 裂解法纯化试剂盒制备质粒 ； 用 BamH 和 Xho 进行酶切鉴定及 PCR 鉴定， 筛选出阳性重组质粒， 命名为 pGEX-6P-1-Hly ； 用 BamH 和 Xho 进行亚克隆， 表达载体 pGEX-6P-1 和重组克隆载体 pGEX-6P-1-Hly 用

8、 BamH 和 Xho 切处理， 琼脂糖凝胶电泳， 线性表达载体用 DNA 快速纯化回收试剂盒回收， 亚克隆片段用挤胶法回收， 亚克隆载体与 片段用 T4DNA 连接酶连接， 连接产物转化 JM109 感受态， 提取质粒， 鉴定阳性克隆 ； g、 蛋白的诱导表达 用 pGEX-6P-1 重组质粒转化 BL21 受体菌， 选择单克隆接种到 5mL LB 培养液里， 按传统 方式诱导表达， 即 37， 225rpm 振荡培养至 A600 达 0.6-0.8， 加 IPTG 至 1mmol/L， 对照组不 加 IPTG， 3h 后收集细菌 ； 同时接种诱导菌种， 提取质粒， BamH 和 Xho 酶

9、切验证确含目 的片段后， 进行测序， 测序正确后进行重组蛋白的后续实验 ； h、 SDS-PAGE 电泳 将诱导后菌液30mL 11000rpm离心2min， 弃上清， 收集菌体， 向菌体沉淀中加入2SDS 凝胶加样缓冲液 1000l， 煮沸 5min 后进行 SDS-PAGE 电泳 ； i、 从 SDS-PAGE 电泳凝胶中切下所需条带， 大约用两天时间将其冻干， 并碾成粉末 ； 用 考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定， 制作蛋白标准曲线 ； 595nm 处比色 ； 将抗原溶于生理盐水 中， 配制浓度为 1g/l ； 免疫 BALB/c 小鼠 ； 4-6 周， 加强免疫 ； 小鼠腹水的诱导 取 1

10、0 周龄的健康 BALB/c 小鼠， 腹腔注射灭菌液体石蜡， 每只 0.5ml， 7-10 天后， 收集杂 交瘤细胞， 离心， 去上清， 加入不含血清的培养基， 调节细胞密度为 3107个 /ml， 每只小鼠 注射 1ml ； 设阴性对照、 盐水对照 ； 10 天后， 小鼠腹部增大， 开始收集腹水 ； 用 12 号针头扎入 腹部， 挤压， 使腹水流出， 收集至离心管， 并使劲晃动离心管防止腹水凝结 ； 1000 转离心 5 分 钟， 吸取上清， 注意去掉上面一层脂肪 ； 分装， -20冻存 ； j、 胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法并稍作改进制备胶体金 ； 胶体金制备， 取 1 氯金酸溶液2.

11、5ml加入到250ml容量瓶中， 加双蒸水至标定刻度线， 使氯金酸溶液的浓度为 权 利 要 求 书 CN 102539770 A 3 3/3 页 4 1， 沸水浴 10min， 加入 1柠檬酸三钠溶液 6.65ml ； 快速搅拌直至颜色彻底变为紫红色， 继续沸水 10min， 取出 ； 凉至室温后， 用双蒸水恢复至原体积 ； 置 4冰箱保存备用 ； 测定胶体金在 515nm 波长具有最大吸收峰， 确定胶体金直径大小为 10nm ； 胶体金探针制备， 取新鲜制备的胶体金溶液 50ml， 加入 0.2mol/L K2CO3， 调 pH 至 8.2， 置磁力搅拌器上调适量转速， 然后加入适量的已纯化

12、好的抗体 ； 使抗体浓度恰好在稳定蛋白质的最小量上 ； 缓慢搅拌 10min， 加入牛血清白蛋白 BSA， 使 BSA 的终浓度为 1， 继续搅拌 10min。将上述胶体金一抗体一 BSA 液进行 4000r/min 离 心20min， 收集上清 ； 将收集的上清进行4、 10000r/min离心60min ； 弃上清， 沉淀用含1 BSA 的 0.01mol/L。pH7.4PBS 悬浮 ； 同上 4， 10000r/min 离心 60min 两次， 最后将沉淀用 5ml PBS-T 溶解 ； 4冰箱保存备用 ； 层析试纸条组装试纸条由吸水纤维、 硝酸纤维膜、 玻璃纤维和 PVC 板组成 ；

