一种对基因甲基化检测的方法.pdf

1、10申请公布号CN104131070A43申请公布日20141105CN104131070A21申请号201410215847122申请日20140522C12Q1/6820060171申请人苏州工业园区为真生物医药科技有限公司地址215000江苏省苏州市苏州工业园区星湖街218号生物纳米园C420172发明人王弢秦勇巴兆粉张丽74专利代理机构苏州广正知识产权代理有限公司32234代理人刘述生54发明名称一种对基因甲基化检测的方法57摘要本发明公开了一种对基因甲基化检测的方法，包括步骤为将待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照进行PCR扩增反应，其中PCR扩增反应中DNA样品是以亚

2、硫酸氢盐修饰的DNA、对检测基因和内参基因进行双重PCR扩增反应，通过对参数范围的判读，判断所述待测DNA样品的检测基因的甲基化情况。通过上述方式，本发明的对基因甲基化检测的方法具有特异性强、双重反应、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对结直肠癌等癌症早期检测有一定的辅助诊断作用。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图1页10申请公布号CN104131070ACN104131070A1/1页21一种对基因甲基化检测的方法，其特征在于，包括步骤为将待测DNA样品、阴

3、性质控品、阳性质控品和无模板对照进行PCR扩增反应，其中所述PCR扩增反应中的DNA样本是以亚硫酸氢盐修饰的DNA、对检测基因和内参基因进行双重PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系中包括3端进行了修饰化处理的BLOCK，通过对所述待测DNA样品、所述阴性质控品、所述阳性质控品和所述无模板对照的参数范围的判读，判断所述待测DNA样品的检测基因的甲基化情况。2根据权利要求1所述的对基因甲基化检测的方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类基因组DNA，所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。3根据权利要求2所述的对基因

4、甲基化检测的方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。4根据权利要求1所述的对基因甲基化检测的方法，其特征在于，所述检测基因为SEPTIN9基因或SEPTIN9甲基化基因，所述内参基因为GAPDH、ACTIN（ACTB）、B2M、SDHA、HPRT1中的一种或者多种。5根据权利要求4所述的对基因甲基化检测的方法，其特征在于，所述SEPTIN9甲基化位点为启动子区的CPG岛，序列为转录起始位点上游的670555BP区。6根据权利要求1所述的对基因甲基化检测的方法，其特征在于，所述

5、PCR扩增反应体系的终浓度组成为110PCR缓冲液、011MMDNTPS、011UMSEPTIN9引物序列、011UM内参基因引物序列、012UMBLOCK、0052NG/UL模板DNA、011UMSEPTIN9TAQMAN水解探针、011UM内参基因TAQMAN水解探针、001010U/ULTAQDNA聚合酶、15MM氯化镁。7根据权利要求1所述的对基因甲基化检测的方法，其特征在于，所述BLOCK为寡核苷酸，所述BLOCK的3端的修饰为磷酸化或者间臂SPACER3、SPACER6、SPACER18或者MGB处理中的一种或多种处理。8根据权利要求6所述的对基因甲基化检测的方法，其特征在于，所述

6、SEPTIN9和内参基因探针5端报告荧光基团为FAM、TET、HEX、TAMRA、TEXASRED、ROX、CY5中的一种或多种，所述SEPTIN9和内参基因探针3端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一种或多种，所述DNTPS中包括10MMDATP、10MMDCTP、10MMDTTP和10MMDGTP，所述PCR缓冲液中包含TRISCL、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。9根据权利要求1所述的对基因甲基化检测的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的具体过程为9297预变性535分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，9297变性1030S，5065退火1030S，并进行3555个循环。权利

7、要求书CN104131070A1/7页3一种对基因甲基化检测的方法技术领域0001本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种对基因甲基化检测的方法。背景技术0002DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素，这些变化包括CPG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。由于CPG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进一步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。甲基化可作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。000