13、硝酸纤维膜 处理， 中段相隔5mm分别用羊抗鼠IgG对照线和单核李斯特菌抗体检测线划线， 形成两条宽 约 1mm 的线段， 干燥后用含 1 BSA 的 PBS 封闭过夜， 37干燥 ； 试纸条组装， 取洁净 PVC 板， 将处理好的硝酸纤维膜粘在 PVC 板中部合适位置 ； 将 2cm 吸水纤维粘在PVC板上端并部分压在硝酸纤维膜上， 0.8cm玻璃纤维粘在PVC板下端并部分 压在硝酸纤维膜上， 切成宽 5mm 的条带， 即为层析试纸条 ； 干燥剂密封冷冻保存。 权 利 要 求 书 CN 102539770 A 4 1/13 页 5 胶体金标记 Hly 基因单克隆抗体测定单核细胞增生性李斯 特

14、菌试剂盒 技术领域 0001 本发明属于卫生学检验及医学检验技术领域。 背景技术 0002 李斯特菌属 L isteria 分为 2 个群， 7 个种。第 1 群包括单核细胞增生性李斯 特菌 L.monocytogenes( 简称单增李斯特菌 )、 伊氏李斯特菌 L.ivanovii、 无害李斯特菌 L.innocua、 韦氏李斯特菌 L.welshm ei 及塞氏李斯特菌 L.seeligeri ； 第 2 群为较少见的 格氏李斯特菌L.grayi和莫氏李斯特菌L.m urrayi.其中单增李斯特菌被认为是引起动物 和人类李斯特菌病的主要致病菌 . 单增李斯特菌 (Usteria monoc

15、ytogenes， Lm) 是一种短 小的革兰阳性无芽胞杆菌， 是一种人畜共患病的致病菌， 可使人和动物患李斯特菌病。 研究 发现单增李斯特菌包括致病性、 弱致病性和非致病性 3 种类型 . 单增李斯特菌能使人畜致 病， 造成猪、 鸡等多种畜禽死亡。 人感染后则主要表现为脑膜炎、 败血症和单核细胞增多。 婴 幼儿、 怀孕妇女和免疫耐受病人的感染死亡率可高达 20 30。单增李斯特菌广泛存在 于自然界中， 人们食用的肉、 奶、 蛋、 水产品、 蔬菜以及冷冻食品等均有不同程度的污染， 世 界卫生组织 (WHO) 在关于单增李斯特菌食物中毒的报告中指出 ： 4 8的水产品、 5 10的奶及奶制品、

16、15以上的家禽、 30以上的肉制品及冷冻制品， 均被该菌污染 . 食品 中存在的单增李斯特菌对人类的食品安全存在较大威胁， 是冷冻食品中威胁人类健康的主 要病原菌之一。在美国李斯特菌被列为 7 种主要的食源性致死病菌之一， 已经被 WHO 食品 安全工作计划列为重点检测的食源性病菌之一。 0003 单增李斯特菌是典型的胞内寄生菌， 可在巨噬细胞和许多非吞噬细胞 ( 如内皮 细胞、 上皮细胞和肝细胞 ) 内增殖。单增李斯特菌的致病性涉及多个毒力因子， 如溶血素 (Listeriolysin O， 简称 LLO)、 内化素、 p60 蛋白等。LLO 是该菌侵染力的重要组成成分， 是 LM 的主要毒

17、力因子。LLO 是一种能结合胆固醇、 可被巯基活化的细胞溶解素， 由 hly 基因编 码的 529 个氨基酸组成， 其中有 25 个氨基酸构成的信号肽序列。LLO 能溶解宿主细胞吞噬 泡膜， 逃离噬菌体， 进入胞浆， 逃避吞噬体中杀菌物质的杀灭 ； 此外还能在感染细胞内诱导 信号传导和定向免疫应答中发挥重要作用。由于 LLO 所具有的独特生物学特性， 已被用于 构建各种减毒疫苗或核酸疫苗， 且促进 MHC-I 类分子限制性免疫应答， 增强了保护性抗原 的免疫作用。 0004 单增李斯特菌为需氧或兼性厌氧菌， 生长温度为 1 45， 对不利环境具有比较 强的耐受能力， 在 4冰箱中也可生长繁殖，

18、 在 pH5.0 9.0 的环境中， 1 年后仍可检出。这 使其危害性更进一步增大。 另外， 单增李斯特菌病原体是定居在细胞内的， 因此应用抗生素 治疗李斯特菌病的效果不太理想。 由李斯特菌引起的疾病及其食源性感染日益引起世界各 国的重视， 对该病原进行快速、 灵敏、 准确的检测是有效防治本病和保证食品卫生安全的重 要手段。 0005 本研究旨在克隆和表达单增李斯特菌的 hly 基因， 研制基于溶血素的诊断用单克 说 明 书 CN 102539770 A 5 2/13 页 6 隆抗体， 以对单增李斯特菌进行检验分析及制备基因工程疫苗奠定基础。国内的赵松波等 人已经原核表达出溶血素 (LLO)，

19、 也建立了 LLO 的间接 ELISA 检测方法， 但是该方法在检测 动物血清时容易出现假阴性。 赵松波提出利用LLO单抗建立夹心ELISA可提高检测灵敏度， 但相关工作未见报道。 董慧和罗正等人已经制备了LLO单抗， 但均未用于实际样品检测。 早 在 1991 年就有国外的学者用 LM 培养上清中纯化的蛋白免疫小鼠制备单抗， 获得 3 株能抑 制LLO溶血的单抗、 1株能抑制LLO与红细胞膜结合的单抗以及2株能抑制与其他细胞膜结 合的单抗。 1999年Erdenlig等人同样得到了具有抑制LLO溶血作用的单克隆抗体， 并用于 鉴定所分离的李斯特菌是否为致病菌株。 0006 经典的李斯特菌分离

20、培养和鉴定技术需要 1-2 周时间， 人力、 物力花费大， 不适应 实际检验工作的需要。 目前， 对产单核李斯特菌快速检测方法的研究， 绝大部分尚停留在实 验室的研究阶段， 很大程度局限于ELISA法和PCR法， 而免疫胶体金层析为李斯特菌的检测 具有快速、 便捷的优点， 可广泛应用于医院、 商检、 卫生、 安检， 也可用于家庭进行简易的检 测。 其良好的特异性， 较高的灵敏度， 可靠的重现性和稳定性， 为产单核李斯特菌检测提供 了一个更为理想的检测方法和思路。罗利新等所用抗体为产单核李斯特菌抗体 (O 链抗原 / )， 实验只针对单一血清型李斯特菌进行了研究， 而产单核李斯特菌根据菌体 (O

21、) 抗 原和鞭毛 (H) 抗原分成 13 个血清型， 所以实验针对李斯特全菌属不够完备。 0007 综合以上的国内外研究资料可发现， 单增李斯特菌的检测方法仍不够完备， 现有 的检测技术方法仍存在如下两个方面的不足 ： 0008 1 标本仍需 48h 的增菌培养。 0009 2 本方法仍只可对单增李斯特菌感染的标本进行阴性筛查， 阳性标本的确定试验 仍为细菌培养及生化反应的鉴定。 发明内容 0010 本发明的目的是 ： 提供一种胶体金标记 Hly 基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试 剂盒， 它将标记 Hly 基因单克隆抗体的免疫胶体金层析法用于快速检测单增李斯特菌， 使 用方便、 操作简单、 结

22、果可靠。 0011 本发明的技术方案是 ： 0012 1 引物设计 ： 0013 L.monocytogenes Hly 蛋白基因序列 ： 0014 说 明 书 CN 102539770 A 6 3/13 页 7 0015 根 据 GenBank 中 的 L.monocytogenes Hly 蛋 白 基 因 序 列，应 用 Primer Premier5.0， DNA Club 和 Oligo 6.0 设计特异性引物 P1 和 P2， 预期扩增长度为 1434bp。在 NCBI GENEBANK 中找到基因 序列后， 看选择的酶切位点， 在所要进行 PCR 的基因序列中是 否存在 ； 用 P