8、3SEPTIN是一类广泛分布于除植物外所有真核生物中具有GTPASE活性的保守骨架蛋白基因家族，与细胞分裂有关。在人类中，SEPTIN由14个家族成员组成，分别命名为SEPTIN114，其中SEPTIN9定位于17Q253，含有17个外显子，能够编码SEPTIN9蛋白。SEPTIN9有多个亚型（如SEPTIN9VL、V2、V3、V4），且各亚型间具有结构相似性，由位于中央的PLOOPGTP结合域、可变的N端和C端结构域组成。SEPTIN9基因与染色体分离、DNA修复、迁移、凋亡等细胞功能有关。研究发现，在结直肠癌中，SEPTIN9V2启动子区的CPG岛高度甲基化。SEPTIN9甲基化与结直肠癌

9、的密切相关性已有大量的研究报道。例如2011年WARRENJD等人检测结直肠癌患者的血浆DNASEPTIN9的甲基化情况，在I、II期的灵敏度分别为71和90，III、IV期的灵敏度为100，在正常人群中的甲基化检测灵敏度仅为10。由此可见，检测SEPTIN9甲基化情况可以作为结直肠癌早期诊断一个较好的分子指标。0004目前检测甲基化的方法主要有以下几种（1）直接测序法（BISULTESEQUENCINGPCR、BSP）。直接测序法的原理是重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，PCR扩增后，尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序并且与

10、未经处理的序列比较，判断CPG位点是否发生甲基化。该实验方法首先需要进行引物设计（每个基因设计一对引物，引物位置尽可能的避开DNA中的CG位点），随后需要对目的条带进行切胶回收；回收后的PCR产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。但此方法实验过程长，需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，实验检测的费用高。0005（2）甲基化特异性PCR法（METHYLMIONSPECICPCR、MSP）。该方法为用重亚硫酸盐使胞嘧啶转化为尿嘧啶，进行引物设计（每个基因设计两对引物，分别为甲基化引物M、非基因化引物U，对应扩增甲基化和非甲基化的目的片段），有时需设计巢式引物；PCR扩增对甲基化和非

11、甲基化的目的片段分别进行扩增，此时应尽可能使用梯度PCR仪，同时使用不同的退火温度，以筛选到合适的退火温度；对PCR产物电泳。该方法检测时间相对较长，不能及时获得检测结果。0006（3）甲基化敏感性解链曲线分析法（MSHIGHRESOLUTIONMELTINGCURVE、说明书CN104131070A2/7页4MSHRM）。该方法利用经亚硫酸氢盐处理（修饰）后的甲基化DNA与非甲基化DNA之间的碱基差异，结合碱基变化会引起产物熔解温度变化及熔解曲线差异以及在反应结束后热变性熔解曲线图明显不同的原理，结合梯度甲基化标准品，可绘制标准梯度曲线。对比待检样品的热变性曲线在标准曲线中的区域，即可得出该

12、样品的甲基化水平区间。该方法需要不同甲基化程度的标准品，实验结果读取复杂繁琐。并且该方法用的荧光染料为饱和荧光染料，结果只能检测一个荧光信号通道，不能同时分析样本内参基因的扩增情况，不能推断硫化修饰的效果，容易出现重亚硫酸盐处理不完全的问题以及假阴性。0007（4）荧光法（METHYLIGHT）。荧光法是基于TAQMAN荧光实时定量技术的甲基化检测技术。其过程如下先用重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5端连接报告荧光，3端连接淬灭荧光，随后一般采用MSP引物进行实时定量PCR。METHYLIGHT法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后再进行电泳

13、、杂交等操作，减少了污染和操作误差。但该方法多为单重PCR检测，没有内参基因的扩增，不能确保模板DNA的硫化修饰质量。0008（5）甲基化敏感性限制性内切酶（METHYLATIONSENSITIVERESTRICTIONENDONUCLEASE，MSRE法）。这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HPAIIMSPI识别序列CCGG和SMAIXMAICCCGGG等。由于后者识别的碱基数相对较多，其碱基序列在体内出现的概率相对较低，所以以前者即HPAIIMSPI更常用。其中HPAII和MSPI均能识