23、rimer primer5 把序列反向互补 ； 在应用 Oligo 6.0 引物设计时， 上下游引物 全长输入 ； 上游引物位点的确定为 5 端模板第一个碱基前面的所有碱基 ( 包括酶切位点 + 保护碱基 ) 的负数值 +1 下游引物位点的确定为下游引物 - 酶切位点 - 保护性碱基 A， 序 列全长 -A+1 下游引物位点。 0016 上游引物 ： 0017 5 一 AAGAggatccAGAGTGAAACCCATG 一 3 ； 0018 下游引物 ： 0019 5 一 GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT 一 3 。 0020 为下一步克隆需要， 分别在上、 下游引物中引

24、入 BamH 和 Xho 酶切位点 0021 2PCR 扩增 ： 0022 参照 TaKaRa 公司的 TaqTM PCR 试剂盒。PCR 反应条件为 95预变性 5min， 94变 性 1min， 53退火 1min， 72延伸 2min， 扩增 32 个循环。预期片段大小 1 600bp 左右。 说 明 书 CN 102539770 A 7 4/13 页 8 0023 3 琼脂糖凝胶电泳的反应条件 ： 0024 用 1.0琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物， 电压 100V， 电泳 30min。 0025 4切下目的DNA片段， 用凝胶快速纯化回收试剂盒回收。 将回收纯化的PCR产物与 pM

25、D18-T进行连接， 并pMD18-T载体1612小时以上连接。 制备感受态细胞 ： 应用CaCl2致 敏法制备大肠杆菌感受态， 接种 JM109 菌种， 37， 225rpm12 小时振摇培养后， 菌液在 LB 固 体培养基上划线， 37孵箱过夜培养， 筛选单克隆。选一单菌落接种于 5mLLB 培养基中， 12 小时以上培养， 培养物按 1/100 接种于 LB 培养基中， 培养至 A600达 0.45-0.55， 用 CaCl2致 敏大肠杆菌。具体如下 ： 将菌液冰浴 10min 后， 4， 4000rpm 离心 20min， 收集菌体， 再加入 冰冷的 0.1M CaCl2致敏液， 悬浮

26、菌体， 冰浴 10min， 重新收集菌体后， 加冰冷的 0.1M CaCl2， 重悬菌体， 加甘油至终浓度为 15， 100L/ 管分装， -70保存， 用于转化。 0026 5 应用热休克转化法， 将连接反应液加入 100L 感受状态的细胞中， 再加 3l DMSO 以增加转化效率， 冰浴 30min 后， 42休克 45s， 然后迅速冰浴 5min， 再将转化产物加 入 LB 液体培养基中复苏 30min 后， 离心收集菌体， 将其铺于含筛选抗生素的 LB 固体培养基 上， 37恒温孵箱放置 16h 后观察转化效果。 0027 6SDS 裂解法纯化试剂盒制备质粒。用 BamH 和 Xho

27、进行酶切鉴定及 PCR 鉴 定， 筛选出阳性重组质粒， 命名为pGEX-6P-1-Hly。 用BamH 和Xho 进行亚克隆， 表达载 体 pGEX-6P-1 和重组克隆载体 pGEX-6P-1-Hly 用 BamH 和 Xho 切处理， 琼脂糖凝胶电 泳， 线性表达载体用 DNA 快速纯化回收试剂盒回收， 亚克隆片段用挤胶法回收， 亚克隆载体 与片段用 T4 DNA 连接酶连接， 连接产物转化 JM109 感受态， 提取质粒， 鉴定阳性克隆。 0028 7 蛋白的诱导表达 0029 用 pGEX-6P-1 重组质粒转化 BL21 受体菌， 选择单克隆接种到 5mL LB 培养液里， 按 传统

28、方式诱导表达， 即 37， 225rpm 振荡培养至 A600 达 0.6-0.8， 加 IPTG 至 1mmol/L， 对照 组不加 IPTG， 3h 后收集细菌。同时接种诱导菌种， 提取质粒， BamH 和 Xho 酶切验证确 含目的片段后， 进行测序， 测序正确后进行重组蛋白的后续实验。 0030 8SDS-PAGE 电泳 0031 将诱导后菌液 30mL 11000rpm 离心 2min， 弃上清， 收集菌体， 向菌体沉淀中加入 2SDS 凝胶加样缓冲液 1000l， 煮沸 5min 后进行 SDS-PAGE 电泳， 操作过程如下 ： 0032 12的分离胶15mL ： 水4.9mL、

29、 30丙烯酰胺6.0mL、 1.5mol/L Tris-HCl其pH 8.8 的 3.8mL、 10 SDS 150mL、 10过硫酸铵 150mL、 TEMED 6mL， 迅速灌注于两层玻璃板的间 隙， 在胶上小心覆盖一层蒸馏水， 凝胶垂直置于室温， 聚合完全后， 倒出覆盖的水， 用滤纸将 水吸净。制备 8mL 积层胶 ： 水 5.5mL、 30丙烯酰胺 1.3mL、 1.0mol/L Tris-HCl 其 pH 6.8 的 1.0mL、 10 SDS 80mL、 10过硫酸铵 80mL、 TEMED 8mL， 直接注于分离胶上层， 立即在积 层胶中插入干净的 Teflon 梳子， 小心避免

30、形成气泡。积层胶聚合完全后， 小心移出 Teflon 梳子， 将凝胶固定于电泳装置上， 加入 Tris- 甘氨酸电泳缓冲液 25mmol/L Tris， 250mmol/ L 甘氨酸， 0.1 SDS， 上电泳样品及蛋白质 Marker， 电压 200v 电泳 45min， 电泳结束后凝胶 加入考马斯亮蓝染色， 脱色液脱色后， 将凝胶浸泡于水中， 拍照记录。 0033 9 从 SDS-PAGE 电泳凝胶中切下所需条带， 大约用两天时间将其冻干， 并碾成粉末。 用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定， 制作蛋白标准曲线。 595nm处比色。 将抗原溶于生理盐 水中， 配制浓度为 1g/l。免疫 BALB

31、/c 小鼠。4-6 周， 加强免疫。 说 明 书 CN 102539770 A 8 5/13 页 9 0034 小鼠腹水的诱导 ： 0035 取 10 周龄的健康 BALB/c 小鼠， 腹腔注射灭菌液体石蜡， 每只 0.5ml， 7-10 天后， 收 集杂交瘤细胞， 离心， 去上清， 加入不含血清的培养基， 调节细胞密度为 3107个 /ml， 每只 小鼠注射 1ml。设阴性对照、 盐水对照。约 10 天后， 小鼠腹部增大， 开始收集腹水。用 12 号 针头扎入腹部， 挤压， 使腹水流出， 收集至离心管， 并使劲晃动离心管防止腹水凝结。 1000转 离心 5 分钟， 吸取上清， 注意去掉上面一

32、层脂肪。分装， -20冻存。 0036 10 胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法并稍作改进制备胶体金。胶体金制备 ： 取 1氯金酸溶液 2.5ml 加入到 250ml 容量瓶中， 加双蒸水至标定刻度线， 使氯金酸溶液的浓 度为 1， 沸水浴 10min， 加入 1柠檬酸三钠溶液 6.65ml。快速搅拌直至颜色彻底变为紫 红色， 继续沸水 10min， 取出。凉至室温后， 用双蒸水恢复至原体积。置 4冰箱保存备用。 0037 测定胶体金在 515nm 波长具有最大吸收峰， 确定胶体金直径大小为 10nm。 0038 胶体金探针制备 ： 取新鲜制备的胶体金溶液 50ml， 加入 0.2mol/L K