14、别CCGG序列，然而当序列中的胞嘧啶发生甲基化时，HPAII不切割，利用HPAIIMSPI的这种属性处理DNA，随后进行SOUTHERN或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态。这是一种经典的甲基化研究方法，其优点是相对简单,成本低廉，甲基化位点明确,实验结果易解释；缺点是1由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略；2只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时,该检测方法的结果才有意义；3相对而言，SOUTHERN方法较复杂，且需要样本的量大；4存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题；5不适用于混合样本。发明内容0009本发明主要解决的技术问题是提供一种对基因甲基化检测的方法

15、，该检测方法特异性强且灵敏度高。0010为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是提供一种对基因甲基化检测的方法，包括步骤为将待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照进行PCR扩增反应，其中所述PCR扩增反应中DNA样本以亚硫酸氢盐修饰的DNA、对检测基因和内参基因进行双重PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系中包括3端进行了修饰处理的BLOCK，通过对所述待测DNA样品、所述阴性质控品、所述阳性质控品和所述无模板对照的参数范围的判读，判断所述待测DNA样品的检测基因的甲基化情况。0011在本发明一个较佳实施例中，所述待测DNA样品为人类基因组DNA，所述阳性质控品为亚硫酸氢盐

16、修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。0012在本发明一个较佳实施例中，所述待测DNA样品为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组说明书CN104131070A3/7页5织基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。0013在本发明一个较佳实施例中，所述检测基因为SEPTIN9基因或SEPTIN9甲基化基因，所述内参基因为GAPDH、ACTIN（ACTB）、B2M、SDHA、HPRT1中的一种或者多种。0014在本发明一个较佳实施例中，所述SEPTIN9甲基化位点为启动子区的CPG岛，序列为转录起始位点上

17、游的670555BP区。0015在本发明一个较佳实施例中，所述PCR扩增反应体系的终浓度组成为110PCR缓冲液、011MMDNTPS、011UMSEPTIN9引物序列、011UM内参基因引物序列、012UMBLOCK、0052NG/UL模板DNA、011UMSEPTIN9TAQMAN水解探针、011UM内参基因TAQMAN水解探针、001010U/ULTAQDNA聚合酶、15MM氯化镁。0016在本发明一个较佳实施例中，所述BLOCK为寡核苷酸，所述BLOCK的3端的修饰为磷酸化或者间臂SPACER3、SPACER6、SPACER18或者MGB处理中的一种或多种处理。0017在本发明一个较佳

18、实施例中，所述SEPTIN9和内参基因探针5端报告荧光基团为FAM、TET、HEX、TAMRA、TEXASRED、ROX、CY5中的一种或多种，所述SEPTIN9和内参基因探针3端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一种或多种，所述DNTPS中包括10MMDATP、10MMDCTP、10MMDTTP和10MMDGTP，所述PCR缓冲液中包含TRISCL、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。0018在本发明一个较佳实施例中，所述PCR扩增反应的具体过程为9297预变性535分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，9297变性1030S，5065退火1030S，并进行3555个循环。0019本发明

19、的有益效果是本发明的对基因甲基化检测的方法，该方法具有特异性强、双重反应、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对结直肠癌等癌症早期检测有一定的辅助诊断作用。附图说明0020为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中图1是本发明的对基因甲基化检测方法一较佳实施例中检测甲基化模板和非甲基化模板的示意图；图2是本发明的对基因甲基化检测方法一较佳实施例中SEPT

20、IN9甲基化检测扩增曲线图。具体实施方式0021下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。0022材料待检血浆样本、阳性质控品、阴性质控品。说明书CN104131070A4/7页60023仪器LIGHTCYCLER480、NANODROP1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。0024试剂DNA聚合酶（罗氏公司）、10PCRBUFFER（罗氏公司）、MGCL2（罗氏公司）、DNTP（

21、TAKARA）、纯化水。0025引物所有引物纯度应达到电泳级（PAGE）或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10NG/L备用。0026SEPTIN9的引物、BLOCK和探针序列如下内参基因的引物和探针序列如下说明书CN104131070A5/7页7（1）PCR反应的体系和反应条件所述PCR扩增反应体系的终浓度组成为110PCR缓冲液、011MMDNTPS、011MSEPTIN9引物序列、011M内参基因引物序列、012MBLOCK、0052NG/L模