33、2CO3， 调 pH 至 8.2， 置磁力搅拌器上调适量转速， 然后加入适量的已纯化好的抗体。 0039 使抗体浓度恰好在稳定蛋白质的最小量上。缓慢搅拌 10min， 加入牛血清白蛋白 BSA， 使 BSA 的终浓度为 1， 继续搅拌 10min。将上述胶体金一抗体一 BSA 液进行 4000r/ min 离心 20min， 收集上清。将收集的上清进行 4、 10000r/min 离心 60min。弃上清， 沉淀 用含 1 BSA 的 0.01mol/L。pH7.4PBS 悬浮。同上 4， 10000r/min 离心 60min 两次， 最后 将沉淀用 5ml PBS-T 溶解。并加入少量的

34、Na3N， 4冰箱保存备用。 0040 层析试纸条组装试纸条由吸水纤维、 硝酸纤维膜、 玻璃纤维和 PVC 板组成。 0041 硝酸纤维膜处理 ： 中段相隔 5mm 分别用羊抗鼠 IgG 对照线和单核李斯特菌抗体检 测线划线， 形成两条宽约 1mm 的线段， 干燥后用含 1 BSA 的 PBS 封闭过夜， 37干燥。 0042 试纸条组装 ： 取洁净 PVC 板， 将处理好的硝酸纤维膜粘在 PVC 板中部合适位置 ； 将 2cm 吸水纤维粘在 PVC 板上端并部分压在硝酸纤维膜上， 0.8cm 玻璃纤维粘在 PVC 板下端并 部分压在硝酸纤维膜上， 切成宽 5mm 的条带， 即为层析试纸条 ；

35、 干燥剂密封冷冻保存。 0043 本发明的有益效果是 ： 1 根据 GeneBank 中已发表的 L.monocytogenes Hly 蛋白基 因序列， 应用 Primer Premier5.0， DNA Club 和 Oligo 6.0 自行设计出引物。 0044 2 LLO 是该菌侵染力的重要组成成分， 是 LM 的主要毒力因子， 由 Hly 基因编码， 对 单核细胞增多性李氏杆菌 Hly 基因进行克隆和原核表达， 改进了过去针对单一菌属单一抗 原测定的局限性。 3表达产物可溶性重组蛋白免疫动物BALB/c小鼠， 制备杂交瘤细胞株， 制 备腹水抗体。 抗体纯、 效价高， 同过去的方法比较

36、， 提高了敏感度和准确度。 4胶体金标记单 增李斯特菌抗体制备免疫层析检测试剂板， 对单增李斯特菌进行检测， 同ELISA法和PCR法 比较， 免疫胶体金层析对李斯特菌的检测具有快速、 便捷的优点。 附图说明 0045 图 1Hly 基因 PCR 产物电泳图 0046 M ： DNA markerDL2000 0047 图 2pGEX-6P-1-Hly 重组蛋白 SDS-PAGE 电泳 0048 M ： 蛋白质相对分子质量标准 ； 0049 1 ： pGEX-6P-1-Hly 重组质粒在 BL21(DE3)pLysS 中经 IPTG 诱导 6h 说 明 书 CN 102539770 A 9 6

37、/13 页 10 0050 图 3 重组蛋白的 Westernblotting 免疫蛋白印迹分析 0051 M ： 蛋白质相对分子质量标准 ； 0052 1 ： 重组蛋白的Westernblotting免疫蛋白印迹分析表达的相对分子量大约72ku。 0053 图 4 胶体金方法检测单增李斯特菌阴、 阳性结果照片。 0054 1 胶体金方法检测单增李斯特菌阴性结果 0055 2 胶体金方法检测单增李斯特菌阳性结果 0056 C ： 阳性对照线 T ： 检测线 具体实施方式 0057 实施例 1 ： 0058 工艺条件 ： 0059 第一步骤对单核细胞增多性李氏杆菌基因进行克隆和原核表达。 006

38、0 主要器材 ： 0061 药品与试剂 ： 菌种及质粒单增李斯特菌菌种 (C54002 株 )、 pMD18-T、 pGEX-6P 载体 质粒为 TAKARA 公司产品。感受态细胞大肠杆菌 JM109、 BL21 受体菌为 Promega 公司产品。 酶及相关试剂 Ex Taq 聚合酶， 限制性内切酶 BamH 、 Xho 及 IPTG 为大连宝生物工程有 限公司产品。T4 DNA ligase 为 Promega 公司产品。DNA 快速纯化回收试剂盒、 凝胶快速纯 化回收试剂盒为大连宝生物工程有限公司产品。 0062 实验方法 ： 0063 一 . 基因组 DNA 的制备 0064 按常规方

39、法培养单核细胞增多性李氏杆菌， DNA 快速纯化回收试剂盒 0065 二 . 含 L.monocytogenes Hly 蛋白基因克隆载体的构建 0066 2.1 引物设计 ： 0067 根据 GenBank 中已发表的 L.monocytogenes Hly 蛋白基因序列， 应用 Primer Premier5.0， DNAClub 和 Oligo 6.0 设计特异性引物 P1 和 P2， 预期扩增长度为 1434bp。上 海生工生物工程技术服务有限公司制备。 0068 NCBI GENEBANK 中找到基因序列后， 看选择的酶切位点， 在所要进行 PCR 的基因序 列中是否存在 ； 用 P

40、rimer primer5 把序列反向互补 ； 在应用 Oligo 6.0 引物设计时， 上下 游引物全长输入 ； 上游引物位点的确定为 ： 5 端模板第一个碱基前面的所有碱基 ( 包括酶 切位点 + 保护碱基 ) 的负数值 +1 下游引物位点的确定为 ： 下游引物 - 酶切位点 - 保护性碱 基 A， 序列全长 -A+1 下游引物位点。引物设计时候要考虑到序列的起始碱基和末尾碱 基中是否包含起始密码子 (ATG) 和终止密码子 (TAA)， 如果有， 要考虑是否需要删除或者保 留。引物长度的选择要考虑到 CG 比例， 酶切位点的选择要兼顾廉价， 常用， 而且要兼顾其加 入后引物的 GC 比例

41、变化 ； 还要考虑到酶切位点的序列是否在 PCR 的全序列中出现， 如果出 现要选择其它酶切位点。前面适当加碱基调节 GC 比例， 5 端照抄 ； 3 端反向互补 ； 保护性 碱基和酶切位点加在引物前面。自身互补， 二聚体 ( 两个引物之间 ) 6， 负数值越大能量 越大， 退火温度越高， 错配几率越小。 0069 上游引物 ： 0070 5 一 AAGAggatccAGAGTGAAACCCATG 一 3 ； 说 明 书 CN 102539770 A 10 7/13 页 11 0071 下游引物 ： 0072 5 一 GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT 一 3 。 0073

42、 为下一步克隆需要， 分别在上、 下游引物中引入 BamH 和 Xho 酶切位点 0074 2.2PCR 扩增 ： 0075 参照 TaKaRa 公司的 TaqTM PCR 试剂盒。PCR 反应条件为 95预变性 5min， 94变 性 1min， 53退火 1min， 72延伸 2min， 扩增 32 个循环。预期片段大小 1 600bp 左右。 0076 2.3 琼脂糖凝胶电泳 ： 0077 用 1.0琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物， 电压 100V， 电泳 30min。 0078 2.4PCR 产物回收 ： 0079 切下目的 DNA 片段， 用凝胶快速纯化回收试剂盒回收。 0080

43、2.5PCR 产物的克隆 ： 0081 将回收纯化的 PCR 产物与 pMD18-T 进行连接， 并 pMD18-T 载体 16过夜连接。 0082 2.6 制备感受态细胞 ： 0083 应用 CaCl2致敏法制备大肠杆菌感受态， 接种 JM109 菌种， 37， 225rpm 过夜振摇 培养后， 菌液在 LB 固体培养基上划线， 37孵箱过夜培养， 筛选单克隆。选一单菌落接种于 5mLLB 培养基中， 过夜培养， 培养物按 1/100 接种于 LB 培养基中， 培养至 A600达 0.45-0.55， 用 CaCl2致敏大肠杆菌。具体如下 ： 将菌液冰浴 10min 后， 4， 4000rp