22、板DNA、011MSEPTIN9TAQMAN水解探针、011M内参基因TAQMAN水解探针、001010U/LTAQDNA聚合酶、15MM氯化镁。0027所述BLOCK是指一种寡核苷酸，其3端做过以下修饰磷酸化或者间臂SPACER3、SPACER6、SPACER18或者MGB处理中的一种或多种处理，在PCR反应过程中，没有引物延伸扩增的功能。BLOCK以硫化修饰后的非甲基化DNA为模板，进行设计序列和合成。BLOCK和模板的特异结合的部位覆盖了探针的结合部位，当非甲基化DNA存在时，BLOCK与之结合，提高了探针和甲基化DNA结合的特异性。0028所述检测基因为SEPTIN9基因、SEPTIN

23、9甲基化基因，所述内参基因为GAPDH、ACTIN（ACTB）、B2M、SDHA、HPRT1中的一种或者多种。所述SEPTIN9和内参基因探针5端报告荧光基团为FAM、TET、HEX、TAMRA、TEXASRED、ROX、CY5中的一种或多种，所述SEPTIN9和内参基因探针3端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一种或多种。0029请参阅图1，所述DNTPS中包括10MMDATP、10MMDCTP、10MMDTTP和10MMDGTP，说明书CN104131070A6/7页8所述PCR缓冲液中包含TRISCL、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。引物序列中不含有CPG位点，探针序列为

24、甲基化序列，BLOCK序列为非甲基化序列。0030所述PCR扩增反应的具体过程为9297预变性535分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，9297变性1030S，5065退火1030S，并进行3555个循环。0031（2）PCR反应的加样布局待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3个复孔检测，PCR仪96孔板加样布局见下表。表中PC代表阳性质控品（POSITIVECONTROL），NC代表阴性质控品（NEGATIVECONTROL），NTC代表无模板对照（NOTEMPLATECONTROL），S代表检测样本（SAMPLE）。0032（3）请参阅图2，实验结束以后，按以下步骤进行

25、检测结果的分析、判定1、进行无模板对照（NTC）的扩增曲线分析，SEPTIN9和内参基因（最优选ACTB）此时应无扩增曲线明显扩增信号，说明实验无污染，可以继续分析。00332、质控品的内参基因（ACTB）应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，质控品内参基因（ACTB）的CP值应符合下表中参数范围；阴性质控品的SEPTIN9应无明显扩增曲线变化，阳性质控品SEPTIN9的CP值应符合下表中质控品的参数范围。质控品检测满足以上条件时，证明实验有效，可继续分析。00343、样本的内参基因（ACTB）应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，样本单个PCR检测结果应按照下表样本检测单个PCR结果判读。00354

26、、样本的3个平行的检测结果应按照下表样本检测3个平行PCR进行综合判读。说明书CN104131070A7/7页900365、不符合1、2项要求，建议重新检测；不符合3项中样本的要求，建议重新提取DNA，重新硫化修饰，再次检测。0037在以上实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，例如按照分子克隆实验指南（第三版，J萨姆布鲁克等著）中所述的条件或制造厂商所建议的条件进行操作。0038本发明中的对基因甲基化检测方法的优点有（1）特异性强加入能与野生型特异性结合的BLOCK；（2）双重反应内参基因可检测对模板的硫化修饰效果，对有效浓度进行评估和监测；（3）灵敏度高，能在（90）非甲基化DN

27、A存在的背景下检测到目的基因的甲基化；（4）检测过程为闭管反应，减少污染的可能性。操作简单快速，整个PCR反应过程只有90分钟。而直接测序法则需要2天的时间，且为开管操作，大大增加污染的可能性；（5）结果判读明确客观，只需根据扩增数据即可完成对样本基因类型的判读；（6）安全，整个体系不包含有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。0039以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。说明书CN104131070A1/1页10图1图2说明书附图CN104131070A10