44、m 离心 20min， 收集 菌体， 再加入冰冷的 0.1M CaCl2致敏液， 悬浮菌体， 冰浴 10min， 重新收集菌体后， 加冰冷的 0.1M CaCl2， 重悬菌体， 加甘油至终浓度为 15， 100L/ 管分装， -70保存， 用于转化。 0084 2.7 转化 ： 0085 应用热休克转化法， 将连接反应液加入 100L 感受状态的细胞中， 再加 3l DMSO 以增加转化效率， 冰浴 30min 后， 42休克 45s， 然后迅速冰浴 5min， 再将转化产物加 入 LB 液体培养基中复苏 30min 后， 离心收集菌体， 将其铺于含筛选抗生素的 LB 固体培养基 上， 37恒

45、温孵箱放置 12 16h 后观察转化效果。 0086 2.8 质粒 DNA SDS 裂解法纯化试剂盒制备质粒。 0087 2.9 鉴定 ： 0088 用 BamH 和 Xho 进行酶切鉴定及 PCR 鉴定， 筛选出阳性重组质粒， 命名为 pMD18-T-Hly。 0089 2.10pMD18-T-Hly 的序列测定 ： 0090 将阳性重组质粒 pMD18-T-Hly 送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行序 列测定， 并进行同源性比较。 0091 三 . 原核表达载体 pGEX-6P-Hly 的构建与重组蛋白的表达和检测 0092 3.1 亚克隆 ： 0093 用BamH 和Xho 进行亚

46、克隆， 表达载体pGEX-6P和重组克隆载体pGEX-6P-Hly 用 BamH 和 Xho 切处理， 琼脂糖凝胶电泳， 线性表达载体用 DNA 快速纯化回收试剂盒 回收， 亚克隆片段用挤胶法回收， 亚克隆载体与片段用 T4DNA 连接酶连接， 连接产物转化 JM109 感受态， 提取质粒， 鉴定阳性克隆。 0094 3.2 蛋白的诱导表达 0095 用 pGEX-6P-Hly 重组质粒转化 BL21 受体菌， 选择单克隆接种到 5mL LB 培养液里， 说 明 书 CN 102539770 A 11 8/13 页 12 按传统方式诱导表达， 即 37， 225rpm 振荡培养至 A600 达

47、 0.6-0.8， 加 IPTG 至 1mmol/L， 对 照组不加 IPTG， 3h 后收集细菌。同时接种诱导菌种， 提取质粒， BamH 和 Xho 酶切验证 确含目的片段后， 上海生工测序， 测序正确后进行重组蛋白的后续实验。 0096 3.3 重组蛋白的鉴定 0097 3.3.1SDS-PAGE 电泳 0098 将诱导后菌液 2mL 11000rpm 离心 2min， 弃上清， 收集菌体， 向菌体沉淀中加入 2SDS 凝胶加样缓冲液 200l， 煮沸 5min 后进行 SDS-PAGE 电泳， 操作过程如下 ： 0099 12的分离胶 15mL ： 水 4.9mL、 30丙烯酰胺 6.

48、0mL、 1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8)3.8mL、 10 SDS 150mL、 10过硫酸铵 150mL、 TEMED 6mL， 迅速灌注于两层玻璃板的 间隙， 在胶上小心覆盖一层蒸馏水， 凝胶垂直置于室温， 聚合完全后， 倒出覆盖的水， 用滤 纸将水吸净。制备 8mL 积层胶 ： 水 5.5mL、 30丙烯酰胺 1.3mL、 1.0mol/L Tris-HCl(pH 6.8)1.0mL、 10 SDS 80mL、 10过硫酸铵 80mL、 TEMED 8mL， 直接注于分离胶上层， 立即 在积层胶中插入干净的 Teflon 梳子， 小心避免形成气泡。积层胶聚合完全后， 小心移出 Teflon 梳子， 将凝胶固定于电泳装置上， 加入 Tris- 甘氨酸电泳缓冲液 (25mmol/L Tris， 250mmol/L 甘氨酸， 0.1 SDS)， 上电泳样品及蛋白质 Marker， 电压 200v 电泳 45min， 电泳结 束后凝胶加入考马斯亮蓝染色， 脱色液脱色后， 将凝胶浸泡于水中， 拍照记录。见图 2。 0100 3.3.2Western